Ultrazvučno potpomognuta fermentacija za proizvodnju bioetanola

Ultrazvučno potpomognuta fermentacija može poboljšati proizvodnju bioetanola poticanjem razgradnje složenih ugljikohidrata u jednostavnije šećere, čime oni postaju lakše dostupni kvascu za pretvorbu u etanol. Istodobno, sonikacija poboljšava i učinkovitost propusnosti stanične stijenke kvasca, omogućujući brže oslobađanje etanola i povećanje ukupne proizvodnje. Time ultrazvučno potpomognuta fermentacija bioetanola rezultira višim stopama pretvorbe i većim prinosima.

Fermentacija

Fermentacija može biti aerobni (= oksidativna fermentacija) ili anaerobni proces koji se primjenjuje u biotehnologiji za pretvorbu organskog materijala pomoću bakterijskih, gljivičnih ili drugih bioloških staničnih kultura ili enzima. Fermentacijom se energija dobiva iz oksidacije organskih spojeva, npr. ugljikohidrata.
Šećer je najčešći supstrat fermentacije, nakon koje nastaju proizvodi poput mliječne kiseline, laktoze, etanola i vodika. Pri alkoholnoj fermentaciji etanol se proizvodi fermentacijom – osobito za uporabu kao gorivo, ali i za alkoholna pića. Kada određeni sojevi kvasca, poput Saccharomyces cerevisiae , metaboliziraju šećer, stanice kvasca pretvaraju početni materijal u etanol i ugljikov dioksid.

Kemijske jednadžbe u nastavku sažeto prikazuju pretvorbu:

Ako je početni materijal škrob, npr. iz kukuruza, najprije se škrob mora pretvoriti u šećer. Za bioetanol koji se upotrebljava kao gorivo potrebna je hidroliza za pretvorbu škroba. Hidroliza se obično ubrzava kiselinskom ili enzimskom obradom ili kombinacijom obiju metoda. Fermentacija se obično provodi pri približno 35–40 °C.
Pregled različitih procesa fermentacije:

Hrana:

• proizvodnja & konzerviranje
• mliječni proizvodi (mliječno-kisela fermentacija), npr. jogurt, mlaćenica, kefir
• mliječno-kiselo fermentirano povrće, npr. kimchi, miso, natto, tsukemono, kiseli kupus
• razvoj aromatskih tvari, npr. umak od soje
• razgradnja tanina, npr. čaj, kakao, kava, duhan
• alkoholna pića, npr. pivo, vino, viski

Lijekovi:

• proizvodnja spojeva za medicinsku primjenu, npr. inzulina, hijaluronske kiseline

Bioplin/ Etanol:

• poboljšanje proizvodnje bioplina/ bioetanola

Različiti znanstveni radovi i ispitivanja na stolnoj i pilotnoj razini pokazali su da ultrazvuk poboljšava proces fermentacije povećanjem količine biomase dostupne za enzimsku fermentaciju. U sljedećem odjeljku detaljno će se opisati učinci ultrazvuka u tekućini.

Učinci ultrazvučne obrade tekućina

Ultrazvukom visoke snage/ niske frekvencije mogu se postići visoke amplitude. Stoga se ultrazvuk visoke snage/ niske frekvencije može upotrebljavati za obradu tekućina, poput miješanja, emulgiranja, dispergiranja i deaglomeracije ili mljevenja.
Pri sonikaciji tekućina visokim intenzitetima zvučni valovi koji se šire tekućim medijem uzrokuju naizmjenične cikluse visokog tlaka (kompresije) i niskog tlaka (razrjeđenja), čija brzina izmjene ovisi o frekvenciji. Tijekom ciklusa niskog tlaka ultrazvučni valovi visokog intenziteta stvaraju male vakuumske mjehuriće ili šupljine u tekućini. Kada mjehurići dosegnu volumen pri kojem više ne mogu apsorbirati energiju, naglo kolabiraju tijekom ciklusa visokog tlaka. Ta se pojava naziva kavitacijom. Kavitacija, odnosno “nastanak, rast i implozivni kolaps mjehurića u tekućini. Kavitacijski kolaps uzrokuje intenzivno lokalno zagrijavanje (~5000 K), visoke tlakove (~1000 atm) i goleme brzine zagrijavanja i hlađenja (>109 K/sec)” te mlazove tekućine (~400 km/h)”. (Suslick 1998)

