Պեպտիդների պինդֆազային սինթեզ – ավելի արդյունավետ՝ ուլտրաձայնային մշակմամբ
Պեպտիդների պինդֆազային սինթեզը (SPPS) պեպտիդների սինթեզի տարածված մեթոդն է։ Ուլտրաձայնային մշակումը պեպտիդների պինդֆազային սինթեզն ինտենսիվացնելու հուսալի միջոց է, որն ապահովում է ավելի բարձր ելքեր, բարելավված մաքրություն, ռացեմացման բացակայություն և ռեակցիայի զգալիորեն բարձրացված արագություն։ Hielscher Ultrasonics ընկերությունն առաջարկում է տարբեր ուլտրաձայնային լուծումներ պեպտիդների սինթեզի, անջատման և լուծման համար։
Պեպտիդների ուլտրաձայնային պինդֆազային սինթեզ
Ուլտրաձայնային մշակումն արդեն լայնորեն կիրառվում է որպես օրգանական սինթեզի ինտենսիվացման մեթոդ և հայտնի է իր առավելություններով՝ ռեակցիաների տևողության կտրուկ կրճատմամբ, ավելի բարձր ելքերով, կողմնակի արգասիքների ավելի փոքր քանակով, այլ եղանակներով անհասանելի ռեակցիոն ուղիների հարուցմամբ և/կամ ավելի լավ ընտրողականությամբ։ Մեծ օգուտներ կարելի է ստանալ նաև պեպտիդների սինթեզի ռեակցիաներում ուլտրաձայնային էներգիա ներմուծելիս։ Հետազոտությունների արդյունքները ցույց են տվել, որ ուլտրաձայնի օժանդակությամբ պեպտիդների սինթեզը ռեակցիայի կարճ ժամանակահատվածում ապահովում է բարձր մաքրությամբ պեպտիդների օպտիմալացված ելք՝ առանց ռացեմացման։
- Պեպտիդների բարձր ելքեր
- Զգալիորեն ավելի արագ սինթեզ
- Պեպտիդների ավելի բարձր մաքրություն
- Ռացեմացման բացակայություն
- Տարբեր պեպտիդների զուգահեռ սինթեզ
- Մասշտաբի մեծացման հնարավորություն՝ մինչև ցանկացած ծավալ
Ուլտրաձայնային cuphorn՝ մի քանի ռեակցիոն անոթների միատեսակ ուլտրաձայնային մշակման համար՝ պեպտիդների սինթեզը բարելավելու նպատակով։
Մերիֆիլդի պեպտիդների պինդֆազային սինթեզը պատկերող գծապատկեր։ Ուլտրաձայնային մշակումն օգտագործվում է սինթեզի ռեակցիան խթանելու և ուժեղացնելու, ինչպես նաև սինթեզված պեպտիդները խեժից անջատելու համար։
Գծապատկեր՝ ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Հետազոտություն | Հետազոտված պեպտիդ(ներ) | Ռեակցիայի տևողություն (դասական մեթոդի և US-SPPS-ի համեմատություն) | Չմաքրված արգասիքի մաքրություն (դասական մեթոդի և US-SPPS-ի համեմատություն) | Ռացեմացում և կողմնակի ռեակցիաներ | Հիմնական եզրահանգումներ |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkephalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorphin | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Cys/His-ի դեպքում չեն դիտվել՝ նույնիսկ 70°C ջերմաստիճանում | ~7–12 անգամ ավելի արագ սինթեզ․ մաքրության էական բարելավումներ՝ հատկապես ագրեգացման հակված հաջորդականությունների համար, ինչպիսին է TAT-ը։ |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12 ամինաթթվային մնացորդով), Pep2 (9 ամինաթթվային մնացորդով), Pep3 (25 ամինաթթվային մնացորդով) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2)․ Pep3՝ 347 min (միայն ուլտրաձայնով) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Չի ստուգվել․ նշվել է Pep2-ի մաքրության փոքր անկում | Pep1-ի համար տևողության 14 անգամ կրճատում․ չմաքրված արգասիքների ելքերը զգալիորեն աճել են։ |
