PMCA՝ UIP400MTP ուլտրաձայնային սարքի միջոցով պրիոնների բարձր թողունակությամբ հայտնաբերման համար

UIP400MTP բազմափոսիկային թիթեղների ուլտրաձայնային սարքը հզոր լուծում է առաջարկում սպիտակուցների սխալ ծալման ցիկլային ամպլիֆիկացման (PMCA) ընթացքում նմուշների բարձր թողունակությամբ նախապատրաստման համար։ Բազմաթիվ փոսիկներում ապահովելով էներգիայի հավասարաչափ բաշխում և պահպանելով ուլտրաձայնային մշակման ճշգրիտ պարամետրերը՝ այս համակարգը հնարավորություն է տալիս միաժամանակ մշակել բազմաթիվ նմուշներ՝ բացառիկ վերարտադրելիությամբ։ Այս հնարավորությունները վճռորոշ են PMCA-ի օպտիմալացման համար՝ պրիոնները ցածր կոնցենտրացիաներով հայտնաբերելու դժվար մշակվող կենսաբանական նմուշներում, օրինակ՝ թքում, որտեղ անալիզի արգելակիչները կարող են քողարկել արդյունքները։

Պրիոնային հիվանդությունները, օրինակ՝ եղջերուների ընտանիքի կենդանիների քրոնիկ հյուծման հիվանդությունը (CWD) և մարդկանց Կրոյցֆելդտ–Յակոբի հիվանդությունը (CJD), նեյրոդեգեներատիվ խանգարումներ են, որոնք առաջանում են սխալ ծալված պրիոնային սպիտակուցների հետևանքով (PrP^Sc)։ Այս հիվանդությունների դեպքում մարմնի հեղուկներում, օրինակ՝ թքում, արյան մեջ և մեզում, հաճախ առկա են վարակիչ պրիոնների ցածր մակարդակներ, ինչը բարդացնում է ախտորոշումն ու հետազոտությունը։ Շրջակա միջավայրի մատրիցներում արտազատված պրիոնների միջոցով CWD-ի հորիզոնական փոխանցումը հատկապես նշանակալի հետևանքներ ունի վայրի կենդանիների պոպուլյացիաների կառավարման և էկոլոգիական առողջության համար։ Նմանապես, Կրոյցֆելդտ–Յակոբի հիվանդության նման հիվանդությունների դեպքում մարդկային նմուշներից սխալ ծալված պրիոնային սպիտակուցների հուսալի ամպլիֆիկացումը վճռորոշ է ախտորոշման առաջընթացի և հիվանդության զարգացման ընթացքը հասկանալու համար։

Փոփոխված PMCA արձանագրության կիրառումը հնարավորություն է տալիս շրջանցել անալիզի տարածված արգելակիչները (օրինակ՝ թքի մուցինները) և հասնել պրիոնների հայտնաբերման բարձր զգայունության այն դեպքերում, երբ իրական ժամանակում թափահարմամբ հարուցված փոխակերպման (RT-QuIC) նման մեթոդների կիրառմամբ դրանք այլապես չէին հայտնաբերվի կամ հայտնաբերման արդյունքները երկիմաստ կլինեին։ Այս առաջընթացները բարելավում են պրիոնների հայտնաբերումը տարբեր հիվանդությունների դեպքում՝ PMCA-ն դարձնելով անփոխարինելի գործիք պրիոնների հետազոտության և ախտորոշման համար։ UIP400MTP բազմափոսիկային թիթեղների ուլտրաձայնային սարքը հեշտացնում է բարձր թողունակությամբ PMCA-ն՝ ուլտրաձայնով մշակելով բազմաթիվ նմուշներ միկրոթիթեղներում (օրինակ՝ 6, 24 կամ 96 փոսիկով թիթեղներում) կամ փորձանոթների դարակում տեղադրված սրվակներում։

Սպիտակուցների սխալ ծալման բարձր թողունակությամբ ցիկլային ամպլիֆիկացման (PMCA) արձանագրություն