Postoje različiti načini stvaranja kavitacije, primjerice visokotlačnim mlaznicama, miješalicama rotor–stator ili ultrazvučnim procesorima. U svim tim sustavima ulazna se energija pretvara u trenje, turbulenciju, valove i kavitaciju. Udio ulazne energije koji se pretvara u kavitaciju ovisi o nekoliko čimbenika koji opisuju gibanje opreme za stvaranje kavitacije u tekućini. Intenzitet ubrzanja jedan je od najvažnijih čimbenika koji utječu na učinkovitu pretvorbu energije u kavitaciju. Veće ubrzanje stvara veće razlike u tlaku. Time se povećava vjerojatnost stvaranja vakuumskih mjehurića umjesto valova koji se šire kroz tekućinu. Dakle, što je ubrzanje veće, to je veći udio energije koji se pretvara u kavitaciju.
Kod ultrazvučnog pretvornika amplituda titranja opisuje intenzitet ubrzanja. Veće amplitude dovode do učinkovitijeg stvaranja kavitacije. Osim intenziteta ubrzanja, važno je i da se tekućina ubrzava tako da gubici zbog turbulencije, trenja i stvaranja valova budu minimalni. Za to je optimalno gibanje u jednom smjeru. Promjenom intenziteta i parametara procesa sonikacije djelovanje ultrazvuka može biti vrlo intenzivno ili vrlo blago. Zbog toga je ultrazvuk vrlo svestran alat za različite primjene.

Blage primjene, pri kojima se primjenjuje blaga sonikacija u blagim uvjetima, uključuju otplinjavanje, emulgiranje i aktivaciju enzima. Intenzivne primjene ultrazvuka visokog intenziteta / velike snage (uglavnom pri povišenom tlaku) obuhvaćaju mokro mljevenje, deaglomeraciju i smanjenje veličine čestica te dispergiranje. Za mnoge primjene kao što su ekstrakcija, dezintegracija ili sonokemija, potreban intenzitet ultrazvuka ovisi o konkretnom materijalu koji se sonificira. Zahvaljujući raznovrsnim parametrima koji se mogu prilagoditi pojedinačnom procesu, ultrazvuk omogućuje pronalaženje optimalnih uvjeta za svaki pojedinačni proces.
Osim izvanredne pretvorbe snage, sonikacija nudi veliku prednost potpune kontrole nad najvažnijim parametrima: amplitudom, tlakom, temperaturom, viskoznošću i koncentracijom. To omogućuje prilagodbu svih tih parametara radi pronalaženja idealnih parametara obrade za svaki konkretni materijal. Time se postižu veća djelotvornost i optimizirana učinkovitost.

Ultrazvuk za poboljšanje procesa fermentacije, objašnjen na primjeru proizvodnje bioetanola

Bioetanol je proizvod razgradnje biomase ili biorazgradive tvari iz otpada djelovanjem anaerobnih ili aerobnih bakterija. Proizvedeni etanol uglavnom se upotrebljava kao biogorivo. Time bioetanol postaje obnovljiva i ekološki prihvatljiva alternativa fosilnim gorivima, kao što je prirodni plin.
Za proizvodnju etanola iz biomase kao sirovine mogu se upotrebljavati šećer, škrob i lignocelulozni materijal. U industrijskoj proizvodnji trenutačno prevladavaju šećer i škrob jer su ekonomski povoljni.
Kako ultrazvuk poboljšava proces prilagođen pojedinom kupcu s određenom sirovinom u zadanim uvjetima može se vrlo jednostavno ispitati ispitivanjima izvedivosti. U prvom koraku sonikacija male količine suspenzije sirovine ultrazvučnim laboratorijskim uređajem pokazat će utječe li ultrazvuk na sirovinu.

Ispitivanje izvedivosti

U prvoj fazi ispitivanja prikladno je unijeti relativno veliku količinu ultrazvučne energije u mali volumen tekućine jer se time povećava mogućnost da se utvrdi mogu li se postići ikakvi rezultati. Mali volumen uzorka također skraćuje vrijeme uporabe laboratorijskog uređaja i smanjuje troškove prvih ispitivanja.
Ultrazvučni valovi prenose se s površine sonotrode u tekućinu. Ispod površine sonotrode intenzitet ultrazvuka je najveći. Stoga su poželjne male udaljenosti između sonotrode i materijala koji se sonicira. Kada se ultrazvuku izlaže mali volumen tekućine, udaljenost od sonotrode može se održavati malom.
Tablica u nastavku prikazuje tipične vrijednosti omjera energije i volumena za postupke sonikacije nakon optimizacije. Budući da se prva ispitivanja neće provoditi pri optimalnoj konfiguraciji, intenzitet i trajanje sonikacije od 10 do 50 puta veći od tipične vrijednosti pokazat će postoji li ikakav učinak na sonicirani materijal.

