Ամիլոիդ ֆիբրիլների ձևավորում UIP400MTP Microplate Sonicator-ի միջոցով
Ամիլոիդային մանրաթելերը, բյուրեղների նման, ձևավորվում են միջուկացման և հետագա աճի միջոցով: Այնուամենայնիվ, միջուկային ազատ էներգիայի բարձր արգելքի պատճառով ինքնաբուխ ամիլոիդ ֆիբրիլների ձևավորումը տեղի է ունենում միայն երկարատև հետաձգման փուլից հետո: Ultrasonication-ը հայտնվել է որպես ամիլոիդի միջուկացում հրահրելու հզոր գործիք՝ դրանով իսկ զգալիորեն արագացնելով ֆիբրիլների ձևավորումը: Երբ զուգակցվում է թիոֆլավին T (ThT) ֆլուորեսցենտով միկրոպլատների ընթերցողի հետ, ուլտրաձայնային ախտորոշումը թույլ է տալիս միաժամանակ մի քանի նմուշներում հայտնաբերել ամիլոիդ մանրաթելերի բարձր թողունակությունը:
Ուլտրաձայնային ինդուկտիվ ամիլոիդային ֆիբրիլների ձևավորում UIP400MTP միկրոափսե Sonicator-ով
UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնային սարքի միջոցով նույն որակի ամիլոիդ մանրաթելերը մեծ քանակությամբ կարող են արագ սինթեզվել հետազոտական նպատակներով: Այս արդյունավետ մոտեցումը թույլ է տալիս ուսումնասիրել սպիտակուցի ամիլոիդոգենությունը: Այս տեխնիկան հեշտացնում է արագ և վերարտադրվող ամիլոիդային ֆիբրիլյացիան, ինչպես ցույց է տրված β2-միկրոգլոբուլինը (β2-m), որը ամիլոիդոգեն սպիտակուց է, որը կապված է դիալիզի հետ կապված ամիլոիդոզի հետ:
Պարզ փորձարարական մոտեցում. Ուլտրաձայնային ձևով առաջացած ամիլոիդ ֆիբրիլացիա
Ֆիբրիլների ձևավորումը հրահրելու համար UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնագրիչի կենտրոնում տեղադրվել է 96 հորատանցք ունեցող միկրոափսե, որն ապահովում է ուլտրաձայնային միատեսակ ազդեցություն բոլոր հորերում: Փորձարարական պայմանները հետևյալն էին.
- Յուրաքանչյուր հորատանցք պարունակում էր 0,2 մլ β2-միկրոգլոբուլինի լուծույթ (0,3 մգ/մլ, pH 2,5)՝ լրացված 5 μM ThT-ով:
- Թիթեղը ենթարկվել է ուլտրաձայնային ցիկլերի, ինչպիսին է 1 րոպեանոց ուլտրաձայնային հետազոտությունը, որին հաջորդում է 9 րոպե դադար:
- Հետձայնացումից հետո, ThT ֆլյուորեսցենտը չափվել է միկրոափսե ընթերցողի միջոցով:
(տես So et al., 2011)
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
Համեմատություն սովորական գրգռման հետ
Ավանդական գրգռման մեթոդների համեմատ՝ ուլտրաձայնային ախտորոշումը կտրուկ նվազեցրեց ֆիբրիլների առաջացման հետաձգման փուլը: Պայմանական միկրոսալերի թափահարման պայմաններում 10 հորերից միայն 1-ն է ցուցադրել ThT ֆլյուորեսցենտության բարձրացում 20 ժամ հետո: Ի հակադրություն, օգտագործելով ցիկլային ուլտրաձայնային (15 րոպե sonication, որին հաջորդում է 5 րոպե հանգիստ), ThT ֆլուորեսցենցիայի զգալի աճ է հայտնաբերվել առաջին sonication բուժումից անմիջապես հետո:
Ֆիբրիլյացիայի կինետիկայի արագ արագացում
Ստացված արդյունքները So et al. (2011) ցույց տվեց, որ β2-միկրոգլոբուլինի ինքնաբուխ ֆիբրիլների ձևավորումը pH 2.5-ում կարող է արագացվել մի քանի ժամից մինչև ընդամենը 10-15 րոպե՝ ուլտրաձայնային եղանակով:
