Persiapan Sampel Throughput Tinggi untuk Diagnostik Mitokondria
Diagnostik mitokondria dalam penelitian dan klinik dilakukan dengan menggunakan berbagai teknik seperti pengurutan pengurutan PCR, dan uji biokimia. Metode ini digunakan untuk mengidentifikasi mutasi DNA dan mengukur fungsi mitokondria. Pengurutan membantu mendeteksi mutasi genetik, sedangkan PCR dapat mengukur urutan DNA tertentu. Uji biokimia mengevaluasi fungsionalitas protein dan enzim mitokondria.
Diagnostik penyakit mitokondria sangat sulit karena variabilitas klinis yang nyata dari penyakit ini serta karena interaksi kompleks antara dua genom yang diwariskan secara berbeda: DNA mitokondria (mtDNA) dan genom nuklir.
Ekstraksi dan Fragmentasi DNA menggunakan Sonikasi
Ekstraksi DNA dari jaringan otot sangat berguna ketika dicurigai terjadi perubahan spesifik jaringan dalam mtDNA. Perubahan ini mungkin termasuk penghapusan mtDNA pada ophthalmoplegia eksternal progresif kronis (CPEO), mutasi titik mtDNA pada miopati mitokondria, atau penipisan mtDNA pada sindrom Alpers. DNA yang diekstraksi dari jaringan otot kemudian dapat digunakan untuk berbagai tes genetik, seperti Southern blot dan PCR jarak jauh untuk penghapusan, PCR real-time untuk penipisan, atau pengurutan untuk mutasi titik.
Sonikasi, menggunakan gelombang ultrasound yang intens, diterapkan untuk beberapa aplikasi dalam diagnostik mitokondria. Ini digunakan untuk melisiskan sel untuk mengekstrak konten intraseluler seperti mitokondria dan DNA, untuk menggeser DNA seperti mtDNA dan nDNA untuk pengurutan, dan untuk menghomogenkan sampel.
UIP400MTP Plate Sonicator untuk persiapan sampel throughput tinggi Sonikasi sampel secara seragam dalam pelat multi-sumur dan 96-sumur
Cara Mengisolasi Mitokondria dari Sel dan Jaringan
Isolasi mitokondria terdiri dari dua langkah penting: mengganggu sel untuk melepaskan isinya, dan menggunakan sentrifugasi diferensial untuk memisahkan dan memulihkan fraksi mitokondria.
sonikasi
Sonikator Hielscher kompatibel dengan buffer dan kit lisis standar, sehingga cocok untuk isolasi mitokondria. Sonikasi melayani dua tujuan utama:
- Lisis Sel: Gelombang ultrasonik mengganggu membran sel, melepaskan isi intraseluler.
- Gangguan Mitokondria: Sonikasi pada langkah selanjutnya dapat membuka mitokondria untuk melepaskan protein mitokondria atau DNA mitokondria.
- Fragmentasi mtDNA: Sonikasi adalah teknik yang dapat diandalkan untuk memotong DNA mitokondria untuk pengurutan.
Sonicator pelat multi-sumur UIP400MTP memungkinkan persiapan sampel mitokondria throughput tinggi. Dalam hubungannya dengan sentrifugasi diferensial, sonikasi meningkatkan efisiensi isolasi mitokondria, memastikan hasil mitokondria utuh yang tinggi yang cocok untuk berbagai aplikasi hilir.
Hielscher UIP400MTP sonicator pelat multiwell Bekerja dengan pelat standar apa pun
Sonicator pelat multi-sumur UIP400MTP menawarkan banyak manfaat untuk persiapan sampel throughput tinggi, misalnya dalam diagnostik mitokondria.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator untuk preparasi sampel throughput tinggi dalam diagnostik biomarker.
Instruksi Teladan untuk Fragmentasi mtDNA Ultrasonik
Persiapan dan Ekstraksi:
- Tikus C57BL/6 dibunuh oleh dislokasi serviks.
- Hati dengan cepat diekstraksi dan dicuci dalam PBS steril sedingin es.