Հետևյալ արձանագրությունը հնարավորություն է տալիս արդյունավետորեն մշակել մեծ թվով նմուշներ միանգամայն նույն պայմաններում՝ հետազոտության հուսալի արդյունքներ ստանալու համար։

Նմուշների նախապատրաստում

Ելանյութ՝
Նախապատրաստեք նմուշները՝

• Սարկոզիլով էքստրակցիայի նստվածքները կրկին սուսպենզավորելով PMCA սուբստրատում։
• Պրիոնային սերմնանյութը անմիջապես ավելացնելով ուղեղի հոմոգենատներին կամ արյան նմուշներին։

Սուբստրատ՝

• Օգտագործեք ուղեղի 10% (զանգված/ծավալ) հոմոգենատ՝ պատրաստված տրանսգենային մկներից, որոնցում գերարտահայտվում է PrP^C (օրինակ՝ Tg մկներից)։
• Հոմոգենացրեք ուղեղի հյուսվածքը հետևյալ միջավայրում՝
  — 1× PBS։
  — 150 mM NaCl։
  — 1% Triton X-100։
• Մինչև օգտագործումը սուբստրատը պահեք -80ºC ջերմաստիճանում։

Նմուշների տեղադրումը միկրոթիթեղում կամ փորձանոթներում՝
Փորձանոթներ՝

• Ավելացրեք 90 μL ուղեղի հոմոգենատի սուբստրատ և որպես սերմնանյութ ներմուծեք 10 μL նմուշ (օրինակ՝ արյուն, ուղեղի հոմոգենատ կամ սարկոզիլով ստացված նստվածք)։
• Յուրաքանչյուր 0,2 mL փորձանոթում տեղադրեք 3 Teflon գնդիկ (1,59-mm կամ 2,38-mm տրամագծով)։
• Փորձանոթները տեղադրեք UIP400MTP ուլտրաձայնային սարքի հետ համատեղելի դարակում։

6 փոսիկով միկրոթիթեղ՝

• Յուրաքանչյուր փոսիկում ավելացրեք 5 mL ուղեղի հոմոգենատի սուբստրատ և որպես սերմնանյութ ներմուծեք 500 μL նմուշ։
• Յուրաքանչյուր փոսիկում ավելացրեք 3 Teflon գնդիկ։

PMCA-ի ընթացակարգ

Տեղադրում՝
Փորձանոթների դարակը կամ 6 փոսիկով միկրոթիթեղը տեղադրեք UIP400MTP ուլտրաձայնային սարքի մեջ՝ արտադրողի հրահանգներին համապատասխան։

Ցիկլերի ծրագիր՝
Կատարեք 144 PMCA ցիկլ՝ հետևյալ կերպ՝

• Ինկուբացիա՝ 29 րոպե և 30 վայրկյան՝ 37°C ջերմաստիճանում։
• Ուլտրաձայնային մշակում՝ 30 վայրկյան՝ 60% ամպլիտուդով։
• Վերահսկեք ջերմաստիճանը՝ օգտագործեք միացվող ջերմաստիճանային տվիչը՝ նմուշի ջերմաստիճանը վերահսկելու համար, և UIP400MTP սարքում ծրագրավորեք առավելագույն ջերմաստիճանը՝ 48–50°C։

Հետագա փուլեր՝
144 ցիկլից բաղկացած առաջին փուլն ավարտելուց հետո տեղափոխեք ամպլիֆիկացված նյութի ալիքվոտը՝

• Նոսրացրեք 10 անգամ՝ տրանսգենային մկան ուղեղի հոմոգենատի թարմ սուբստրատում։
• Հետագա փուլերում կատարեք 96 PMCA ցիկլ՝ պահպանելով ուլտրաձայնային մշակման նույն պարամետրերը։
• Շարունակեք մինչև փուլերի ցանկալի քանակը (սովորաբար՝ մինչև 5)։

