MBEC Assay Protocol՝ օգտագործելով 96 հորատանցք Plate Sonicator UIP400MTP
MBEC վերլուծությունն օգտագործվում է հակամանրէային նյութերի կոնցենտրացիան որոշելու համար, որոնք անհրաժեշտ են ցցերի կափարիչների վրա ձևավորված կենսաթաղանթները վերացնելու համար: Կենսաթաղանթի կենսունակությունը գնահատելու համար բիոֆիլմերը նախ պետք է անջատվեն 96 հորատանցք ունեցող ափսեի կցորդային կափարիչներից: Sonication-ը այս ջոկատի համար ամենահուսալի և արդյունավետ մեթոդն է: UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնային սարքը հատուկ նախագծված է առավելագույն արդյունավետությամբ և հարմարավետությամբ վերլուծական թիթեղները մշակելու համար՝ պարզեցնելով և արագացնելով բարձր թողունակության MBEC վերլուծությունները:
Sonication բիոֆիլմի ջոկատի համար
Sonication-ը վճռորոշ քայլ է կենսաթաղանթի վերացման նվազագույն կոնցենտրացիայի (MBEC) վերլուծության մեջ, որը հնարավորություն է տալիս արդյունավետորեն հեռացնել բիոֆիլմի բջիջները դրանց մակերեսային կցումից: Կենսաթաղանթները միկրոօրգանիզմների բնածին կառուցվածքային համայնքներ են, որոնք պարփակված են արտաբջջային մատրիցով, ինչը նրանց դարձնում է զգալիորեն ավելի դիմացկուն հակամանրէային նյութերի նկատմամբ՝ համեմատած պլանկտոնային բջիջների հետ: MBEC-ի վերլուծությունների ժամանակ, sonication-ը օգտագործում է ուլտրաձայնային ալիքներ՝ վերահսկվող կավիտացիա առաջացնելու համար՝ խաթարելով բիոֆիլմի մատրիցը և ազատելով ներկառուցված բջիջները կախոցի մեջ: Այս քայլը երաշխավորում է, որ բիոֆիլմի բջիջները հավասարապես ցրված են վերականգնման միջավայրում՝ հեշտացնելով կենսունակության ճշգրիտ գնահատումը թաղման, նոսրացման կամ սպեկտրոֆոտոմետրիկ մեթոդների միջոցով: Առանց բիոֆիլմի պատշաճ անջատման, մատրիցայի մնացորդային բաղադրիչները կարող են պաշտպանել բջիջները՝ հանգեցնելով հակամանրէային արդյունավետության թերագնահատմանը: Հետևաբար, sonication-ը անփոխարինելի է հուսալի և վերարտադրելի MBEC արժեքներ ստանալու համար, որոնք արտացոլում են փորձարկված նյութերի իրական վերացման ներուժը: UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնային սարքը թույլ է տալիս հեշտությամբ բարձր թողունակությամբ նմուշի պատրաստում փորձարկման թիթեղներում:
UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնային սարք հեշտացնում է բարձր թողունակության նմուշի պատրաստումը փորձարկման թիթեղներում:
Բիոֆիլմի վերացման նվազագույն կոնցենտրացիայի (MBEC) փորձարկման արձանագրություն
Քայլ 1. Կենսաթաղանթի ձևավորում
- Պատրաստել բակտերիալ կախոցը.
Աճեցրեք բակտերիաները համապատասխան միջավայրում լոգ-փուլային աճի համար:
Բակտերիալ կուլտուրան նոսրացրեք մինչև որոշակի օպտիկական խտություն (օրինակ՝ OD600 ~ 0,1): - Պատվաստել 96 ջրհորի ափսեը.
Ավելացրեք բակտերիաների կախոցը (օրինակ՝ 150–200 µL) ստանդարտ 96 հորանի միկրոտիտրային ափսեի յուրաքանչյուր հորի մեջ: - Կցեք կափարիչի կափարիչը.
Կցիչի կափարիչը դրեք պատվաստված ափսեի վրա, որպեսզի թույլ տա բիոֆիլմի ձևավորումը ցցերի մակերեսների վրա: - Ինկուբացնել ափսեը.
Ինկուբացնել տեղադրումը համապատասխան ջերմաստիճանում (օրինակ՝ 37°C) 24–48 ժամ առանց թափահարելու՝ կենսաթաղանթի աճը խթանելու համար:
Քայլ 2. Բուժում հակամանրէային միջոցներով
- Պատրաստել հակամանրէային լուծույթներ.
Պատրաստեք մի շարք հակամանրէային կոնցենտրացիաներ թարմ միջավայրում:
Բիոֆիլմերը ենթարկել հակամանրէային նյութերի.
Հեռացրեք կցորդի կափարիչը բակտերիալ կուլտուրայից և ողողեք այն ստերիլ ֆիզիոլոգիական լուծույթով կամ PBS՝ պլանկտոնային բջիջները հեռացնելու համար:
Տեղադրեք կցորդի կափարիչը նոր 96 հորանի ափսեի մեջ, որը պարունակում է հակամանրէային լուծույթներ: - Ինկուբացնել ափսեը.