Postupak	Energija/ Volumen	Volumen uzorka	Snaga	Vrijeme
Jednostavan	< 100Ws/mL	10mL	50W	< 20 sec
Srednje zahtjevan	100Ws/mL do 500Ws/mL	10mL	50W	20 do 100 sec
Zahtjevan	> 500Ws/mL	10mL	50W	>100 sec

Tablica 1 – Tipične vrijednosti sonikacije nakon optimizacije procesa

Stvarna ulazna snaga tijekom ispitivanja može se bilježiti putem integriranog sustava za bilježenje podataka (UP200Ht i UP200St), sučelja za osobno računalo ili mjerača snage. U kombinaciji sa zabilježenim podacima o postavci amplitude i temperaturi mogu se procijeniti rezultati svakog ispitivanja i utvrditi referentna vrijednost omjera energije i volumena.
Ako je tijekom ispitivanja odabrana optimalna konfiguracija, njezina bi se učinkovitost mogla provjeriti u koraku optimizacije te bi se naposljetku mogla povećati na komercijalno mjerilo. Kako bi se olakšala optimizacija, osobito se preporučuje ispitati i granice sonikacije, primjerice temperaturu, amplitudu ili omjer energije i volumena za određene formulacije. Budući da bi ultrazvuk mogao imati negativne učinke na stanice, kemikalije ili čestice, potrebno je ispitati kritične vrijednosti svakog parametra kako bi se naknadna optimizacija ograničila na raspon parametara u kojem se ne opažaju negativni učinci. Za studiju izvedivosti preporučuju se mali laboratorijski ili stolni uređaji kako bi se ograničili troškovi opreme i uzoraka u takvim ispitivanjima. Općenito, uređaji snage od 100 do 1.000 vata vrlo dobro služe svrhama studije izvedivosti. (usp. Hielscher 2005)

Optimizacija

Rezultati postignuti tijekom studija izvedivosti mogu pokazati prilično visoku potrošnju energije s obzirom na mali obrađeni volumen. No svrha ispitivanja izvedivosti prvenstveno je pokazati učinke ultrazvuka na materijal. Ako su se tijekom ispitivanja izvedivosti pojavili pozitivni učinci, potrebno je uložiti dodatne napore u optimizaciju omjera energije i volumena. To znači istražiti idealnu konfiguraciju ultrazvučnih parametara kako bi se postigao najveći prinos uz najmanju moguću potrošnju energije, čime proces postaje ekonomski najopravdaniji i najučinkovitiji. Kako bi se pronašla optimalna konfiguracija parametara – kojom se ostvaruju željene koristi uz minimalan unos energije – potrebno je istražiti povezanost između najvažnijih parametara: amplitude, tlaka, temperature i sastava tekućine . U ovom drugom koraku preporučuje se prijelaz sa šaržne sonikacije na sustav kontinuirane sonikacije s reaktorom s protočnom ćelijom jer se pri šaržnoj sonikaciji ne može utjecati na važan parametar tlaka. Tijekom šaržne sonikacije tlak je ograničen na tlak okoline. Ako se postupak sonikacije odvija u komori protočne ćelije u kojoj se može uspostaviti tlak, tlak se može povisiti (ili sniziti), što općenito drastično utječe na ultrazvučnu kavitaciju . Uporabom protočne ćelije može se utvrditi povezanost između tlaka i učinkovitosti procesa. Ultrazvučni procesori snage između 500 vata i 2000 vata najprikladniji su za optimizaciju procesa.

