Preparasi Sampel dengan Kapasitas Pemrosesan Sampel yang Tinggi untuk Diagnostik Mitokondria
Diagnostik mitokondria dalam penelitian dan praktik klinis dilakukan menggunakan berbagai teknik seperti sekuensing, PCR, dan uji biokimia. Metode-metode ini digunakan untuk mengidentifikasi mutasi DNA dan mengukur fungsi mitokondria. Sekuensing membantu mendeteksi mutasi genetik, sedangkan PCR dapat menguantifikasi sekuens DNA tertentu. Uji biokimia mengevaluasi fungsionalitas protein dan enzim mitokondria.
Diagnosis penyakit mitokondria sangat sulit karena variasi klinis yang mencolok pada penyakit-penyakit ini serta interaksi kompleks antara dua genom yang diwariskan secara berbeda: DNA mitokondria (mtDNA) dan genom inti.
Ekstraksi dan Fragmentasi DNA Menggunakan Sonikasi
Ekstraksi DNA dari jaringan otot sangat berguna ketika dicurigai adanya perubahan mtDNA yang spesifik pada jaringan. Perubahan ini dapat mencakup delesi mtDNA pada oftalmoplegia eksternal progresif kronis (CPEO), mutasi titik mtDNA pada miopati mitokondria, atau deplesi mtDNA pada sindrom Alpers. DNA yang diekstraksi dari jaringan otot kemudian dapat digunakan untuk berbagai tes genetik, seperti Southern blot dan PCR jarak panjang untuk delesi, PCR waktu nyata untuk deplesi, atau sekuensing untuk mutasi titik.
Sonikasi, yang menggunakan gelombang ultrasonik intens, diterapkan untuk beberapa aplikasi dalam diagnostik mitokondria. Teknik ini digunakan untuk melisis sel guna mengekstraksi isi intraseluler seperti mitokondria dan DNA, memfragmentasi DNA seperti mtDNA dan nDNA dengan gaya geser untuk sekuensing, serta menghomogenkan sampel.
Sonikator pelat UIP400MTP untuk preparasi sampel dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi mensonikasi sampel secara seragam dalam pelat multisumur dan pelat 96 sumur
Cara Mengisolasi Mitokondria dari Sel dan Jaringan
Isolasi mitokondria mencakup dua langkah penting: mendisrupsi sel untuk melepaskan isinya, dan menggunakan sentrifugasi diferensial untuk memisahkan serta memperoleh fraksi mitokondria.
Sonikasi
Sonikator Hielscher kompatibel dengan bufer dan kit lisis standar, sehingga sesuai untuk isolasi mitokondria. Sonikasi memiliki dua tujuan utama:
- Lisis Sel: Gelombang ultrasonik mendisrupsi membran sel, sehingga melepaskan isi intraseluler.
- Disrupsi Mitokondria: Sonikasi pada langkah berikutnya dapat membuka mitokondria untuk melepaskan protein mitokondria atau DNA mitokondria.
- Fragmentasi mtDNA: Sonikasi merupakan teknik yang andal untuk memfragmentasi DNA mitokondria dengan gaya geser untuk sekuensing.
Sonikator pelat multisumur UIP400MTP memungkinkan preparasi sampel mitokondria dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi. Bersama sentrifugasi diferensial, sonikasi meningkatkan efisiensi isolasi mitokondria, sehingga memastikan perolehan mitokondria utuh yang tinggi dan sesuai untuk berbagai aplikasi lanjutan.
Sonikator pelat multisumur Hielscher UIP400MTP dapat digunakan dengan pelat standar apa pun
Sonikator pelat multisumur UIP400MTP menawarkan banyak manfaat untuk preparasi sampel dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi, misalnya dalam diagnostik mitokondria.
Sonikator pelat multisumur UIP400MTP untuk preparasi sampel dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi dalam diagnostik biomarker.
Contoh Petunjuk Fragmentasi mtDNA secara Ultrasonik
Preparasi dan Ekstraksi:
- Mencit C57BL/6 dimatikan melalui dislokasi servikal.
- Hati segera diambil dan dicuci dalam PBS steril yang dingin seperti es.
Isolasi Mitokondria:
- Mitokondria diisolasi menggunakan penggerus jaringan Dounce 2-mL dan Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Sentrifugasi awal pada 700× g dan 3.000× g.
- Lakukan dua langkah pencucian tambahan dengan bufer C.