Ատոմային ուժի մանրադիտակի (AFM) պատկերները հաստատեցին, որ յուրաքանչյուր 15 րոպեն մեկ 10 րոպեանոց ուլտրաձայնային ախտահարման միջոցով առաջացած մանրաթելերը մորֆոլոգիապես չեն տարբերվում յուրաքանչյուր 10 րոպեն մեկ 1 րոպեանոց ուլտրաձայնային ախտորոշմամբ ձևավորվածներից: Սա ընդգծում է ուլտրաձայնային եղանակով առաջացած ամիլոիդային ֆիբրիլացիայի վերարտադրելիությունն ու ամրությունը:
Ամիլոիդային մանրաթելերի AFM պատկերներ, որոնք ստացվում են 1 րոպե ուլտրաձայնային եղանակով յուրաքանչյուր 10 րոպեում (i), 10 րոպեանոց ուլտրաձայնային եղանակով յուրաքանչյուր 15 րոպեում (ii) և սերմնավորման ռեակցիայի միջոցով՝ առանց ուլտրաձայնային (iii): Սպիտակ սանդղակի սանդղակը ներկայացնում է 1 մկմ:
Ուսումնասիրություն և պատկերներ՝ ©So et al., 2011
Ֆիբրիլացիա չեզոք pH-ի պայմաններում
Նույնիսկ չեզոք pH-ի պայմաններում, ֆիբրիլների ձևավորումը ձեռք է բերվել 1,5 ժամ ուշացումից հետո, ինչը ցույց է տալիս, որ ուլտրաձայնային ազդեցությունը զգալիորեն նվազեցնում է միջուկացման և աճի էներգետիկ արգելքը: Սա հետագայում հաստատում է այն վարկածը, որ ամիլոիդային ֆիբրիլյացիան հիմնականում ֆիզիկական ռեակցիա է, որը հիմնականում սահմանափակվում է միջուկային էներգիայի պատնեշով, որն արդյունավետորեն նվազեցնում է ուլտրաձայնային ազդեցությունը:
Ազդեցությունը ամիլոիդների հետ կապված հիվանդությունների հետազոտության վրա
Ամիլոիդային մանրաթելերի հեշտ և հուսալի ձևավորումը, օգտագործելով UIP400MTP միկրոպլատային sonicator, նշանակալի հետևանքներ ունի Ալցհեյմերի հիվանդության (AD) հետազոտության և ամիլոիդների հետ կապված այլ խանգարումների համար, ինչպիսիք են Պարկինսոնի հիվանդությունը, II տիպի շաքարախտը և համակարգային ամիլոիդոզները: AD-ում ամիլոիդ-β (Aβ) ագրեգացիան հիմնական պաթոլոգիական հատկանիշն է, սակայն դրա ֆիբրիլյացիայի կինետիկայի ուսումնասիրությունը մնում է դժվար՝ երկար հետաձգման փուլերի և սովորական մեթոդների փոփոխականության պատճառով: Ուլտրաձայնային ֆիբրիլների ձևավորումը արագացնում է միջուկացումը՝ ապահովելով բարձր վերարտադրելիություն և նվազեցված փոփոխականություն, ինչը կարևոր է պոտենցիալ արգելակիչների ցուցադրման և ամիլոիդոգեն մեխանիզմները հասկանալու համար: Ավելին, UIP400MTP-ի բարձր թողունակությունը թույլ է տալիս լայնածավալ հետազոտություններ կատարել սպիտակուցների սխալ ծալման և ագրեգացման վերաբերյալ՝ հեշտացնելով թերապևտիկ նյութերի հայտնաբերումը, որոնք կարող են մոդուլավորել ֆիբրիլների ձևավորումը և պոտենցիալ մեղմացնել նեյրոդեգեներատիվ առաջընթացը:
UIP400MTP-ն ապահովում է նմուշների հուսալի պատրաստում և հեշտ ինտեգրում առկա լաբորատոր աշխատանքային հոսքերի հետ
Այս ուսումնասիրությունը հաստատում է ուլտրաձայնային ախտորոշումը, օգտագործելով UIP400MTP բազմաբնակարան ափսե sonicator որպես բարձր արդյունավետ մեթոդ ամիլոիդային ֆիբրիլի ձևավորումը արագացնելու համար: Այս մոտեցման հիմնական առավելությունները ներառում են.