Ինկուբացնել սահմանված ժամկետով (օրինակ՝ 24 ժամ), որպեսզի թույլատրվի հակամանրէային ազդեցություն ունենալ:
Բազմաբխային ափսեի ձայնային սարք UIP400MTP բարձր արդյունավետությամբ նմուշի պատրաստման համար
Քայլ 3. Sonication 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP-ով
Sonication քայլը կարևոր է բիոֆիլմերը կցորդների կափարիչներից անջատելու համար՝ կենսունակությունը գնահատելու համար: Հետևեք հետևյալ քայլերին UIP400MTP sonicator-ի համար.
- Պատրաստել կարգավորումը.
Թարմ 96 հորանանոց ափսեը լցրեք վերականգնող միջավայրով (օրինակ՝ չեզոքացնող արգանակ կամ թարմ աճող միջավայր) յուրաքանչյուր հորում: - Տեղափոխեք կափարիչի կափարիչը.
Հեռացրեք կցորդի կափարիչը հակամանրէային բուժման ափսեից:
Լվացեք կցորդի կափարիչը ստերիլ ֆիզիոլոգիական լուծույթով կամ PBS-ով, որպեսզի հեռացնեք մնացորդային հակամանրէային նյութերը: - Տեղադրեք ափսեը և ձայնային սարքը.
Կցեք կափարիչը վերականգնման միջին ափսեին:
Տեղադրեք վերականգնման միջավայրի ափսեը UIP400MTP ձայնային սարքի հարթակի վրա՝ ապահովելով, որ ափսեը կենտրոնացած է և կայուն: - Կարգավորել sonication պարամետրերը:
Sonication-ի պարամետրերը սահմանեք UIP400MTP-ում (Կարգավորումները կարող են ճշգրտվել բիոֆիլմի վրա).
Լայնություն՝ 70–100%։
Ձայնավորման ժամանակը. 1–3 րոպե (կարգավորվում է բիոֆիլմի կայունության հիման վրա) ցիկլային ռեժիմում: - Sonicate:
Սկսեք ձայնագրման գործընթացը: Ուլտրաձայնային թրթռումը կտեղահանի բիոֆիլմերը կցորդի մակերեսներից վերականգնման միջավայրի մեջ: - Հետևեք գործընթացին.
Օգտագործեք խցանվող ջերմաստիճանի տվիչը՝ հորերում նմուշի ջերմաստիճանը վերահսկելու համար: UIP400MTP-ը կարելի է միացնել լաբորատոր սառեցման սառեցման համար: - Post-Sonication բեռնաթափում:
Անմիջապես տեղափոխեք վերականգնման միջավայրը (այժմ պարունակում է անջատված կենսաթաղանթներ) թարմ ստերիլ ափսեի մեջ՝ ներքևում վերլուծության համար:
(Ա) 2% գլյուկոզայով TSB պարունակող ափսե, որն օգտագործվում է կենսաթաղանթի ձևավորման, բջիջների վերականգնման և
MIC-ի և MBCB-ի որոշում; (B) Կափարիչով կափարիչով ստաֆիլոկոկային բիոֆիլմերի ձևավորման համար: MIC-ի և MBCB-ի որոշում; (B) Կափարիչով կափարիչով ստաֆիլոկոկային բիոֆիլմերի ձևավորման համար:
Բջիջների վրա ձևավորված բիոֆիլմի բջիջները տեղահանվել են ձայնային ախտահանման միջոցով (Hielscher Ultrasound Technology) 5 րոպեի ընթացքում 96 ջրհորի ափսեներում, որոնք պարունակում են թարմ կուլտուրայի միջավայր՝ բջիջները վերականգնելու համար:
(Նկար և ուսումնասիրություն՝ ©de Oliveira et al., 2016)
Քայլ 4. Կենսունակության գնահատում
Ափսե և կուլտուրայի անջատված բիոֆիլմեր.
- Կատարեք վերականգնման միջավայրի և ափսեի սերիական նոսրացում ագարի վրա՝ գաղութներ ձևավորող միավորները (CFU) թվարկելու համար:
Որպես այլընտրանք, օգտագործեք գունաչափական կամ ֆլուորեսցենցիայի վրա հիմնված կենսունակության վերլուծություն: - Արձանագրեք արդյունքները.