Isolasi Mitokondria:
- Mitokondria diisolasi menggunakan penggiling jaringan Dounce 2-mL dan Kit Isolasi Mitokondria untuk Jaringan.
- Sentrifugasi awal pada 700× g dan 3.000× g.
- Lakukan dua langkah pencucian tambahan dengan buffer C.
Isolasi DNA:
- Pelet dari sentrifugasi pertama pada 700× g digunakan untuk mengisolasi DNA nuklir (nDNA).
- DNA diisolasi menggunakan kolom spin.
- DNA mitokondria (mtDNA) diekstraksi dari mitokondria yang terisolasi.
- DNA nuklir (nDNA) diekstraksi dari ekstrak nuklir mentah, baik dari jaringan hati tikus.
Fragmentasi DNA:
- DNA difragmentasi di atas es menggunakan sonicator ultrasonik 30-kHz / 50-W UP50H dengan sonotrode ujung mikro 0,5 mm pada 14 μm selama 2 × 30 detik.
Visualisasi dan Kuantifikasi Fragmentasi:
- Fragmentasi setelah ultrasonifikasi divisualisasikan pada gel agarosa 1% dengan pewarna DNA aman SYBR.
- Kelimpahan relatif mtDNA dan nDNA ditentukan oleh qPCR.
(lih. Mariero et al., 2019)
Untuk persiapan sampel throughput tinggi, UIP400MTP sonicator pelat multi-sumur memfasilitasi persiapan jumlah sampel yang besar dalam pelat standar 96-sumur, multi-sumur dan mikrotiter.
Baca lebih lanjut tentang keuntungan persiapan sampel throughput tinggi menggunakan UIP400MTP!
Tips untuk Isolasi Mitokondria Optimal Menggunakan Sonikasi:
- Kontrol Suhu: Lakukan semua langkah pada kisaran suhu 0°C hingga 4°C. Ini sangat penting untuk menjaga integritas dan fungsionalitas mitokondria.
- Efisiensi dan Kecepatan: Bekerja dengan cepat dan murnikan mitokondria hanya sejauh yang diperlukan untuk aplikasi spesifik Anda. Manipulasi yang berlebihan dapat menyebabkan hilangnya kandungan mitokondria yang signifikan.
- Pengenceran Suspensi: Pertahankan konsentrasi rendah suspensi sel dan organel selama proses isolasi. Ini membantu meminimalkan risiko perangkap dan aglutinasi, sehingga meningkatkan kemurnian mitokondria yang terisolasi.
- Volume sampel: Pilih beberapa persiapan skala kecil daripada satu yang besar. Pendekatan ini biasanya menghasilkan hasil yang lebih baik, karena peningkatan skala tidak secara proporsional meningkatkan jumlah mitokondria yang dapat dipulihkan. Sonikator pelat multi-sumur UIP400MTP memfasilitasi lisis sel yang cepat dan andal untuk isolasi mitokondria serta ekstraksi protein dari mitokondria.
Pedoman ini akan membuat proses isolasi menggunakan lisis ultrasonik dan sentrifugasi lebih efisien, menghasilkan sediaan mitokondria berkualitas tinggi yang cocok untuk aplikasi hilir.
Sonicator Hielscher – Kualitas Buatan Jerman
Ultrasonicators Hielscher terkenal dengan kualitas dan standar desainnya yang tertinggi. Ketahanan dan pengoperasian yang mudah memungkinkan integrasi ultrasonicator kami ke dalam fasilitas industri. Kondisi kasar dan lingkungan yang menuntut mudah ditangani oleh ultrasonicator Hielscher.
Hielscher Ultrasonics adalah perusahaan bersertifikat ISO dan memberikan penekanan khusus pada ultrasonicators berkinerja tinggi yang menampilkan teknologi canggih dan keramahan pengguna. Tentu saja, ultrasonicators Hielscher sesuai dengan CE dan memenuhi persyaratan UL, CSA dan RoHs.