Isolasi DNA:
- Pelet dari sentrifugasi pertama pada 700× g digunakan untuk mengisolasi DNA inti (nDNA).
- DNA diisolasi menggunakan kolom sentrifugasi.
- DNA mitokondria (mtDNA) diekstraksi dari mitokondria yang telah diisolasi.
- DNA inti (nDNA) diekstraksi dari ekstrak inti kasar; keduanya berasal dari jaringan hati mencit.
Fragmentasi DNA:
- DNA difragmentasi di atas es menggunakan sonikator ultrasonik UP50H 30-kHz/50-W dengan sonotrode berujung mikro 0,5-mm pada 14 μm selama 2 × 30 detik.
Visualisasi dan Kuantifikasi Fragmentasi:
- Fragmentasi setelah sonikasi divisualisasikan pada gel agarosa 1% dengan pewarna DNA SYBR safe.
- Kelimpahan relatif mtDNA dan nDNA ditentukan menggunakan qPCR.
(bandingkan Mariero et al., 2019)
Untuk preparasi sampel dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi, sonikator pelat multisumur UIP400MTP memudahkan preparasi sejumlah besar sampel dalam pelat standar 96 sumur, pelat multisumur, dan pelat mikrotiter.
Baca lebih lanjut tentang keunggulan preparasi sampel dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi menggunakan UIP400MTP!
Kiat untuk Isolasi Mitokondria yang Optimal Menggunakan Sonikasi:
- Pengendalian Suhu: Lakukan semua langkah pada rentang suhu 0°C hingga 4°C. Hal ini sangat penting untuk mempertahankan integritas dan fungsionalitas mitokondria.
- Efisiensi dan Kecepatan: Bekerjalah dengan cepat dan murnikan mitokondria hanya sejauh yang diperlukan untuk aplikasi spesifik Anda. Manipulasi berlebihan dapat menyebabkan kehilangan kandungan mitokondria dalam jumlah yang signifikan.
- Pengenceran Suspensi: Pertahankan konsentrasi suspensi sel dan organel yang rendah sepanjang proses isolasi. Hal ini membantu meminimalkan risiko terperangkapnya komponen dan aglutinasi, sehingga meningkatkan kemurnian mitokondria yang diisolasi.
- Volume Sampel: Pilih beberapa preparasi berskala kecil alih-alih satu preparasi berskala besar. Pendekatan ini biasanya menghasilkan perolehan yang lebih baik, karena peningkatan skala tidak meningkatkan jumlah mitokondria yang dapat diperoleh secara proporsional. Sonikator pelat multisumur UIP400MTP memudahkan lisis sel yang cepat dan andal untuk isolasi mitokondria serta ekstraksi protein dari mitokondria.
Panduan ini akan membuat proses isolasi menggunakan lisis ultrasonik dan sentrifugasi lebih efisien, sehingga menghasilkan preparat mitokondria berkualitas tinggi yang sesuai untuk aplikasi lanjutan.
Sonikator Hielscher – Kualitas Buatan Jerman
Sonikator ultrasonik Hielscher dikenal dengan standar kualitas dan desain tertinggi. Ketangguhan dan kemudahan pengoperasiannya memungkinkan integrasi sonikator ultrasonik kami secara lancar ke dalam fasilitas industri. Kondisi berat dan lingkungan yang menuntut dapat ditangani dengan mudah oleh sonikator ultrasonik Hielscher.
Hielscher Ultrasonics adalah perusahaan bersertifikasi ISO dan memberikan perhatian khusus pada sonikator ultrasonik berkinerja tinggi yang dilengkapi teknologi mutakhir dan mudah digunakan. Tentu saja, sonikator ultrasonik Hielscher sesuai dengan ketentuan CE dan memenuhi persyaratan UL, CSA, dan RoHs.
Sonikator pelat 96 sumur UIP400MTP untuk sonikasi pelat mikrotiter dan multisumur
Literatur / Referensi
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Pertanyaan yang Sering Diajukan tentang Mitokondria dan Diagnostik Mitokondria
Apa Itu Mitokondria?
Mitokondria adalah organel bermembran yang terdapat dalam sel sebagian besar organisme eukariotik. Mitokondria dikenal sebagai pusat pembangkit energi sel karena menghasilkan energi dalam bentuk adenosin trifosfat (ATP) melalui proses respirasi seluler. Selain itu, mitokondria memiliki DNA sendiri dan berperan penting dalam proses seluler lainnya, termasuk pengaturan siklus sel dan kematian sel.