- Fibrillation-ի հետաձգման ժամանակի կտրուկ նվազում:
- Ուլտրաձայնային միատեսակ ազդեցություն բոլոր հորերում, ինչը հնարավորություն է տալիս վերարտադրվող ֆիբրիլների ձևավորմանը:
- Բարձր թողունակության սքրինինգի հնարավորություն՝ այն հարմարեցնելով սպիտակուցի ամիլոիդոգենության գենոմի ողջ որոնումների համար:
Ինտեգրելով ուլտրաձայնային ախտորոշումը ThT ֆլուորեսցենտային հայտնաբերման հետ՝ այս մեթոդը ապահովում է արագ, մասշտաբային և հուսալի հարթակ ամիլոիդային ֆիբրիլյացիայի ուսումնասիրման համար: Հաշվի առնելով իր արդյունավետությունը և բարձր թողունակությունը՝ այս մոտեցումը կարող է հեշտացնել ամիլոիդային մանրաթելերի հեշտ սինթեզը կենսաֆիզիկական և դեղագործական հետազոտությունների համար՝ առաջարկելով խոստումնալից գործիք ամիլոիդների հետ կապված ուսումնասիրությունների և դեղերի զննման համար:
Բարձր թողունակությամբ EM արդյունահանում UIP400MTP 96 ջրհորի ափսեի ձայնային սարքով
Գրականություն / Հղումներ
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Masatomo So, Hisashi Yagi, Kazumasa Sakurai, Hirotsugu Ogi, Hironobu Naiki, Yuji Goto (2011): Ultrasonication-Dependent Acceleration of Amyloid Fibril Formation. Journal of Molecular Biology, Volume 412, Issue 4, 2011. 568-577.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Հաճախակի տրվող հարցեր
Ի՞նչ է ամիլոիդի առաջնային միջուկացումը:
Ամիլոիդի առաջնային միջուկավորումը ամիլոիդ ֆիբրիլի ձևավորման սկզբնական, արագությունը սահմանափակող քայլն է, որտեղ մոնոմերային սպիտակուցները ենթարկվում են կոնֆորմացիոն փոփոխությունների և ինքնակազմակերպվում են կրիտիկական միջուկ: Այս միջուկը ծառայում է որպես կաղապար հետագա ագրեգացման համար:
Ինչպե՞ս է առաջանում ֆիբրիլը ամիլոիդոզում:
Ամիլոիդոզում սխալ ծալված սպիտակուցները ագրեգացվում են միջուկից կախված պոլիմերացման միջոցով: Երբ միջուկը ձևավորվում է, մոնոմերներն արագորեն երկարանում են՝ վերածվելով β-թերթով հարուստ մանրաթելերի՝ երկրորդական միջուկացման և ձևավորված աճի միջոցով, ինչը հանգեցնում է ամիլոիդային նստվածքների:
Ի՞նչ է ամիլոիդ ֆիբրիլային պոլիմորֆիզմը:
Ամիլոիդ ֆիբրիլային պոլիմորֆիզմը վերաբերում է նույն սպիտակուցի կողմից ձևավորված մանրաթելերի կառուցվածքային տատանումներին: Ֆիբրիլների մորֆոլոգիայի, նախաթելերի դասավորության և մոլեկուլային փաթեթավորման տարբերությունները առաջանում են շրջակա միջավայրի պայմանների, մուտացիաների կամ ագրեգացման տարբեր ուղիների պատճառով:
Ո՞րն է տարբերությունը ամիլոիդ ֆիբրիլների և տախտակների միջև:
Ամիլոիդային մանրաթելերը գծային, β-թերթով հարուստ սպիտակուցային ագրեգատներ են, մինչդեռ ամիլոիդային թիթեղները ագրեգացված մանրաթելերի արտաբջջային նստվածքներ են, որոնք հաճախ խառնվում են լիպիդների, մետաղների և բջջային բեկորների հետ, ինչպես երևում է նեյրոդեգեներատիվ հիվանդությունների դեպքում, ինչպիսին է Ալցհեյմերը:
Ո՞րն է տարբերությունը ալֆա-սինուկլեինի և ամիլոիդի միջև:
Ալֆա-սինուկլեինը սինապտիկ ֆունկցիայի մեջ ներգրավված նեյրոնային սպիտակուց է, սակայն պաթոլոգիական պայմաններում այն սխալ ծալվում է և ձևավորում ամիլոիդային մանրաթելեր։ “ամիլոիդ” ընդհանուր տերմին է սխալ ծալված, ֆիբրիլային սպիտակուցային ագրեգատների համար, մինչդեռ ալֆա-սինուկլեինի մանրաթելերը հատուկ են Պարկինսոնի նման հիվանդություններին:
Ի՞նչ է սպիտակուցային ֆիբրիլը:
Սպիտակուցային ֆիբրիլը խիստ կարգավորված, β-թերթով հարուստ, թելավոր ագրեգատ է, որը ձևավորվում է սխալ ծալված կամ մասամբ բացված սպիտակուցներից: Այս մանրաթելերը սովորաբար անլուծելի են և առաջանում են միջուկացումից կախված պոլիմերացման միջոցով: Դրանք կապված են տարբեր պաթոլոգիական վիճակների, այդ թվում՝ ամիլոիդոզների և նեյրոդեգեներատիվ հիվանդությունների հետ (օրինակ՝ Ալցհեյմերի, Պարկինսոնի հիվանդություն): Այնուամենայնիվ, որոշ ֆունկցիոնալ սպիտակուցային մանրաթելեր գոյություն ունեն կենսաբանական համակարգերում, ինչպիսիք են բակտերիաների մեջ կուրլի մանրաթելերը և սարդերի մետաքսի մանրաթելերը:
Hielscher Ultrasonics-ը արտադրում է բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ լաբորատորիա դեպի արդյունաբերական չափս.