მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მომზადება მიტოქონდრიული დიაგნოსტიკისთვის
მიტოქონდრიული დიაგნოსტიკა კვლევებსა და კლინიკებში ტარდება სხვადასხვა მეთოდის გამოყენებით, როგორიცაა სექვენირება, PCR და ბიოქიმიური ანალიზი. ეს მეთოდები გამოიყენება დნმ-ის მუტაციების იდენტიფიცირებისთვის და მიტოქონდრიის ფუნქციის გასაზომად. სექვენირება გენეტიკური მუტაციების გამოვლენაში გვეხმარება, ხოლო PCR-ს შეუძლია დნმ-ის კონკრეტული თანმიმდევრობების რაოდენობრივი განსაზღვრა. ბიოქიმიური ანალიზი აფასებს მიტოქონდრიული ცილებისა და ფერმენტების ფუნქციონირებას.
მიტოქონდრიული დაავადებების დიაგნოსტიკა განსაკუთრებით რთულია ამ დაავადებების გამოხატული კლინიკური ცვალებადობის, აგრეთვე მემკვიდრეობით განსხვავებულად გადაცემულ ორ გენომს – მიტოქონდრიულ დნმ-სა (mtDNA) და ბირთვულ გენომს – შორის რთული ურთიერთქმედების გამო.
დნმ-ის ექსტრაქცია და ფრაგმენტაცია სონიკაციის გამოყენებით
კუნთოვანი ქსოვილიდან დნმ-ის ექსტრაქცია განსაკუთრებით სასარგებლოა, როდესაც არსებობს ეჭვი mtDNA-ში ქსოვილის სპეციფიკურ ცვლილებებზე. ეს ცვლილებები შეიძლება მოიცავდეს mtDNA-ს დელეციებს ქრონიკული პროგრესირებადი გარეგანი ოფთალმოპლეგიის (CPEO) დროს, mtDNA-ს წერტილოვან მუტაციებს მიტოქონდრიულ მიოპათიებში ან mtDNA-ს დეპლეციას ალპერსის სინდრომში. კუნთოვანი ქსოვილიდან ამოღებული დნმ შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვადასხვა გენეტიკური ტესტებისთვის, როგორიცაა Southern blot და გრძელი ფრაგმენტების PCR დელეციებისთვის, რეალურ დროში PCR დეპლეციისთვის ან სექვენირება წერტილოვანი მუტაციებისთვის.
სონიკაცია, რომელიც ინტენსიურ ულტრაბგერით ტალღებს იყენებს, მიტოქონდრიულ დიაგნოსტიკაში რამდენიმე მიზნით გამოიყენება. იგი გამოიყენება უჯრედების ლიზისისთვის უჯრედშიდა შიგთავსის, როგორიცაა მიტოქონდრია და დნმ, გამოსაყოფად, დნმ-ის, მათ შორის mtDNA-სა და nDNA-ს, ფრაგმენტაციისთვის სექვენირების მიზნით და ნიმუშების ჰომოგენიზაციისთვის.
UIP400MTP Plate Sonicator მაღალი გამტარუნარიანობის ნიმუშის მოსამზადებლად თანაბრად ამუშავებს ულტრაბგერით ნიმუშებს მრავალფოსოიან და 96-ფოსოიან ფირფიტებში
როგორ გამოვყოთ მიტოქონდრია უჯრედებიდან და ქსოვილებიდან
მიტოქონდრიების იზოლაცია მოიცავს ორ არსებით საფეხურს: უჯრედების დაშლას მათი შიგთავსის გასათავისუფლებლად და დიფერენციალური ცენტრიფუგაციის გამოყენებას მიტოქონდრიული ფრაქციების გამოსაყოფად და შესაგროვებლად.
