PMCA՝ պրիոնների բարձր թողունակության հայտնաբերման համար՝ օգտագործելով UIP400MTP Sonicator

UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնագրիչն առաջարկում է հզոր լուծում սպիտակուցների սխալ ծալման ցիկլային ուժեղացման (PMCA) բարձր թողունակությամբ նմուշի պատրաստման համար: Տրամադրելով էներգիայի միասնական բաշխում բազմաթիվ հորերի միջով և պահպանելով ճշգրիտ ձայնային պարամետրերը, այս համակարգը հնարավորություն է տալիս միաժամանակ մշակել բազմաթիվ նմուշներ՝ բացառիկ վերարտադրելիությամբ: Այս հնարավորությունները չափազանց կարևոր են PMCA-ն օպտիմալացնելու համար՝ պրիոնները ցածր կոնցենտրացիաներում հայտնաբերելու դժվարին կենսաբանական նմուշներում, ինչպիսիք են թուքը, որտեղ վերլուծության ինհիբիտորները կարող են մթագնել արդյունքները:

Պրիոնի հիվանդությունները, ինչպիսիք են քրոնիկ վատթարացման հիվանդությունը (CWD) արգանդի վզիկի և Կրոյցֆելդ-Յակոբի հիվանդությունը (CJD) մարդկանց մոտ, նեյրոդեգեներատիվ խանգարումներ են, որոնք առաջանում են սխալ ծալված պրիոն սպիտակուցների (PrP) պատճառով:^գիտ) Այս հիվանդությունները հաճախ ներառում են վարակիչ պրիոնների ցածր մակարդակը մարմնի հեղուկներում, ինչպիսիք են թուքը, արյունը և մեզը, ինչը բարդացնում է ախտորոշումն ու հետազոտությունը: CWD-ի հորիզոնական փոխանցումը շրջակա միջավայրի մատրիցներում թափված պրիոնների միջոցով հատկապես կարևոր հետևանքներ ունի վայրի բնության կառավարման և էկոլոգիական առողջության վրա: Նմանապես, այնպիսի հիվանդությունների դեպքում, ինչպիսին է Կրոյցֆելդ-Յակոբ հիվանդությունը, մարդու նմուշներից սխալ ծալված պրիոնային սպիտակուցների հուսալի ուժեղացումը կարևոր է ախտորոշման առաջխաղացման և հիվանդության առաջընթացը հասկանալու համար:

Փոփոխված PMCA արձանագրության կիրառումը թույլ է տալիս շրջանցել ընդհանուր վերլուծության ինհիբիտորները (օրինակ՝ թքի մեջ առկա լորձաթաղանթները) և հասնել բարձր զգայունության պրիոնների հայտնաբերման հարցում, որոնք այլ կերպ աննկատելի կամ երկիմաստ կլինեն՝ օգտագործելով այնպիսի տեխնիկա, ինչպիսին է իրական ժամանակի ցնցումներից առաջացած փոխակերպումը (RT-QuIC): Այս առաջընթացները մեծացնում են պրիոնի հայտնաբերումը տարբեր հիվանդությունների դեպքում՝ PMCA-ն դարձնելով անփոխարինելի գործիք պրիոնի հետազոտության և ախտորոշման համար: UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնային սարքը հեշտացնում է բարձր թողունակության PMCA-ի արտահոսքը բազմաթիվ նմուշներ միկրոափսեներում (օրինակ՝ 6-, 24- կամ 96-հորանի ափսեներ) կամ սրվակները խողովակի դարակում:

Բարձր թողունակությամբ սպիտակուցի սխալ ծալվող ցիկլային ուժեղացման արձանագրություն (PMCA)

Հետևյալ արձանագրությունը թույլ է տալիս արդյունավետ մշակել նմուշների մեծ քանակությունը ճիշտ նույն պայմաններում՝ ամուր հետազոտության արդյունքների համար:

նմուշի պատրաստում

Մեկնարկային նյութ.
Պատրաստել նմուշները՝

• Սարկոզիլային արդյունահանման կարկուտների վերականգում PMCA սուբստրատում:
• Ուղեղի հոմոգենացում կամ արյան նմուշներ ուղղակիորեն ցատկելով պրիոնի սերմերով:

Substrate:

• Օգտագործեք 10% (wt/vol) ուղեղի հոմոգենատ, որը պատրաստված է տրանսգենային մկներից, որոնք չափազանց շատ են արտահայտում PrP^Գ (օրինակ, Tg մկներ):
• Համասեռացնել ուղեղի հյուսվածքը հետևյալում.
  – 1× PBS.
  – 150 մՄ NaCl:
  – 1% Triton X-100.
• Պահպանեք ենթաշերտը -80ºC ջերմաստիճանում մինչև օգտագործելը:

