მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მომზადება მიტოქონდრიული დიაგნოსტიკისთვის
მიტოქონდრიული დიაგნოსტიკა კვლევებსა და კლინიკებში ტარდება სხვადასხვა ტექნიკის გამოყენებით, როგორიცაა თანმიმდევრობა, PCR და ბიოქიმიური ანალიზი. ეს მეთოდები გამოიყენება დნმ-ის მუტაციების იდენტიფიცირებისთვის და მიტოქონდრიის ფუნქციის გასაზომად. თანმიმდევრობა გენეტიკური მუტაციების გამოვლენაში გვეხმარება, ხოლო PCR-ს შეუძლია დნმ-ის კონკრეტული თანმიმდევრობების რაოდენობრივი განსაზღვრა. ბიოქიმიური ანალიზი აფასებს მიტოქონდრიული ცილების და ფერმენტების ფუნქციონირებას.
მიტოქონდრიული დაავადებების დიაგნოსტიკა განსაკუთრებით რთულია ამ დაავადებების გამოხატული კლინიკური ცვალებადობის გამო, აგრეთვე ორ განსხვავებულად მემკვიდრეობით გენომს შორის: მიტოქონდრიულ დნმ-სა (mtDNA) და ბირთვულ გენომს შორის რთული ურთიერთქმედების გამო.
დნმ-ის ექსტრაქცია და ფრაგმენტაცია Sonication-ის გამოყენებით
კუნთოვანი ქსოვილიდან დნმ-ის ექსტრაქცია განსაკუთრებით სასარგებლოა, როდესაც არსებობს ეჭვი mtDNA-ში ქსოვილის სპეციფიკურ ცვლილებებზე. ეს ცვლილებები შეიძლება მოიცავდეს mtDNA-ს წაშლას ქრონიკული პროგრესირებადი გარეგანი ოფთალმოპლეგიის დროს (CPEO), mtDNA-ს წერტილოვანი მუტაციები მიტოქონდრიულ მიოპათიებში ან mtDNA-ს დაქვეითება ალპერსის სინდრომში. კუნთოვანი ქსოვილიდან ამოღებული დნმ შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვადასხვა გენეტიკური ტესტებისთვის, როგორიცაა Southern blot და გრძელვადიანი PCR დელეციებისთვის, რეალურ დროში PCR დაღლილობისთვის ან წერტილოვანი მუტაციების თანმიმდევრობის დასადგენად.
Sonication, ინტენსიური ულტრაბგერითი ტალღების გამოყენებით, გამოიყენება რამდენიმე აპლიკაციისთვის მიტოქონდრიულ დიაგნოსტიკაში. იგი გამოიყენება უჯრედების ლიზისთვის, რათა ამოიღონ უჯრედშიდა შიგთავსი, როგორიცაა მიტოქონდრია და დნმ, დნმ-ის, როგორიცაა mtDNA და nDNA, თანმიმდევრობისთვის, და ნიმუშების ჰომოგენიზაციისთვის.
UIP400MTP Plate Sonicator მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მოსამზადებლად ერთგვაროვნად ახდენს ნიმუშების გაჟღერებას მრავალ ჭაბურღილის და 96 ჭაბურღილის ფირფიტებში
როგორ გამოვყოთ მიტოქონდრია უჯრედებიდან და ქსოვილებიდან
მიტოქონდრიული იზოლაცია მოიცავს ორ არსებით საფეხურს: უჯრედების მოშლა მათი შიგთავსის გასათავისუფლებლად და დიფერენციალური ცენტრიფუგაციის გამოყენება მიტოქონდრიული ფრაქციების გამოყოფისა და აღდგენისთვის.
გაჟონვა
Hielscher sonicators თავსებადია სტანდარტული ლიზის ბუფერებთან და კომპლექტებთან, რაც მათ შესაფერისს ხდის მიტოქონდრიის იზოლაციისთვის. Sonication ემსახურება ორ ძირითად მიზანს:
- უჯრედის ლიზისი: ულტრაბგერითი ტალღები არღვევს უჯრედის მემბრანას, ათავისუფლებს უჯრედშიდა შიგთავსს.
- მიტოქონდრიის დარღვევა: შემდეგ ეტაპზე გაჟღენთვას შეუძლია მიტოქონდრიის გახსნა მიტოქონდრიული ცილების ან მიტოქონდრიული დნმ-ის გასათავისუფლებლად.
- mtDNA ფრაგმენტაცია: Sonication არის საიმედო ტექნიკა მიტოქონდრიული დნმ-ის გაკვეთისთვის თანმიმდევრობისთვის.
მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP იძლევა მიტოქონდრიული ნიმუშების ნიმუშების მაღალი გამტარუნარიანობის მომზადების საშუალებას. დიფერენციალურ ცენტრიფუგირებასთან ერთად, სონიკა აძლიერებს მიტოქონდრიული იზოლაციის ეფექტურობას, რაც უზრუნველყოფს ხელუხლებელი მიტოქონდრიის მაღალ მოსავლიანობას, რომელიც შესაფერისია სხვადასხვა ქვედა დინების გამოყენებისთვის.
Hielscher UIP400MTP მულტიბელური ფირფიტის სონიკატორი მუშაობს ნებისმიერი სტანდარტული ფირფიტით
მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP გთავაზობთ უამრავ სარგებელს მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მომზადებისთვის, მაგ., მიტოქონდრიული დიაგნოსტიკაში.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator მაღალი წარმადობის ნიმუშის მოსამზადებლად ბიომარკერების დიაგნოსტიკაში.
სამაგალითო ინსტრუქციები ულტრაბგერითი mtDNA ფრაგმენტაციისთვის
მომზადება და მოპოვება:
- C57BL/6 თაგვები მოკლეს საშვილოსნოს ყელის დისლოკაციით.
- ღვიძლი სწრაფად იქნა ამოღებული და გარეცხილი ყინულით სტერილურ PBS-ში.
მიტოქონდრიის იზოლაცია:
- მიტოქონდრია იზოლირებული იყო 2 მლ Dounce ქსოვილის საფქვავი და მიტოქონდრიის საიზოლაციო ნაკრები ქსოვილისთვის.
- საწყისი ცენტრიფუგაცია 700×გრ და 3000×გრ-ზე.
- შეასრულეთ რეცხვის ორი დამატებითი ეტაპი ბუფერი C-ით.
დნმ-ის იზოლაცია:
- გრანულები პირველი ცენტრიფუგიდან 700 × გ-ზე გამოიყენეს ბირთვული დნმ-ის (nDNA) იზოლირებისთვის.
- დნმ იზოლირებული იყო სპინის სვეტების გამოყენებით.
- მიტოქონდრიული დნმ (mtDNA) ამოღებულია იზოლირებული მიტოქონდრიიდან.
- ბირთვული დნმ (nDNA) ამოღებულია ნედლი ბირთვული ექსტრაქტებიდან, ორივე თაგვის ღვიძლის ქსოვილიდან.
დნმ ფრაგმენტაცია:
- დნმ ფრაგმენტირებული იყო ყინულზე 30-kHz/50-W ულტრაბგერითი ბგერითი აპარატის UP50H გამოყენებით 0.5 მმ მიკრო-წვერის სონოტროდით 14 მკმ-ზე 2 × 30 წამის განმავლობაში.
ფრაგმენტაციის ვიზუალიზაცია და რაოდენობრივი განსაზღვრა:
- ფრაგმენტაცია ულტრაბგერითი გამოკვლევის შემდეგ ვიზუალური იყო 1% აგაროზის გელზე SYBR უსაფრთხო დნმ საღებავით.
- mtDNA და nDNA-ს ფარდობითი სიმრავლე განისაზღვრა qPCR-ით.
(შდრ. Mariero et al., 2019)
მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მომზადებისთვის, მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP ხელს უწყობს ნიმუშების დიდი რაოდენობით მომზადებას სტანდარტული 96 ჭაბურღილების, მრავალ ჭაბურღილების და მიკროტიტრულ ფირფიტებში.
წაიკითხეთ მეტი მაღალი წარმადობის ნიმუშის მომზადების უპირატესობების შესახებ UIP400MTP-ის გამოყენებით!
რჩევები მიტოქონდრიის ოპტიმალური იზოლაციისთვის სონიკაციის გამოყენებით:
- Ტემპერატურის კონტროლი: განახორციელეთ ყველა ნაბიჯი 0°C-დან 4°C-მდე ტემპერატურის დიაპაზონში. ეს გადამწყვეტია მიტოქონდრიის მთლიანობისა და ფუნქციონირების შესანარჩუნებლად.
- ეფექტურობა და სიჩქარე: იმუშავეთ სწრაფად და გაასუფთავეთ მიტოქონდრია მხოლოდ იმ ზომით, რაც საჭიროა თქვენი კონკრეტული გამოყენებისთვის. გადაჭარბებულმა მანიპულირებამ შეიძლება გამოიწვიოს მიტოქონდრიული შინაარსის მნიშვნელოვანი დანაკარგი.