სონიკაცია
Hielscher-ის სონიკატორები თავსებადია სტანდარტულ ლიზისის ბუფერებთან და ნაკრებებთან, რაც მათ შესაფერისს ხდის მიტოქონდრიების იზოლაციისთვის. სონიკაცია ორ ძირითად მიზანს ემსახურება:
- უჯრედის ლიზისი: ულტრაბგერითი ტალღები არღვევს უჯრედის მემბრანას, ათავისუფლებს უჯრედშიდა შიგთავსს.
- მიტოქონდრიების დაშლა: შემდგომ ეტაპზე სონიკაციას შეუძლია მიტოქონდრიის გახსნა მიტოქონდრიული ცილების ან მიტოქონდრიული დნმ-ის გასათავისუფლებლად.
- mtDNA ფრაგმენტაცია: სონიკაცია საიმედო მეთოდია მიტოქონდრიული დნმ-ის ფრაგმენტაციისთვის სექვენირების მიზნით.
მრავალფოსოიანი ფირფიტების სონიკატორი UIP400MTP მიტოქონდრიული ნიმუშების მაღალი წარმადობით მომზადების საშუალებას იძლევა. დიფერენციალურ ცენტრიფუგაციასთან ერთად სონიკაცია ზრდის მიტოქონდრიების იზოლაციის ეფექტურობას და უზრუნველყოფს დაუზიანებელი მიტოქონდრიების მაღალ გამოსავლიანობას სხვადასხვა შემდგომი გამოყენებისთვის.
Hielscher UIP400MTP მრავალფოსოიანი ფირფიტების სონიკატორი მუშაობს ნებისმიერი სტანდარტული ფირფიტით
მრავალფოსოიანი ფირფიტების სონიკატორი UIP400MTP მრავალ უპირატესობას გთავაზობთ ნიმუშების მაღალი წარმადობით მომზადებისთვის, მაგალითად, მიტოქონდრიულ დიაგნოსტიკაში.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator მაღალი წარმადობის ნიმუშის მოსამზადებლად ბიომარკერების დიაგნოსტიკაში.
სამაგალითო ინსტრუქციები ულტრაბგერითი mtDNA ფრაგმენტაციისთვის
მომზადება და მოპოვება:
- C57BL/6 თაგვები მოკლეს კისრის მალების დისლოკაციით.
- ღვიძლი სწრაფად იქნა ამოღებული და გარეცხილი ყინულივით ცივ სტერილურ PBS-ში.
მიტოქონდრიის იზოლაცია:
- მიტოქონდრიები გამოყვეს 2-მლ მოცულობის Dounce-ის ქსოვილის ჰომოგენიზატორისა და ქსოვილიდან მიტოქონდრიების გამოსაყოფი ნაკრების გამოყენებით.
- საწყისი ცენტრიფუგაცია 700× g-სა და 3,000× g-ზე.
- შეასრულეთ რეცხვის ორი დამატებითი ეტაპი ბუფერი C-ით.
დნმ-ის იზოლაცია:
- 700× g-ზე პირველი ცენტრიფუგაციის შედეგად მიღებული ნალექი გამოიყენეს ბირთვული დნმ-ის (nDNA) გამოსაყოფად.
- დნმ გამოყვეს ცენტრიფუგული სვეტების გამოყენებით.
- მიტოქონდრიული დნმ (mtDNA) ამოღებულია იზოლირებული მიტოქონდრიიდან.
- ბირთვული დნმ (nDNA) გამოყვეს ნედლი ბირთვული ექსტრაქტებიდან; ორივე ტიპის დნმ თაგვის ღვიძლის ქსოვილიდან იყო მიღებული.
დნმ ფრაგმენტაცია:
- დნმ ფრაგმენტირებული იყო ყინულზე 30-kHz/50-W ულტრაბგერითი სონიკატორით UP50H 0.5 მმ მიკრო-წვერის სონოტროდით 14 μm-ზე 2 × 30 წამის განმავლობაში.