Հայտնաբերում՝ PrP^Sc

1. Ճեղքում պրոտեինազ K-ով՝
   — Նմուշները մշակեք պրոտեինազ K-ով (50 μg/mL)՝ 37°C ջերմաստիճանում 1 ժամ։
   — Դադարեցրեք ճեղքումը՝ ավելացնելով նմուշների SDS բուֆեր և եռացնելով 10 րոպե։
2. Վեստերն բլոտի վերլուծություն՝
   — Վերլուծեք ճեղքված նմուշները՝ օգտագործելով՝
   — 6H4 կամ PRC1 հակա-PrP հակամարմիններ։
   — Հայտնաբերման համար կատարեք SDS-PAGE և տեղափոխեք PVDF թաղանթների վրա։

 

Hielscher UIP400MTP-ը ամենաբազմակիրառելի ուլտրաձայնային մշակման սարքն է Ձեր բազմահորիկ թիթեղների, PCR թիթեղների կամ նմուշի փորձանոթների համար։ 400 վատտ անընդհատ ուլտրաձայնային ելքային հզորությամբ այն նախատեսված է այնպիսի կիրառությունների համար, ինչպիսիք են բջիջների լիզիսը, էմուլգացումը, սպիտակուցների կորզումը, DNA / RNA-ի ֆրագմենտավորումը, ապագլոմերացումը, FFPE նմուշներից կորզումը, բջիջների և կենսաթաղանթների անջատումը կամ էմուլգացումը։ UIP400MTP-ը ուլտրաձայնային լոգանք չէ։ Այն բարձր ինտենսիվության բաժակաձև սոնոտրոդ է՝ ուղղորդված ուլտրաձայնային մշակման համար։ Այս հզոր անկոնտակտ սարքն ապահովում է Ձեր ստանդարտ բազմահորիկ թիթեղի բոլոր հորիկների համաչափ ուլտրաձայնային մշակումը։ Դուք կարող եք ճշգրիտ վերահսկել տատանման լայնույթը, հզորությունը և իմպուլսային ռեժիմը։ Ներկառուցված ժամանակաչափն ու ջերմաստիճանային զոնդն ապահովում են կայուն արդյունքներ։ UIP400MTP թիթեղների ուլտրաձայնային մշակման սարքը նմուշները սառեցնում է ջրային լոգանքով՝ արտաքին սառեցուցիչի միացման հնարավորությամբ։

 

Մշակեք ավելի շատ նմուշներ՝ ավելի հուսալի արդյունքների համար

UIP400MTP բազմափոսիկային թիթեղների ուլտրաձայնային սարքը զգալիորեն բարձրացնում է սպիտակուցների սխալ ծալման ցիկլային ամպլիֆիկացման (PMCA) արդյունավետությունն ու ավելի մեծ մասշտաբի հասցնելու հնարավորությունը՝ լուծելով ընթացակարգի ավանդաբար ժամանակատար լինելու խնդիրը։ Հնարավորություն տալով 96 փոսիկով թիթեղում միաժամանակ մշակել մինչև 96 նմուշ՝ համակարգը պարզեցնում է PMCA-ի աշխատանքային ընթացքները՝ միաժամանակ բոլոր փոսիկներում պահպանելով ուլտրաձայնային մշակման ճշգրիտ և միատեսակ պայմաններ։ Այս բարձր թողունակությունը նվազագույնի է հասցնում ձեռքով աշխատանքը, նվազեցնում աշխատատար քայլերը և ապահովում վերարտադրելիություն՝ սարքը դարձնելով անփոխարինելի գործիք պրիոնների հետազոտության համար։ Անկախ նրանից՝ հետազոտվում է քրոնիկ հյուծման հիվանդությունը, թե Կրոյցֆելդտ–Յակոբի հիվանդությունը, UIP400MTP սարքը հեշտացնում է լայնածավալ ուսումնասիրությունները՝ ավելի բարձր արդյունավետությամբ, ինչը հետազոտողներին հնարավորություն է տալիս բավարարել ժամանակակից ախտորոշիչ և գիտական կիրառությունների պահանջները։

---

---

Գրականություն / հղումներ

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.