UIP400MTP sonicator pelat 96-sumur untuk sonikasi pelat mikrotiter dan multiwell
Literatur / Referensi
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Pertanyaan yang Sering Diajukan tentang Mitokondria dan Diagnostik Mitokondria
Apa itu Mitokondria?
Mitokondria adalah organel terikat membran yang ditemukan di sel-sel sebagian besar organisme eukariotik. Mereka dikenal sebagai pembangkit tenaga sel karena menghasilkan energi dalam bentuk adenosin trifosfat (ATP) melalui proses respirasi seluler. Selain itu, mitokondria memiliki DNA sendiri dan memainkan peran kunci dalam proses seluler lainnya, termasuk pengaturan siklus sel dan kematian sel.
Apa yang membedakan mtDNA dari DNA Genomik?
DNA mitokondria (mtDNA) berbeda dari DNA genom (gDNA) dalam beberapa hal utama. MtDNA terletak di mitokondria, berbentuk lingkaran, dan diwariskan secara ibu, sedangkan gDNA terletak di inti sel, linier, dan diwarisi dari kedua orang tua. MtDNA jauh lebih kecil, hanya mengkodekan 37 gen, sedangkan gDNA mengandung sekitar 20.000-25.000 gen. MtDNA hadir dalam beberapa salinan per sel, memiliki tingkat mutasi yang lebih tinggi, dan terutama kode untuk protein yang terlibat dalam fungsi mitokondria. Sebaliknya, gDNA biasanya diploid, memiliki tingkat mutasi yang lebih rendah, dan mengkodekan beragam gen yang diperlukan untuk perkembangan dan fungsi organisme. Selain itu, transkripsi dan terjemahan mtDNA terjadi di dalam mitokondria, sedangkan transkripsi gDNA terjadi di nukleus, dan translasi terjadi di sitoplasma. Perbedaan-perbedaan ini mencerminkan peran dan asal-usul evolusioner mereka yang berbeda.
Apa itu Ekstrak Bebas Sel?
Ekstrak bebas sel adalah larutan yang mengandung isi sel lisis, termasuk protein, asam nukleat, dan komponen seluler lainnya, tetapi tanpa membran sel utuh. Ekstrak ini digunakan dalam penelitian biokimia dan biologi molekuler untuk mempelajari proses seluler secara in vitro, memungkinkan peneliti untuk menganalisis reaksi dan mekanisme di luar sel hidup.
Apa itu Sentrifugasi Diferensial?
Sentrifugasi diferensial adalah teknik yang banyak digunakan untuk fraksinasi sel dan isolasi mitokondria. Metode ini memisahkan struktur seluler berdasarkan koefisien sedimentasinya, yang tergantung pada kepadatan dan bentuk. Proses ini melibatkan penerapan berbagai tingkat gaya sentrifugal pada sampel dalam larutan garam penyangga dengan kepadatan tertentu. Struktur dengan koefisien sedimentasi yang sama akan mengendap di bagian bawah tabung pengumpul pada saat yang sama, memungkinkan pemulihannya.
Bagaimana Sentrifugasi Diferensial digunakan untuk Isolasi Mitokondria?
Sentrifugasi diferensial memungkinkan peneliti untuk secara efektif memisahkan fraksi mitokondria dari komponen seluler lainnya. Isolasi mitokondria melibatkan beberapa langkah sentrifugasi dan pemulihan isolat selanjutnya.
Sentrifugasi Awal: Terapkan gaya sentrifugal rendah untuk mengendapkan puing-puing dan inti seluler yang besar.
Sentrifugasi Berikutnya: Tingkatkan gaya sentrifugal secara bertahap ke fraksi pelet yang diperkaya dengan mitokondria. Setiap langkah sentrifugasi menghilangkan struktur dengan koefisien sedimentasi yang semakin tinggi.
Pemulihan Fraksi: Setelah setiap sentrifugasi, pelet dikumpulkan, dan supernatan mengalami gaya-g yang lebih tinggi untuk mengisolasi fraksi berikutnya. Ini diulang sampai kemurnian mitokondria yang diinginkan tercapai.