ფრაგმენტაციის ვიზუალიზაცია და რაოდენობრივი განსაზღვრა:
- ფრაგმენტაცია ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ ვიზუალიზებული იყო 1% აგაროზის გელზე SYBR Safe დნმ საღებავით.
- mtDNA და nDNA-ს ფარდობითი სიმრავლე განისაზღვრა qPCR-ით.
(შდრ. Mariero et al., 2019)
ნიმუშების მაღალი წარმადობით მოსამზადებლად მრავალფოსოიანი ფირფიტების სონიკატორი UIP400MTP აადვილებს დიდი რაოდენობით ნიმუშების მომზადებას სტანდარტულ 96-ფოსოიან, მრავალფოსოიან და მიკროტიტრულ ფირფიტებში.
წაიკითხეთ მეტი მაღალი წარმადობის ნიმუშის მომზადების უპირატესობების შესახებ UIP400MTP-ის გამოყენებით!
რჩევები მიტოქონდრიის ოპტიმალური იზოლაციისთვის სონიკაციის გამოყენებით:
- Ტემპერატურის კონტროლი: განახორციელეთ ყველა ნაბიჯი 0°C-დან 4°C-მდე ტემპერატურის დიაპაზონში. ეს გადამწყვეტია მიტოქონდრიის მთლიანობისა და ფუნქციონირების შესანარჩუნებლად.
- ეფექტურობა და სიჩქარე: იმუშავეთ სწრაფად და გაასუფთავეთ მიტოქონდრიები მხოლოდ იმ ხარისხით, რომელიც თქვენი კონკრეტული გამოყენებისთვის არის საჭირო. გადაჭარბებულმა მანიპულირებამ შეიძლება გამოიწვიოს მიტოქონდრიული შიგთავსის მნიშვნელოვანი დანაკარგი.
- სუსპენზიების განზავება: შეინარჩუნეთ უჯრედებისა და ორგანელების სუსპენზიების დაბალი კონცენტრაცია იზოლაციის პროცესში. ეს ხელს უწყობს ჩაჭერისა და აგლუტინაციის რისკების შემცირებას, რითაც აუმჯობესებს იზოლირებული მიტოქონდრიების სისუფთავეს.
- ნიმუშის მოცულობა: ერთი დიდი მოცულობის მომზადების ნაცვლად ნიმუშები რამდენჯერმე, მცირე მოცულობებით მოამზადეთ. ეს მიდგომა, როგორც წესი, უკეთეს გამოსავლიანობას იძლევა, რადგან მასშტაბის გაზრდა პროპორციულად არ ზრდის გამოსაყოფი მიტოქონდრიების რაოდენობას. მრავალფოსოიანი ფირფიტების სონიკატორი UIP400MTP ხელს უწყობს უჯრედების სწრაფ და საიმედო ლიზისს მიტოქონდრიების გამოსაყოფად, ასევე მიტოქონდრიებიდან ცილების ექსტრაქციას.
ეს გაიდლაინები გახდის იზოლაციის პროცესს ულტრაბგერითი ლიზისისა და ცენტრიფუგირების გამოყენებით უფრო ეფექტურს, რაც უზრუნველყოფს მაღალი ხარისხის მიტოქონდრიულ პრეპარატებს, რომლებიც შესაფერისია შემდგომი გამოყენებისთვის.
Hielscher Sonicators – ხარისხი დამზადებულია გერმანიაში
Hielscher-ის ულტრაბგერითი აპარატები ცნობილია ხარისხისა და კონსტრუქციის უმაღლესი სტანდარტებით. გამძლეობა და მარტივი მართვა უზრუნველყოფს ჩვენი ულტრაბგერითი აპარატების უპრობლემო ინტეგრაციას სამრეწველო ობიექტებში. Hielscher-ის ულტრაბგერითი აპარატები ადვილად უმკლავდება მძიმე პირობებსა და მომთხოვნ სამუშაო გარემოს.