| Merlino et al. (2019) | Մոդելային պենտապեպտիդներ, մինչև 44 ամինաթթվային մնացորդով պեպտիդներ, «դժվար հաջորդականություններ» (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (մոդելային պեպտիդի համար) | 84% → 93% (մոդելային պեպտիդի համար)․ ջերմային տաքացման (~45°C) համեմատ զգալիորեն ավելի բարձր | Cys/His էնանտիոմերների քանակի զգալի աճ չկա | Բարձր արդյունավետություն դժվար/ագրեգացման հակված հաջորդականությունների համար․ թույլ է տալիս նվազեցնել ռեագենտների ավելցուկը՝ պահպանելով բարձր մաքրությունը։ |
Ուլտրաձայնով բարելավված պեպտիդների պինդֆազային սինթեզ
Պինդ փուլում պեպտիդների սինթեզը (SPPS) քիմիական ռեակցիա է, որը թույլ է տալիս պեպտիդային շղթա հավաքել անլուծելի ծակոտկեն կրիչի վրա ամինաթթուների ածանցյալների հաջորդական ռեակցիաների միջոցով։ Սակայն պինդ փուլում պեպտիդների ավանդական սինթեզը համեմատաբար անարդյունավետ և դանդաղ գործընթաց է։ Ուստի պեպտիդների սինթեզի ուլտրաձայնային ինտենսիվացումը բարձր գնահատվող միջոց է պեպտիդների ավելի արդյունավետ և արագ սինթեզի համար։
Silva et al. (2021) համեմատել են ֆլուորենիլմեթօքսիկարբոնիլի (Fmoc) կիրառմամբ պինդ փուլում պեպտիդների «դասական» սինթեզը (SPPS) ուլտրաձայնի (US) օժանդակությամբ SPPS-ի հետ՝ հիմնվելով երեք պեպտիդների պատրաստման վրա, մասնավորապես՝ ֆիբրոբլաստների աճի գործոնի ընկալիչ 3-ի (FGFR3) նկատմամբ սպեցիֆիկ Pep1 պեպտիդի (VSPPLTLGQLLS-NH2) և նոր Pep2 (RQMATADEA-NH2) ու Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2) պեպտիդների։
Ուլտրաձայնի օժանդակությամբ SPPS-ը «դասական» մեթոդի համեմատ պեպտիդների հավաքման ժամանակը կրճատել է 14 անգամ (Pep1) և 4 անգամ (Pep2)։ Հետաքրքիր է, որ ուլտրաձայնի օժանդակությամբ SPPS-ի միջոցով ստացված Pep1 պեպտիդի մաքրությունն ավելի բարձր էր (82%), քան «դասական» SPPS-ի դեպքում (73%)։ Ժամանակի զգալի կրճատումը՝ զուգակցված ստացված չմաքրված պեպտիդի բարձր մաքրության հետ, հետազոտական խմբին դրդել է ուլտրաձայնի օժանդակությամբ SPPS-ը կիրառել խոշոր Pep3 պեպտիդի համար, որը պարունակում է մեծ թվով հիդրոֆոբ ամինաթթուներ և հոմոօլիգոմերային հաջորդականություններ։ Հատկանշական է, որ այս 25 ամինաթթվային մնացորդից կազմված պեպտիդի սինթեզն իրականացվել է 6 ժամից պակաս ժամանակում (347 րոպե)՝ միջին մաքրությամբ (մոտ 49%)։
Պեպտիդների ավելի արագ սինթեզ՝ ուլտրաձայնային խառնման կիրառմամբ պինդ փուլում պեպտիդների սինթեզի միջոցով։