- სუსპენზიების განზავება: შეინარჩუნეთ უჯრედებისა და ორგანელების სუსპენზიების დაბალი კონცენტრაცია იზოლაციის პროცესში. ეს ხელს უწყობს ხაფანგისა და აგლუტინაციის რისკების შემცირებას, რითაც აუმჯობესებს იზოლირებული მიტოქონდრიების სისუფთავეს.
- ნიმუშის მოცულობა: აირჩიეთ რამდენიმე მცირე ზომის პრეპარატი, ვიდრე ერთი დიდი. ეს მიდგომა, როგორც წესი, იძლევა უკეთეს მოსავალს, რადგან სკალირების გაზრდა პროპორციულად არ ზრდის აღდგენილი მიტოქონდრიების რაოდენობას. მრავალ ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP ხელს უწყობს უჯრედის სწრაფ და საიმედო ლიზას მიტოქონდრიის იზოლაციისთვის, ასევე ცილების ამოღებას მიტოქონდრიიდან.
ეს გაიდლაინები გახდის იზოლაციის პროცესს ულტრაბგერითი ლიზისა და ცენტრიფუგაციის გამოყენებით უფრო ეფექტურს, რაც უზრუნველყოფს მაღალი ხარისხის მიტოქონდრიულ პრეპარატებს, რომლებიც შესაფერისია ქვედა დინების გამოყენებისთვის.
Hielscher Sonicators – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში
Hielscher ულტრაბგერითები ცნობილია მათი უმაღლესი ხარისხისა და დიზაინის სტანდარტებით. გამძლეობა და მარტივი მუშაობა საშუალებას იძლევა ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების გლუვი ინტეგრაცია სამრეწველო ობიექტებში. უხეში პირობები და მომთხოვნი გარემო ადვილად უმკლავდება Hielscher ულტრაბგერითებს.
Hielscher Ultrasonics არის ISO სერთიფიცირებული კომპანია და განსაკუთრებული აქცენტი კეთდება მაღალი ხარისხის ულტრაბგერაზე, რომელიც აღჭურვილია უახლესი ტექნოლოგიით და მომხმარებლის კეთილგანწყობით. რა თქმა უნდა, Hielscher ულტრაბგერითები შეესაბამება CE და აკმაყოფილებს UL, CSA და RoHs მოთხოვნებს.
96 ჭაბურღილის ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP მიკროტიტრული და მულტიბელური ფირფიტების გახმოვანებისთვის
ლიტერატურა / ლიტერატურა
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
ხშირად დასმული კითხვები მიტოქონდრიისა და მიტოქონდრიის დიაგნოსტიკის შესახებ
რა არის მიტოქონდრია?
მიტოქონდრია მემბრანასთან დაკავშირებული ორგანელებია, რომლებიც გვხვდება ევკარიოტული ორგანიზმების უმეტესობის უჯრედებში. ისინი ცნობილია როგორც უჯრედის ელექტროსადგურები, რადგან ისინი აწარმოებენ ენერგიას ადენოზინტრიფოსფატის (ATP) სახით უჯრედული სუნთქვის პროცესის მეშვეობით. გარდა ამისა, მიტოქონდრიებს აქვთ საკუთარი დნმ და თამაშობენ მთავარ როლს სხვა უჯრედულ პროცესებში, მათ შორის უჯრედული ციკლის რეგულირებასა და უჯრედის სიკვდილში.
რა განასხვავებს mtDNA-ს გენომიური დნმ-ისგან?
მიტოქონდრიული დნმ (mtDNA) განსხვავდება გენომიური დნმ-ისგან (gDNA) რამდენიმე ძირითადი გზით. MtDNA განლაგებულია მიტოქონდრიაში, არის წრიული და არის დედობრივი მემკვიდრეობითი, ხოლო gDNA მდებარეობს უჯრედის ბირთვში, არის ხაზოვანი და მემკვიდრეობით მიიღება ორივე მშობლისგან. MtDNA გაცილებით მცირეა და მხოლოდ 37 გენს აკოდირებს, ხოლო gDNA შეიცავს დაახლოებით 20,000-25,000 გენს. MtDNA წარმოდგენილია თითო უჯრედზე მრავალ ეგზემპლარად, აქვს მუტაციის უფრო მაღალი მაჩვენებელი და, პირველ რიგში, კოდირებს მიტოქონდრიულ ფუნქციაში ჩართულ ცილებს. ამის საპირისპიროდ, gDNA, როგორც წესი, დიპლოიდურია, აქვს მუტაციის დაბალი მაჩვენებელი და აკოდირებს გენების ფართო სპექტრს, რომლებიც აუცილებელია ორგანიზმის განვითარებისა და ფუნქციონირებისთვის. გარდა ამისა, mtDNA ტრანსკრიფცია და ტრანსლაცია ხდება მიტოქონდრიაში, ხოლო gDNA ტრანსკრიფცია ხდება ბირთვში და ტრანსლაცია ხდება ციტოპლაზმაში. ეს განსხვავებები ასახავს მათ განსხვავებულ როლებს და ევოლუციურ საწყისებს.