Նմուշի տեղադրում միկրոափսեի կամ խողովակների մեջ.
Խողովակներ:

• Ավելացնել 90 մկլ ուղեղի համասեռ նյութ և սերմացու 10 մկլ նմուշով (օրինակ՝ արյուն, ուղեղի համասեռ նյութ կամ սարկոզիլ գնդիկ):
• Յուրաքանչյուր 0,2 մլ խողովակի մեջ դրեք 3 տեֆլոնի հատիկներ (1,59 մմ կամ 2,38 մմ տրամագծով):
• Տեղադրեք խողովակները դարակի մեջ, որը համատեղելի է UIP400MTP sonicator-ի հետ:

6- Well Microplate:

• Ավելացրեք 5 մլ ուղեղի համասեռական սուբստրատ և սերմացրեք 500 մկլ նմուշի յուրաքանչյուր հորատանցք:
• Յուրաքանչյուր հորի մեջ ավելացրեք 3 տեֆլոնի ուլունք:

PMCA կարգը

Տեղադրում:
Տեղադրեք խողովակի դարակը կամ 6 հորանի միկրոսալիկը UIP400MTP ձայնային սարքի մեջ՝ համաձայն արտադրողի ցուցումների:

Հեծանվավազքի ծրագիր.
Կատարեք 144 PMCA ցիկլեր հետևյալ կերպ.

• Ինկուբացիա՝ 29 րոպե 30 վայրկյան 37°C ջերմաստիճանում:
• Sonication: 30 վայրկյան 60% ամպլիտուդով:
• Վերահսկել ջերմաստիճանը. Օգտագործեք խցանվող ջերմաստիճանի տվիչը՝ նմուշի ջերմաստիճանը վերահսկելու և UIP400MTP-ն առավելագույնը ծրագրավորելու համար: ջերմաստիճանը 48–50°C։

Հետագա տուրեր.
144 ցիկլերի առաջին փուլն ավարտելուց հետո փոխանցեք ուժեղացված նյութի մասնաբաժինը.

• 10-ապատիկ նոսրացրեք մկան ուղեղի համասեռ նյութի թարմ տրանսգենիկ նյութի մեջ:
• Կատարեք 96 PMCA ցիկլեր հետագա ռաունդների համար՝ պահպանելով նույն ձայնագրման պարամետրերը:
• Շարունակեք ցանկալի քանակությամբ ռաունդներ (սովորաբար մինչև 5):

PrP-ի հայտնաբերում^գիտ

1. Proteinase K Digestion:
   – Նմուշները մշակեք Proteinase K-ով (50 μg/mL) 37°C ջերմաստիճանում 1 ժամ:
   – Դադարեցրեք մարսողությունը՝ ավելացնելով SDS նմուշի բուֆեր և եռացնելով 10 րոպե:
2. Western Blot վերլուծություն.
   – Վերլուծեք մարսված նմուշները՝ օգտագործելով.
   – 6H4 կամ PRC1 հակա-PrP հակամարմիններ:
   – Կատարեք SDS-PAGE և տեղափոխեք PVDF մեմբրաններ հայտնաբերման համար:

 

 

Մշակեք ավելի շատ նմուշներ ավելի ամուր արդյունքների համար

UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնային սարքը զգալիորեն բարձրացնում է սպիտակուցի սխալ ծալվող ցիկլային ուժեղացման (PMCA) արդյունավետությունն ու մասշտաբայնությունը՝ անդրադառնալով ընթացակարգի ավանդաբար ժամանակատար բնույթին: Թույլ տալով մինչև 96 նմուշների միաժամանակյա մշակումը 96 ջրհորանոց ափսեում, համակարգը հեշտացնում է PMCA-ի աշխատանքային հոսքերը՝ միաժամանակ պահպանելով ճշգրիտ և միատեսակ ձայնային պայմաններ բոլոր հորերում: Բարձր թողունակության այս հնարավորությունը նվազագույնի է հասցնում ձեռքով աշխատելը, նվազեցնում է աշխատատար քայլերը և ապահովում վերարտադրելիությունը՝ դարձնելով այն անփոխարինելի գործիք պրիոնի հետազոտության համար: Անկախ նրանից, թե ուսումնասիրելով քրոնիկ վատթարացող հիվանդությունը, թե Քրոյցֆելդ-Յակոբ հիվանդությունը, UIP400MTP-ն նպաստում է լայնածավալ ուսումնասիրություններին ավելի մեծ արդյունավետությամբ՝ հնարավորություն տալով հետազոտողներին բավարարել ժամանակակից ախտորոշիչ և գիտական կիրառությունների պահանջները:

---

---

Գրականություն / Հղումներ

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.