(Հետազոտություն և վերլուծություն՝ Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) նույնպես իրականացրել են պինդ փուլում Fmoc-ի հիմքով պեպտիդների սինթեզի վրա ուլտրաձայնի ազդեցությունների համապարփակ հետազոտություն, որը հնարավորություն է տվել սինթեզել կենսաբանորեն ակտիվ տարբեր պեպտիդներ (մինչև 44 ամինաթթվային մնացորդից կազմված)՝ նյութերի և ռեակցիայի ժամանակի զգալի խնայողությամբ։ Նրանք ցույց են տվել, որ ուլտրաձայնային մշակումը չի ուժեղացրել հիմնական կողմնակի ռեակցիաները և բարելավել է «դժվար հաջորդականություններ» ունեցող պեպտիդների սինթեզը՝ ուլտրաձայնով խթանվող պինդ փուլում պեպտիդների սինթեզը (US-SPPS) դասելով պեպտիդների սինթեզի ներկայիս բարձր արդյունավետությամբ ռազմավարությունների շարքին։
Պեպտիդների ուլտրաձայնային (ձայնային) սինթեզի համար բարձր արտադրողականությամբ համակարգերի առկայությունը հնարավորություն է տալիս զգալիորեն բարձրացնել սինթեզի արագությունները և ավելացնել չմաքրված արտադրանքների մաքրությունը։ (Տե՛ս Wołczański et al., 2019)
Ռացեմացման ուսումնասիրություն։ Սենյակային ջերմաստիճանում դասական մոտեցմամբ և բարձրացված ջերմաստիճանում ուլտրաձայնային մեթոդով ձեռքով սինթեզված մոդելային պեպտիդների բնորոշ 1H NMR սպեկտրների համեմատություն։ His և Cys ամինաթթուների α-պրոտոնների ու Acm խմբի մեթիլենային խմբի (ձախ վահանակներ), ինչպես նաև Val ամինաթթվի ɣ-մեթիլային պրոտոնների (աջ վահանակներ) քիմիական շեղումները ցույց են տալիս, որ 70°C ջերմաստիճանում ուլտրաձայնային մշակումը ռացեմացում չի առաջացնում։
(Հետազոտություն և վերլուծություն՝ Wołczański et al., 2019)
Պեպտիդների ուլտրաձայնային անջատում
Պինդ փուլում պեպտիդների սինթեզից (SPPS) հետո սինթեզված պեպտիդները պետք է անջատվեն պոլիմերային խեժերից։ Այս քայլը հայտնի է նաև որպես պաշտպանիչ խմբերի հեռացում։ Խեժից պեպտիդների անջատման համար սովորական թափահարումն ու ուլտրաձայնային մշակումը համեմատելիս թափահարման մեթոդը պահանջում է մոտ 1 ժամ, մինչդեռ ուլտրաձայնային անջատումը կարող է իրականացվել 15–20 րոպեում։ Պեպտիդների ուլտրաձայնային անջատումը կարող է կիրառվել բենզիլային էսթերային կապերով պոլիստիրոլային խեժերին կապված պաշտպանված ամինաթթուների և պեպտիդների անջատման համար։
Պոլիստիրոլային խեժից պեպտիդների ուլտրաձայնային անջատումը արագ ընթացակարգի միջոցով ապահովում է բարձր մաքրությամբ պեպտիդների բարձր ելքեր՝ առանց ռացեմացման։
(Հետազոտություն և գծապատկեր՝ ©Anuradha and Ravindranath, 1995)
Ուլտրաձայնային խառնմամբ ռեակտոր՝ պեպտիդների բարելավված և արագացված սինթեզի համար։ Պատկերում ներկայացված է UP200St ուլտրաձայնային սարքը՝ խառնմամբ աշխատող ապակե ռեակտորում։
Բարձր արտադրողականությամբ ուլտրաձայնային սարքեր՝ պեպտիդների սինթեզի համար
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն առաջարկում է տարբեր ուլտրաձայնային լուծումներ՝ ուղղակի և անուղղակի ուլտրաձայնային մշակման համար։ Հզոր և ճշգրիտ կառավարելի ուլտրաձայնային պրոցեսորները ռեակցիոն անոթին հաղորդում են ուլտրաձայնային էներգիայի ճիշտ անհրաժեշտ քանակը։ Անկախ նրանից՝ որպես սինթեզի անոթ օգտագործում եք ներարկիչներ, փորձանոթներ, բազմահորիկ պլանշետներ, թե ապակե ռեակտորներ, Hielscher Ultrasonics ընկերությունն առաջարկում է պեպտիդների հետ ձեր աշխատանքի համար ամենահարմար ուլտրաձայնային սարքը։