Hielscher Ultrasonics არის ISO-ს სერტიფიცირებული კომპანია და განსაკუთრებულ ყურადღებას უთმობს მაღალი წარმადობის ულტრაბგერით აპარატებს, რომლებიც უახლესი ტექნოლოგიითა და გამოყენების სიმარტივით გამოირჩევა. რა თქმა უნდა, Hielscher-ის ულტრაბგერითი აპარატები შეესაბამება CE-ს და აკმაყოფილებს UL-ის, CSA-სა და RoHs-ის მოთხოვნებს.
96-ფოსოიანი ფირფიტების სონიკატორი UIP400MTP მიკროტიტრული და მრავალფოსოიანი ფირფიტების სონიკაციისთვის
ლიტერატურა / წყაროები
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
ხშირად დასმული კითხვები მიტოქონდრიისა და მიტოქონდრიის დიაგნოსტიკის შესახებ
რა არის მიტოქონდრია?
მიტოქონდრია მემბრანასთან დაკავშირებული ორგანელებია, რომლებიც გვხვდება ევკარიოტული ორგანიზმების უმეტესობის უჯრედებში. ისინი ცნობილია როგორც უჯრედის ელექტროსადგურები, რადგან ისინი აწარმოებენ ენერგიას ადენოზინტრიფოსფატის (ATP) სახით უჯრედული სუნთქვის პროცესის მეშვეობით. გარდა ამისა, მიტოქონდრიებს აქვთ საკუთარი დნმ და თამაშობენ მთავარ როლს სხვა უჯრედულ პროცესებში, მათ შორის უჯრედული ციკლის რეგულირებასა და უჯრედის სიკვდილში.
რა განასხვავებს mtDNA-ს გენომიური დნმ-ისგან?
მიტოქონდრიული დნმ (mtDNA) განსხვავდება გენომიური დნმ-ისგან (gDNA) რამდენიმე ძირითადი გზით. MtDNA განლაგებულია მიტოქონდრიაში, არის წრიული და დედისგან მემკვიდრეობით გადაეცემა, ხოლო gDNA მდებარეობს უჯრედის ბირთვში, არის ხაზოვანი და მემკვიდრეობით მიიღება ორივე მშობლისგან. MtDNA გაცილებით მცირეა და მხოლოდ 37 გენს აკოდირებს, ხოლო gDNA შეიცავს დაახლოებით 20,000–25,000 გენს. MtDNA წარმოდგენილია თითო უჯრედზე მრავალ ეგზემპლარად, აქვს მუტაციის უფრო მაღალი მაჩვენებელი და, პირველ რიგში, კოდირებს მიტოქონდრიულ ფუნქციაში ჩართულ ცილებს. ამის საპირისპიროდ, gDNA, როგორც წესი, დიპლოიდურია, აქვს მუტაციის დაბალი მაჩვენებელი და აკოდირებს გენების ფართო სპექტრს, რომლებიც აუცილებელია ორგანიზმის განვითარებისა და ფუნქციონირებისთვის. გარდა ამისა, mtDNA ტრანსკრიფცია და ტრანსლაცია ხდება მიტოქონდრიაში, ხოლო gDNA ტრანსკრიფცია ხდება ბირთვში და ტრანსლაცია ხდება ციტოპლაზმაში. ეს განსხვავებები ასახავს მათ განსხვავებულ როლებს და ევოლუციურ საწყისებს.
რა არის უჯრედების გარეშე ექსტრაქტი?
უჯრედებისგან თავისუფალი ექსტრაქტი არის ხსნარი, რომელიც შეიცავს ლიზირებული უჯრედების შიგთავსს, მათ შორის ცილებს, ნუკლეინის მჟავებს და სხვა უჯრედულ კომპონენტებს, მაგრამ ხელუხლებელი უჯრედის მემბრანების გარეშე. ეს ექსტრაქტი გამოიყენება ბიოქიმიური და მოლეკულური ბიოლოგიის კვლევებში უჯრედული პროცესების in vitro შესასწავლად, რაც მკვლევარებს საშუალებას აძლევს გააანალიზონ რეაქციები და მექანიზმები ცოცხალი უჯრედების გარეთ.