Apa yang Membedakan mtDNA dari DNA Genomik?
DNA mitokondria (mtDNA) berbeda dari DNA genomik (gDNA) dalam beberapa aspek utama. MtDNA terletak di dalam mitokondria, berbentuk sirkular, dan diwariskan dari ibu, sedangkan gDNA terletak di dalam inti sel, berbentuk linear, dan diwariskan dari kedua orang tua. MtDNA jauh lebih kecil, hanya mengode 37 gen, sedangkan gDNA mengandung sekitar 20.000–25.000 gen. MtDNA terdapat dalam banyak salinan per sel, memiliki laju mutasi yang lebih tinggi, dan terutama mengode protein yang terlibat dalam fungsi mitokondria. Sebaliknya, gDNA biasanya bersifat diploid, memiliki laju mutasi yang lebih rendah, dan mengode beragam gen yang diperlukan untuk perkembangan dan fungsi organisme. Selain itu, transkripsi dan translasi mtDNA berlangsung di dalam mitokondria, sedangkan transkripsi gDNA berlangsung di dalam inti sel dan translasinya berlangsung di sitoplasma. Perbedaan ini mencerminkan peran dan asal-usul evolusioner masing-masing yang berbeda.
Apa Itu Ekstrak Bebas Sel?
Ekstrak bebas sel adalah larutan yang mengandung isi sel yang telah dilisis, termasuk protein, asam nukleat, dan komponen seluler lainnya, tetapi tanpa membran sel yang utuh. Ekstrak ini digunakan dalam penelitian biokimia dan biologi molekuler untuk mempelajari proses seluler secara in vitro, sehingga memungkinkan peneliti menganalisis reaksi dan mekanisme di luar sel hidup.
Apa Peran Tes PCR dalam Diagnostik Mitokondria?
Tes PCR berperan penting dalam diagnostik mitokondria dengan memungkinkan deteksi mutasi, delesi, atau variasi jumlah salinan dalam DNA mitokondria (mtDNA). Tes ini memungkinkan amplifikasi wilayah mtDNA tertentu untuk mengidentifikasi varian patogenik yang berkaitan dengan gangguan mitokondria. Teknik berbasis PCR, seperti PCR kuantitatif (qPCR) dan PCR jarak panjang, juga digunakan untuk menilai integritas mtDNA, tingkat heteroplasmi, dan deplesi mtDNA, sehingga memberikan informasi penting tentang fungsi dan penyakit mitokondria.
Pelajari bagaimana sonikator mikroplat UIP400MTP memudahkan tes dan uji PCR!
Apa Itu Sentrifugasi Diferensial?
Sentrifugasi diferensial adalah teknik yang banyak digunakan untuk fraksinasi sel dan isolasi mitokondria. Metode ini memisahkan struktur seluler berdasarkan koefisien sedimentasinya, yang bergantung pada densitas dan bentuk. Proses ini melibatkan penerapan berbagai tingkat gaya sentrifugal pada sampel dalam larutan garam berbufer dengan densitas tertentu. Struktur dengan koefisien sedimentasi yang serupa akan mengendap di dasar tabung penampung pada saat yang sama, sehingga dapat diperoleh.
Bagaimana Sentrifugasi Diferensial Digunakan untuk Isolasi Mitokondria?
Sentrifugasi diferensial memungkinkan peneliti memisahkan fraksi mitokondria secara efektif dari komponen seluler lainnya. Isolasi mitokondria melibatkan beberapa langkah sentrifugasi dan pengambilan isolat setelahnya.
Sentrifugasi Awal: Terapkan gaya sentrifugal yang rendah untuk mengendapkan debris seluler berukuran besar dan inti sel.
Sentrifugasi Berikutnya: Tingkatkan gaya sentrifugal secara bertahap untuk mengendapkan fraksi yang diperkaya mitokondria menjadi pelet. Setiap langkah sentrifugasi menyingkirkan struktur dengan koefisien sedimentasi yang semakin tinggi.
Pengambilan Fraksi: Setelah setiap sentrifugasi, pelet dikumpulkan, dan supernatan dikenai gaya g yang lebih tinggi untuk mengisolasi fraksi berikutnya. Proses ini diulangi hingga kemurnian mitokondria yang diinginkan tercapai.