- պատվերով պատրաստվող պեպտիդներ
- պեպտիդների լայնածավալ արտադրություն
- պեպտիդային գրադարաններ
Պեպտիդների սինթեզի բազմաթիվ գործընթացներ իրականացվում են ներարկիչներում (օրինակ՝ ծակոտկեն ֆիլտրով ներարկիչային ռեակտորներում)։ Hielscher ընկերության ներարկիչների ուլտրաձայնային խառնիչը պեպտիդային լուծույթը մշակում է ուլտրաձայնով՝ ուլտրաձայնային ալիքները ներարկիչի պատի միջով հաղորդելով հեղուկին։ Ներարկիչների ուլտրաձայնային խառնիչը պեպտիդների՝ ուլտրաձայնի օժանդակությամբ սինթեզի ամենատարածված ուլտրաձայնային լուծումներից մեկն է։
Ուլտրաձայնային cuphorn սարքը հարմար գործիք է մինչև 5 ռեակցիոն անոթ ուլտրաձայնով մշակելու համար, իսկ VialTweeter սարքը կարող է տեղավորել մինչև տասը ռեակցիոն փորձանոթ և սեղմակով ամրացվող լրասարքի միջոցով՝ լրացուցիչ հինգ ավելի մեծ անոթ։
Այլ տեսակի ռեակտորների, օրինակ՝ Merrifield կամ Kamysz պինդֆազային ռեակտորի, ինչպես նաև պոլիպրոպիլենային կամ բորոսիլիկատային այլ անոթների ու ռեակտորների համար Hielscher ընկերությունն առաջարկում է անուղղակի և ուղղակի ուլտրաձայնային մշակման սարքեր՝ պատվերով պատրաստվող սեղմակային ամրակով կամ կցաշուրթով։
Իհարկե, խառնիչով ավելի մեծ ապակե ռեակտորները, օրինակ՝ լուծույթային ֆազում սինթեզի համար նախատեսվածները, հեշտությամբ կարելի է համալրել ցանկացած չափի ուլտրաձայնային զոնդերով (որոնք հայտնի են նաև որպես սոնոտրոդներ կամ ուլտրաձայնային եղջյուրներ)։
- ուլտրաձայնային սարքերի տարբեր տեսակներ
- ուղղակի և անուղղակի ուլտրաձայնային մշակում
- ինտենսիվության ճշգրիտ կառավարում
- ջերմաստիճանի ճշգրիտ կառավարում
- անընդհատ կամ իմպուլսային ուլտրաձայն
- խելացի գործառույթներ, ծրագրավորվող սարքեր
- հասանելի են ցանկացած ծավալի համար
- մասշտաբի գծային մեծացման հնարավորություն
Բազմահորիկ կամ միկրոտիտրային պլանշետներում պեպտիդների պինդֆազային սինթեզի համար UIP400MTP սարքն իդեալական է։ Ուլտրաձայնային կավիտացիան անուղղակի եղանակով հավասարաչափ հաղորդվում է նմուշների բազմաթիվ հորիկներին՝ ապահովելով գերազանց զանգվածափոխանակություն և սինթեզի ռեակցիա։ Դիտեք ստորև բերված տեսանյութը՝ տեսնելու համար, թե ինչպես է գործում միկրոպլանշետների ուլտրաձայնային մշակման UIP400MTP սարքը։
Կապվե՛ք մեզ հետ։ / Հարցրե՛ք մեզ։
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն արտադրում է բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ լաբորատոր, փորձնական և արդյունաբերական մասշտաբներով խառնման, դիսպերսման, էմուլգացման և էքստրակցիայի կիրառությունների համար։
Օգտակար տեղեկություններ պեպտիդների ուլտրաձայնային սինթեզի մասին
Ի՞նչ են պեպտիդները։
Պեպտիդները միացություններ են, որոնցում բազմաթիվ ամինաթթուներ միացած են ամիդային՝ այսպես կոչված պեպտիդային կապերով։ Երբ դրանք միավորվում են բարդ կառուցվածքներում, որոնք սովորաբար բաղկացած են 50 կամ ավելի ամինաթթուներից, այս խոշոր պեպտիդային կառուցվածքները կոչվում են սպիտակուցներ։ Պեպտիդները կյանքի էական կառուցվածքային բաղադրիչ են և օրգանիզմում կատարում են բազմաթիվ գործառույթներ։