რა არის უჯრედების გარეშე ექსტრაქტი?
უჯრედებისგან თავისუფალი ექსტრაქტი არის ხსნარი, რომელიც შეიცავს ლიზირებული უჯრედების შიგთავსს, მათ შორის ცილებს, ნუკლეინის მჟავებს და სხვა უჯრედულ კომპონენტებს, მაგრამ ხელუხლებელი უჯრედის მემბრანების გარეშე. ეს ექსტრაქტი გამოიყენება ბიოქიმიური და მოლეკულური ბიოლოგიის კვლევებში უჯრედული პროცესების in vitro შესასწავლად, რაც მკვლევარებს საშუალებას აძლევს გააანალიზონ რეაქციები და მექანიზმები ცოცხალი უჯრედების გარეთ.
რა როლი თამაშობს PCR ტესტებს მიტოქონდრიულ დიაგნოსტიკაში?
PCR ტესტები გადამწყვეტ როლს თამაშობს მიტოქონდრიულ დიაგნოზში მუტაციების, წაშლის ან ასლების რაოდენობის ვარიაციების გამოვლენის საშუალებას მიტოქონდრიულ დნმ-ში (mtDNA). ისინი საშუალებას იძლევა გაძლიერდეს mtDNA-ს სპეციფიკური რეგიონები მიტოქონდრიულ დარღვევებთან დაკავშირებული პათოგენური ვარიანტების იდენტიფიცირებისთვის. PCR-ზე დაფუძნებული ტექნიკა, როგორიცაა რაოდენობრივი PCR (qPCR) და გრძელვადიანი PCR, ასევე გამოიყენება mtDNA მთლიანობის, ჰეტეროპლაზმის დონისა და mtDNA-ს დაქვეითების შესაფასებლად, რაც უზრუნველყოფს აუცილებელ ინფორმაციას მიტოქონდრიის ფუნქციისა და დაავადების შესახებ.
შეიტყვეთ, თუ როგორ აადვილებს UIP400MTP Microplate Sonicator PCR ტესტებსა და ანალიზებს!
რა არის დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია?
დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია არის ფართოდ გამოყენებული ტექნიკა უჯრედების ფრაქციებისა და მიტოქონდრიული იზოლაციისთვის. ეს მეთოდი გამოყოფს უჯრედულ სტრუქტურებს მათი დალექვის კოეფიციენტის მიხედვით, რაც დამოკიდებულია როგორც სიმკვრივეზე, ასევე ფორმაზე. პროცესი მოიცავს ცენტრიდანული ძალის სხვადასხვა დონის გამოყენებას ნიმუშებზე ბუფერულ მარილის ხსნარებში სპეციფიკური სიმკვრივით. დანალექების მსგავსი კოეფიციენტების მქონე სტრუქტურები ერთდროულად დასახლდება შეგროვების მილის ქვედა ნაწილში, რაც საშუალებას მისცემს მათ აღდგენას.
როგორ გამოიყენება დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია მიტოქონდრიის იზოლაციისთვის?
დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია მკვლევარებს საშუალებას აძლევს ეფექტურად გამოყოს მიტოქონდრიული ფრაქციები სხვა უჯრედული კომპონენტებისგან. მიტოქონდრიის იზოლაცია მოიცავს რამდენიმე ცენტრიფუგაციის საფეხურს და იზოლატის შემდგომ აღდგენას.
საწყისი ცენტრიფუგაცია: გამოიყენეთ დაბალი ცენტრიდანული ძალა დიდი უჯრედული ნამსხვრევებისა და ბირთვების დასალექად.
შემდგომი ცენტრიფუგაციები: გაზარდეთ ცენტრიდანული ძალა ეტაპობრივად მიტოქონდრიებით გამდიდრებულ გრანულების ფრაქციებამდე. ცენტრიფუგაციის ყოველი საფეხური შლის სტრუქტურებს თანდათანობით უფრო მაღალი დანალექის კოეფიციენტებით.
ფრაქციების აღდგენა: ყოველი ცენტრიფუგაციის შემდეგ გრანულები გროვდება და ზენატანი ექვემდებარება უფრო მაღალ g-ძალებს შემდეგი ფრაქციის იზოლირებისთვის. ეს მეორდება მანამ, სანამ მიტოქონდრიის სასურველი სისუფთავე მიიღწევა.