რა როლს თამაშობენ PCR ტესტები მიტოქონდრიულ დიაგნოსტიკაში?
PCR ტესტები გადამწყვეტ როლს თამაშობს მიტოქონდრიულ დიაგნოსტიკაში, რადგან იძლევა მიტოქონდრიულ დნმ-ში (mtDNA) მუტაციების, დელეციების ან ასლების რაოდენობის ვარიაციების გამოვლენის საშუალებას. ისინი საშუალებას იძლევა გამრავლდეს mtDNA-ს სპეციფიკური უბნები მიტოქონდრიულ დარღვევებთან დაკავშირებული პათოგენური ვარიანტების იდენტიფიცირებისთვის. PCR-ზე დაფუძნებული ტექნიკა, როგორიცაა რაოდენობრივი PCR (qPCR) და გრძელი ფრაგმენტების PCR (long-range PCR), ასევე გამოიყენება mtDNA მთლიანობის, ჰეტეროპლაზმის დონისა და mtDNA-ს დეპლეციის შესაფასებლად, რაც გვაწვდის აუცილებელ ინფორმაციას მიტოქონდრიის ფუნქციისა და დაავადების შესახებ.
შეიტყვეთ, თუ როგორ აადვილებს UIP400MTP Microplate Sonicator PCR ტესტებსა და ანალიზებს!
რა არის დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია?
დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია არის ფართოდ გამოყენებული ტექნიკა უჯრედების ფრაქციონირებისა და მიტოქონდრიების იზოლაციისთვის. ეს მეთოდი გამოყოფს უჯრედულ სტრუქტურებს მათი დალექვის კოეფიციენტის მიხედვით, რაც დამოკიდებულია როგორც სიმკვრივეზე, ასევე ფორმაზე. პროცესი მოიცავს ცენტრიდანული ძალის სხვადასხვა დონის გამოყენებას ნიმუშებზე ბუფერულ მარილის ხსნარებში სპეციფიკური სიმკვრივით. მსგავსი დალექვის კოეფიციენტების მქონე სტრუქტურები ერთდროულად დასახლდება შეგროვების მილის ქვედა ნაწილში, რაც საშუალებას მისცემს მათ აღდგენას.
როგორ გამოიყენება დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია მიტოქონდრიის იზოლაციისთვის?
დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია მკვლევარებს საშუალებას აძლევს ეფექტურად გამოყოს მიტოქონდრიული ფრაქციები სხვა უჯრედული კომპონენტებისგან. მიტოქონდრიის იზოლაცია მოიცავს რამდენიმე ცენტრიფუგაციის საფეხურს და იზოლატის შემდგომ აღდგენას.
საწყისი ცენტრიფუგაცია: გამოიყენეთ დაბალი ცენტრიდანული ძალა დიდი უჯრედული ნამსხვრევებისა და ბირთვების დასალექად.
შემდგომი ცენტრიფუგაციები: გაზარდეთ ცენტრიდანული ძალა ეტაპობრივად, რათა დაილექოს მიტოქონდრიებით გამდიდრებული ფრაქციები. ცენტრიფუგაციის ყოველი საფეხური აცილებს სტრუქტურებს თანდათანობით უფრო მაღალი დალექვის კოეფიციენტებით.
ფრაქციების აღდგენა: ყოველი ცენტრიფუგაციის შემდეგ ნალექი გროვდება და ზენატანი ექვემდებარება უფრო მაღალ g-ძალებს შემდეგი ფრაქციის იზოლირებისთვის. ეს მეორდება მანამ, სანამ მიტოქონდრიის სასურველი სისუფთავე მიიღწევა.