Ամիլոիդային ֆիբրիլների ձևավորում՝ UIP400MTP միկրոպլանշետային ուլտրաձայնային սարքի միջոցով
Ամիլոիդային ֆիբրիլները, բյուրեղների նման, ձևավորվում են կորիզագոյացման և դրան հաջորդող աճի գործընթացով։ Սակայն կորիզագոյացման ազատ էներգիայի բարձր արգելքի պատճառով ամիլոիդային ֆիբրիլների ինքնաբուխ ձևավորումը տեղի է ունենում միայն երկարատև լագ-փուլից հետո։ Ուլտրաձայնային մշակումը դարձել է ամիլոիդային կորիզագոյացումը հարուցելու հզոր գործիք՝ այդպիսով զգալիորեն արագացնելով ֆիբրիլների ձևավորումը։ Թիոֆլավին T (ThT) ֆլուորեսցենցիան օգտագործող միկրոպլանշետային ընթերցիչի հետ համակցվելիս ուլտրաձայնային մշակումը հնարավորություն է տալիս միաժամանակ բազմաթիվ նմուշներում մեծ արտադրողականությամբ հայտնաբերել ամիլոիդային ֆիբրիլները։
Ուլտրաձայնով հարուցված ամիլոիդային ֆիբրիլների ձևավորում՝ UIP400MTP միկրոպլանշետային ուլտրաձայնային սարքով
UIP400MTP բազմահոր պլանշետների ուլտրաձայնային սարքով հետազոտական նպատակների համար կարելի է արագ սինթեզել նույն որակի ամիլոիդային ֆիբրիլներ՝ մեծ քանակություններով։ Այս արդյունավետ մոտեցումը թույլ է տալիս ուսումնասիրել սպիտակուցների ամիլոիդագոյացման ունակությունը։ Այս մեթոդը նպաստում է ամիլոիդային ֆիբրիլների արագ և վերարտադրելի ձևավորմանը, ինչպես ցույց է տրվել β2-միկրոգլոբուլինի (β2-m)՝ դիալիզի հետ կապված ամիլոիդոզի հետ առնչվող ամիլոիդագեն սպիտակուցի օրինակով։
Պարզ փորձարարական մոտեցում. ուլտրաձայնով հարուցված ամիլոիդային ֆիբրիլների ձևավորում
Ֆիբրիլների ձևավորումը հարուցելու համար 96-հորանի միկրոպլանշետը տեղադրվել է UIP400MTP բազմահոր պլանշետների ուլտրաձայնային սարքի կենտրոնում, որն ապահովում է բոլոր հորերի համաչափ ուլտրաձայնային ազդեցությունը։ Փորձարարական պայմանները հետևյալն էին.
- Յուրաքանչյուր հոր պարունակում էր 0,2 ml β2-միկրոգլոբուլինի լուծույթ (0,3 mg/ml, pH 2,5)՝ հավելված 5 μM ThT։
- Պլանշետը ենթարկվել է ուլտրաձայնային մշակման ցիկլերի, օրինակ՝ 1 րոպե ուլտրաձայնային մշակում, որին հաջորդել է 9 րոպե դադար։
- Ուլտրաձայնային մշակումից հետո ThT ֆլուորեսցենցիան չափվել է միկրոպլանշետային ընթերցիչով։
(հմմտ. So et al., 2011)
Համեմատություն սովորական խառնման հետ
Խառնման ավանդական մեթոդների համեմատ՝ ուլտրաձայնային մշակումը կտրուկ կրճատել է ֆիբրիլների ձևավորման լագ-փուլը։ Միկրոպլանշետի սովորական թափահարման պայմաններում 20 ժամ անց 10 հորից միայն 1-ում է դիտվել ThT ֆլուորեսցենցիայի աճ։ Ի տարբերություն դրա՝ ցիկլային ուլտրաձայնային մշակման դեպքում (15 րոպե ուլտրաձայնային մշակում, որին հաջորդել է 5 րոպե հանգիստ) ThT ֆլուորեսցենցիայի զգալի աճ է հայտնաբերվել անմիջապես առաջին ուլտրաձայնային մշակումից հետո։
Ֆիբրիլների ձևավորման կինետիկայի կտրուկ արագացում
So et al. (2011) ուսումնասիրության արդյունքները ցույց են տվել, որ pH 2,5 պայմաններում β2-միկրոգլոբուլինի ինքնաբուխ ֆիբրիլների ձևավորումը ուլտրաձայնային մշակմամբ կարելի է արագացնել՝ մի քանի ժամից հասցնելով ընդամենը 10–15 րոպեի։