Ինչպե՞ս է ընթանում պեպտիդների սինթեզը։
Օրգանական քիմիայում, մոլեկուլային կենսաբանությունում և կենսագիտության մեջ պեպտիդների սինթեզը պեպտիդների ստացման գործընթացն է։ Պեպտիդները քիմիական եղանակով սինթեզվում են մեկ ամինաթթվի կարբօքսիլային խմբի և մեկ այլ ամինաթթվի ամինախմբի միջև կոնդենսացման ռեակցիայի միջոցով։ Ամինաթթուների տարբեր կողմնային շղթաների հետ անցանկալի կողմնակի ռեակցիաներից խուսափելու համար սովորաբար կիրառվում են պաշտպանող խմբերի (նաև՝ պաշտպանիչ խմբերի) օգտագործման ռազմավարություններ։
Պեպտիդների քիմիական (in-vitro) սինթեզն առավել հաճախ սկսվում է մուտք գործող ամինաթթվի կարբօքսիլային խմբի (C-ծայրի) միացմամբ աճող պեպտիդային շղթայի N-ծայրին։ Ի տարբերություն C-ծայրից դեպի N-ծայր ընթացող այս սինթեզի՝ կենդանի օրգանիզմներում երկար պեպտիդների բնական սպիտակուցային կենսասինթեզն ընթանում է հակառակ ուղղությամբ։ Սա նշանակում է, որ կենսասինթեզի ընթացքում մուտք գործող ամինաթթվի N-ծայրը միանում է սպիտակուցային շղթայի C-ծայրին (N-ծայրից դեպի C-ծայր)։
Պեպտիդների սինթեզի հետազոտական և մշակման ընթացակարգերի մեծ մասը հիմնված է պինդֆազային մեթոդների վրա, մինչդեռ լուծույթային ֆազում սինթեզի մեթոդներ կիրառվում են պեպտիդների լայնածավալ արդյունաբերական արտադրությունում։
Ո՞րն է պեպտիդների սինթեզի ներկայիս առաջադեմ մակարդակը։
SUS-SPPS (ուլտրաձայնի օժանդակությամբ կայուն SPPS), ինչպես ցույց է տրվել, յուրաքանչյուր ցիկլում գործընթացը կրճատում է մինչև ընդամենը երկու փուլ (համակցված միացում/ծայրային խմբերի արգելափակում/պաշտպանիչ խմբերի հեռացում + մեկ լվացում)՝ զգալիորեն նվազեցնելով լուծիչի սպառումը և ժամանակը։ (տե՛ս Mottola et al., 2025)
Ուլտրաձայնի օժանդակությամբ TAPS զարգացող համակցություն է, որի հաջողությունը ցուցադրվել է ամբողջական սինթեզներում (օրինակ՝ լիպոբակտինի), և որը պայմանագրային մշակման ու արտադրության կազմակերպությունները (CDMO) ուսումնասիրում են ակտիվ դեղագործական բաղադրիչների (API) արտադրության համար։
Բացահայտե՛ք ուլտրաձայնի օժանդակությամբ TAGGING պեպտիդային սինթեզի առավելությունները։
Շարունակական մշակումը ուսումնասիրվում է որպես հետագա բարելավում – նկարագրվել են սիլիլացված պիտակի օժանդակությամբ մեկ ռեակցիոն անոթում շարունակական սինթեզի հարթակներ։
Ոլորտը շարժվում է դեպի կանաչ քիմիայի սկզբունքները, ընդ որում՝ և՛ ուլտրաձայնը, և՛ TAPS նպաստում են լուծիչի օգտագործման նվազեցմանը, ռեագենտների ավելի փոքր քանակների կիրառմանը և կայունության բարելավմանը։
Գրականություն / Հղումներ
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics արտադրում է բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ լաբորատոր չափերից մինչև արդյունաբերական չափեր։