Որոշեք MBEC-ը որպես հակամանրէային նյութի ամենացածր կոնցենտրացիան, որը վերացրել է հայտնաբերվող կենսաֆիլմի կենսունակությունը:
Դիզայն, արտադրություն և խորհրդատվություն – Որակյալ Արտադրված է Գերմանիայում
Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հայտնի են իրենց ամենաբարձր որակի և դիզայնի չափանիշներով: Հզորությունը և հեշտ շահագործումը թույլ են տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերի սահուն ինտեգրումը արդյունաբերական օբյեկտներում: Ծանր պայմանները և պահանջկոտ միջավայրերը հեշտությամբ կառավարվում են Hielscher-ի ձայնագրիչներով:
Hielscher Ultrasonics-ը ISO սերտիֆիկացված ընկերություն է և հատուկ շեշտադրում է կատարում բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային սարքերի վրա, որոնք բնութագրվում են ժամանակակից տեխնոլոգիաներով և օգտագործողների համար հարմարավետությամբ: Իհարկե, Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը համապատասխանում են ԵԽ-ին և համապատասխանում են UL, CSA և RoH-ների պահանջներին:
Պարզեցրեք նմուշի պատրաստումը 96 ջրհորի թիթեղներում և փորձարկման թիթեղներում օգտագործելով UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնագրիչ
Գրականություն / Հղումներ
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Microplate Sonicator Validated in Peer-Reviewed Proteomics Study
Հաճախակի տրվող հարցեր
Ի՞նչ է MBEC վերլուծությունը:
Կենսաթաղանթի վերացման նվազագույն կոնցենտրացիայի (MBEC) վերլուծությունը ստանդարտացված մեթոդ է, որն օգտագործվում է հակամանրէային նյութի ամենացածր կոնցենտրացիան որոշելու համար, որն անհրաժեշտ է բիոֆիլմի հետ կապված բակտերիաների վերացման համար: Այն ներառում է բիոֆիլմերի աճեցում մասնագիտացված մակերեսների վրա, դրանք ենթարկելով հակամանրէային տարբեր կոնցենտրացիաների, և գնահատում է անջատված բջիջների կենսունակությունը կենսաթաղանթի խաթարումից հետո, սովորաբար ձայնային ախտահանման միջոցով, բուժման արդյունավետությունը գնահատելու համար:
Ո՞րն է տարբերությունը MBIC-ի և MBEC-ի միջև:
Կենսաթաղանթի արգելակման նվազագույն կոնցենտրացիան (MBIC) հակամանրէային նյութի ամենացածր կոնցենտրացիան է, որն անհրաժեշտ է բիոֆիլմի ձևավորումը կանխելու համար, մինչդեռ բիոֆիլմի վերացման նվազագույն կոնցենտրացիան (MBEC) ամենացածր կոնցենտրացիան է, որն անհրաժեշտ է հաստատված կենսաթաղանթն արմատախիլ անելու համար: MBIC-ը կենտրոնանում է բիոֆիլմի կանխարգելման վրա, մինչդեռ MBEC-ը գնահատում է բուժման արդյունավետությունը հասուն բիոֆիլմերի դեմ:
Ի՞նչ թիթեղներ են սովորաբար օգտագործվում MBEC վերլուծությունների համար:
Միկրոտիտրային թիթեղները, որոնք սովորաբար օգտագործվում են MBEC վերլուծության համար, սովորաբար 96 հորանի թիթեղներ են, որոնք պատրաստված են պոլիստիրոլից կամ պոլիպրոպիլենից: Այս նյութերը ապահովում են համապատասխան մակերես բիոֆիլմի ձևավորման համար և քիմիապես դիմացկուն են հետազոտության ընթացքում փորձարկված հակամանրէային նյութերի նկատմամբ: Պոլիստիրոլային թիթեղները լայնորեն նախընտրելի են իրենց օպտիկական պարզության պատճառով, ինչը ձեռնտու է ներքևի անալիզների համար, ինչպիսիք են սպեկտրոֆոտոմետրիկ կամ ֆլուորեսցենտային չափումները: Այս թիթեղների դիզայնը ներառում է անջատվող կցորդների կափարիչներ, որոնք էական նշանակություն ունեն վերլուծության համար, քանի որ բիոֆիլմեր են ձևավորվում ցցիկների վրա, որոնք ընկղմված են աճի միջավայր պարունակող հորերում: Ստանդարտացված թիթեղները, ինչպիսիք են MBEC վերլուծության արձանագրությանը համապատասխանող սալերը, հատուկ նախագծված են՝ ապահովելու վերարտադրելիություն և համատեղելիություն UIP400MTP sonicator-ի կամ այլ մշակման սարքավորումների հետ:
Որոնք են PEG-Lid թիթեղները:
PEG-կափարիչ թիթեղները մասնագիտացված բազմահոր ափսե համակարգեր են, որտեղ կափարիչը հագեցած է փոքր պոլիէթիլեն գլիկոլով (PEG) կցորդներով կամ կապումներով, որոնք տարածվում են յուրաքանչյուր հորի մեջ: Այս կցորդները մակերես են ապահովում վերահսկվող պայմաններում մանրէաբանական բիոֆիլմի ձևավորման համար՝ ընդօրինակելով իրական բիոֆիլմի աճը: Դիզայնը թույլ է տալիս կենսաթաղանթները զարգանալ ցցերի վրա, մինչդեռ հորերը պարունակում են աճող միջավայր կամ հակամանրէային նյութեր, ինչը հնարավորություն է տալիս բիոֆիլմի զգայունության բարձր թողունակության թեստավորում բուժումների նկատմամբ, ինչպիսիք են MBEC և MBIC վերլուծությունները:
Hielscher Ultrasonics-ը արտադրում է բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ լաբորատորիա դեպի արդյունաբերական չափս.