Ատոմաուժային մանրադիտակման (AFM) պատկերները հաստատել են, որ յուրաքանչյուր 15 րոպեն մեկ 10 րոպե ուլտրաձայնային մշակմամբ ստացված ֆիբրիլները ձևաբանորեն չեն տարբերվել յուրաքանչյուր 10 րոպեն մեկ 1 րոպե ուլտրաձայնային մշակմամբ ձևավորված ֆիբրիլներից։ Սա ընդգծում է ուլտրաձայնով հարուցված ամիլոիդային ֆիբրիլների ձևավորման վերարտադրելիությունն ու կայունությունը։
Ամիլոիդային ֆիբրիլների AFM պատկերներ՝ ստացված յուրաքանչյուր 10 րոպեն մեկ 1 րոպե ուլտրաձայնային մշակմամբ (i), յուրաքանչյուր 15 րոպեն մեկ 10 րոպե ուլտրաձայնային մշակմամբ (ii) և առանց ուլտրաձայնային մշակման՝ սաղմնավորման ռեակցիայով (iii)։ Սպիտակ մասշտաբային գծիկը համապատասխանում է 1 μm-ի։
Ուսումնասիրություն և պատկերներ՝ ©So et al., 2011
Ֆիբրիլների ձևավորում չեզոք pH-ի պայմաններում
Նույնիսկ չեզոք pH-ի պայմաններում ֆիբրիլների ձևավորում է ստացվել 1,5 ժամ լագ-ժամանակից հետո՝ ցույց տալով, որ ուլտրաձայնային մշակումը զգալիորեն նվազեցնում է կորիզագոյացման և աճի էներգետիկ արգելքը։ Սա լրացուցիչ հաստատում է այն վարկածը, որ ամիլոիդային ֆիբրիլների ձևավորումն առավելապես ֆիզիկական ռեակցիա է, որը մեծապես սահմանափակվում է կորիզագոյացման էներգետիկ արգելքով, իսկ ուլտրաձայնային մշակումն արդյունավետորեն նվազեցնում է այդ արգելքը։
Ազդեցությունն ամիլոիդի հետ կապված հիվանդությունների հետազոտության վրա
UIP400MTP միկրոպլանշետային ուլտրաձայնային սարքով ամիլոիդային ֆիբրիլների հեշտ և հուսալի ձևավորումը կարևոր նշանակություն ունի Ալցհայմերի հիվանդության (AD) հետազոտության և ամիլոիդի հետ կապված այլ խանգարումների, օրինակ՝ Պարկինսոնի հիվանդության, II տիպի շաքարային դիաբետի և համակարգային ամիլոիդոզների համար։ AD-ի դեպքում ամիլոիդ-β (Aβ) ագրեգացումը առանցքային ախտաբանական հատկանիշ է, սակայն դրա ֆիբրիլների ձևավորման կինետիկայի ուսումնասիրությունը շարունակում է դժվար լինել՝ սովորական մեթոդներին բնորոշ երկար լագ-փուլերի և փոփոխականության պատճառով։ Ուլտրաձայնով պայմանավորված ֆիբրիլների ձևավորումն արագացնում է կորիզագոյացումը՝ ապահովելով բարձր վերարտադրելիություն և նվազեցված փոփոխականություն, ինչը վճռորոշ է հնարավոր արգելակիչների սկրինինգի և ամիլոիդագեն մեխանիզմները հասկանալու համար։ Բացի այդ, UIP400MTP սարքի՝ մեծ արտադրողականությամբ աշխատելու հնարավորությունը թույլ է տալիս լայնածավալ ուսումնասիրություններ իրականացնել սպիտակուցների սխալ ծալավորման և ագրեգացման վերաբերյալ՝ նպաստելով այնպիսի բուժական միջոցների հայտնաբերմանը, որոնք կարող են կարգավորել ֆիբրիլների ձևավորումը և հնարավոր է՝ մեղմել նյարդադեգեներատիվ գործընթացի առաջընթացը։
UIP400MTP սարքն ապահովում է նմուշների հուսալի պատրաստում և հեշտ ինտեգրում լաբորատոր գործող աշխատանքային գործընթացներին
Այս ուսումնասիրությունը հաստատում է, որ UIP400MTP բազմահոր պլանշետների ուլտրաձայնային սարքով ուլտրաձայնային մշակումը ամիլոիդային ֆիբրիլների ձևավորումն արագացնելու բարձր արդյունավետ մեթոդ է։ Այս մոտեցման հիմնական առավելություններն են.
- Ֆիբրիլների ձևավորման լագ-ժամանակի կտրուկ կրճատում։
- Բոլոր հորերի համաչափ ուլտրաձայնային ազդեցություն, որը հնարավորություն է տալիս վերարտադրելիորեն ձևավորել ֆիբրիլներ։
- Մեծ արտադրողականությամբ սկրինինգի հնարավորություն, որն այն հարմար է դարձնում ամբողջ գենոմի ընդգրկմամբ սպիտակուցների ամիլոիդագոյացման ունակության որոնումների համար։
Ուլտրաձայնային մշակումը համատեղելով ThT ֆլուորեսցենցիայի հայտնաբերման հետ՝ այս մեթոդն ապահովում է արագ, մասշտաբը մեծացնելու հնարավորություն ունեցող և հուսալի հարթակ՝ ամիլոիդային ֆիբրիլների ձևավորումն ուսումնասիրելու համար։ Հաշվի առնելով արդյունավետությունն ու մեծ արտադրողականության ներուժը՝ այս մոտեցումը կարող է նպաստել կենսաֆիզիկական և դեղագործական հետազոտությունների համար ամիլոիդային ֆիբրիլների հեշտ սինթեզին՝ առաջարկելով խոստումնալից գործիք ամիլոիդի հետ կապված ուսումնասիրությունների և դեղերի սկրինինգի համար։
EM-ի էքստրակցիա՝ մեծ արտադրողականությամբ UIP400MTP 96-հորանի պլանշետների ուլտրաձայնային սարքով
Գրականություն / Հղումներ
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
- Masatomo So, Hisashi Yagi, Kazumasa Sakurai, Hirotsugu Ogi, Hironobu Naiki, Yuji Goto (2011): Ultrasonication-Dependent Acceleration of Amyloid Fibril Formation. Journal of Molecular Biology, Volume 412, Issue 4, 2011. 568-577.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Հաճախ տրվող հարցեր
Ի՞նչ է ամիլոիդի առաջնային կորիզագոյացումը։
Ամիլոիդի առաջնային կորիզագոյացումը ամիլոիդային ֆիբրիլների ձևավորման սկզբնական՝ արագությունը սահմանափակող փուլն է, որի ընթացքում մոնոմերային սպիտակուցները ենթարկվում են կոնֆորմացիոն փոփոխությունների և ինքնահավաքվում՝ առաջացնելով կրիտիկական կորիզ։ Այս կորիզը ծառայում է որպես կաղապար հետագա ագրեգացման համար։
Ինչպե՞ս է ֆիբրիլը ձևավորվում ամիլոիդոզի դեպքում։
Ամիլոիդոզի դեպքում սխալ ծալավորված սպիտակուցներն ագրեգացվում են կորիզագոյացումից կախված պոլիմերացման միջոցով։ Կորիզի ձևավորումից հետո մոնոմերները երկրորդային կորիզագոյացման և կաղապարով ուղղորդվող աճի միջոցով արագ երկարում են՝ վերածվելով β-շերտերով հարուստ ֆիբրիլների, ինչը հանգեցնում է ամիլոիդային նստվածքների առաջացման։
Ի՞նչ է ամիլոիդային ֆիբրիլների պոլիմորֆիզմը։
Ամիլոիդային ֆիբրիլների պոլիմորֆիզմը նույն սպիտակուցից ձևավորված ֆիբրիլների կառուցվածքային տարբերությունների առկայությունն է։ Ֆիբրիլների ձևաբանության, պրոտոֆիլամենտների դասավորության և մոլեկուլային փաթեթավորման տարբերություններն առաջանում են միջավայրի պայմանների, մուտացիաների կամ ագրեգացման տարբեր ուղիների հետևանքով։
Ո՞րն է ամիլոիդային ֆիբրիլների և վահանիկների տարբերությունը։
Ամիլոիդային ֆիբրիլները գծային, β-շերտերով հարուստ սպիտակուցային ագրեգատներ են, իսկ ամիլոիդային վահանիկները ագրեգացված ֆիբրիլների արտաբջջային նստվածքներ են՝ հաճախ խառնված լիպիդների, մետաղների և բջջային մնացորդների հետ, ինչպես դիտվում է նյարդադեգեներատիվ հիվանդությունների, օրինակ՝ Ալցհայմերի հիվանդության դեպքում։
Ո՞րն է ալֆա-սինուկլեինի և ամիլոիդի տարբերությունը։
Ալֆա-սինուկլեինը նեյրոնային սպիտակուց է, որը մասնակցում է սինապսային գործառույթին, սակայն ախտաբանական պայմաններում այն սխալ է ծալավորվում և ձևավորում ամիլոիդանման ֆիբրիլներ։ «Ամիլոիդը» սխալ ծալավորված, ֆիբրիլային սպիտակուցային ագրեգատների ընդհանուր անվանումն է, մինչդեռ ալֆա-սինուկլեինի ֆիբրիլները բնորոշ են այնպիսի հիվանդությունների, ինչպիսին Պարկինսոնի հիվանդությունն է։
Ի՞նչ է սպիտակուցային ֆիբրիլը։
Սպիտակուցային ֆիբրիլը բարձր կարգավորված, β-շերտերով հարուստ, թելանման ագրեգատ է, որը ձևավորվում է սխալ ծալավորված կամ մասամբ ապածալավորված սպիտակուցներից։ Այս ֆիբրիլները սովորաբար անլուծելի են և առաջանում են կորիզագոյացումից կախված պոլիմերացման միջոցով։ Դրանք կապված են տարբեր ախտաբանական վիճակների, այդ թվում՝ ամիլոիդոզների և նյարդադեգեներատիվ հիվանդությունների հետ (օրինակ՝ Ալցհայմերի, Պարկինսոնի)։ Սակայն կենսաբանական համակարգերում կան նաև որոշ գործառութային սպիտակուցային ֆիբրիլներ, օրինակ՝ բակտերիաների կուրլի թելերը և սարդերի մետաքսի ֆիբրիլները։
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն արտադրում է բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ լաբորատոր չափերից մինչև արդյունաբերական չափեր։