Povećanje mjerila do komercijalne proizvodnje

Ako je pronađena optimalna konfiguracija, daljnje povećanje mjerila jednostavno je jer su ultrazvučni procesi potpuno ponovljivi pri linearnom povećanju mjerila. To znači da je, kada se ultrazvuk primjenjuje na identičnu formulaciju tekućine uz identičnu konfiguraciju parametara obrade, za postizanje identičnog rezultata potrebna jednaka energija po volumenu, neovisno o mjerilu obrade. (Hielscher 2005). Time se omogućuje primjena optimalne konfiguracije ultrazvučnih parametara u proizvodnji u punom mjerilu. Volumen koji se može ultrazvučno obraditi praktički je neograničen. Dostupni su komercijalni ultrazvučni sustavi snage do 16.000 vata po jedinici koji se mogu instalirati u skupinama. Takve skupine ultrazvučnih procesora mogu se instalirati paralelno ili serijski. Instaliranjem ultrazvučnih procesora velike snage u skupinama ukupna je snaga gotovo neograničena, pa se tokovi velikog volumena mogu obrađivati bez problema. Ako je potrebna prilagodba ultrazvučnog sustava, npr. radi prilagodbe parametara izmijenjenoj formulaciji tekućine, to se uglavnom može postići zamjenom sonotrode, pojačivača amplitude ili protočne ćelije. Mogućnost linearnog povećanja mjerila, ponovljivost i prilagodljivost ultrazvuka čine ovu inovativnu tehnologiju učinkovitom i troškovno isplativom.

Parametri ultrazvučne obrade

Ultrazvučna obrada tekućina opisuje se nizom parametara. Najvažniji su amplituda, tlak, temperatura, viskoznost i koncentracija. Rezultat procesa, primjerice veličina čestica, za zadanu konfiguraciju parametara funkcija je energije po obrađenom volumenu. Funkcija se mijenja s promjenama pojedinih parametara. Nadalje, stvarna izlazna snaga po jedinici površine sonotrode ultrazvučnog uređaja ovisi o parametrima. Izlazna snaga po jedinici površine sonotrode jest površinski intenzitet (I). Površinski intenzitet ovisi o amplitudi (A), tlaku (p), volumenu reaktora (VR), temperaturi (T), viskoznosti (η) i drugim parametrima.

Učinak nastale kavitacije ovisi o površinskom intenzitetu. Na isti je način s njim povezan i rezultat procesa. Ukupna izlazna snaga ultrazvučnog uređaja umnožak je površinskog intenziteta (I) i površine (S):

P [W] I [W / mm²]* S[mm²]

Amplituda

Amplituda titranja opisuje put (npr. 50 µm) koji površina sonotrode prijeđe u zadanom vremenu (npr. 1/20.000s pri 20kHz). Što je amplituda veća, to je veća brzina smanjenja i povećanja tlaka pri svakom pomaku. Osim toga, pri svakom se pomaku povećava istisnuti volumen, što rezultira većim kavitacijskim volumenom (veličinom i/ili brojem mjehurića). Pri primjeni na disperzije veće amplitude imaju snažniji razorni učinak na čvrste čestice. Tablica 1 prikazuje opće vrijednosti za neke ultrazvučne procese.

Tlak

Vrelište tekućine ovisi o tlaku. Što je tlak viši, to je vrelište više, i obrnuto. Povišeni tlak omogućuje kavitaciju pri temperaturama blizu vrelišta ili iznad njega. Također povećava intenzitet implozije, koji je povezan s razlikom između statičkog tlaka i tlaka pare unutar mjehurića (usp. Vercet et al. 1999). Budući da se ultrazvučna snaga i intenzitet brzo mijenjaju s promjenama tlaka, prednost ima crpka koja održava konstantan tlak. Pri dovodu tekućine u protočnu ćeliju crpka bi trebala moći osigurati potreban protok tekućine pri odgovarajućim tlakovima. Dijafragmatske ili membranske crpke; crpke s fleksibilnom cijevi, crijevne ili stiskajuće crpke; peristaltičke crpke; ili klipne ili stapne crpke stvarat će naizmjenične fluktuacije tlaka. Prednost imaju centrifugalne crpke, zupčaste crpke, spiralne crpke i ekscentrične pužne crpke koje dovode tekućinu za sonikaciju pri stalno stabilnom tlaku. (Hielscher 2005)

Temperatura

Sonikacijom tekućine snaga se prenosi u medij. Budući da ultrazvučno generirane oscilacije uzrokuju turbulenciju i trenje, sonicirana tekućina – u skladu sa zakonom termodinamike – zagrijavat će se. Povišene temperature obrađivanog medija mogu razorno djelovati na materijal i smanjiti učinkovitost ultrazvučne kavitacije. Inovativne ultrazvučne protočne ćelije opremljene su rashladnim plaštem (vidi sliku). Time se omogućuje precizna kontrola temperature materijala tijekom ultrazvučne obrade. Za sonikaciju manjih volumena u laboratorijskoj čaši preporučuje se ledena kupelj za odvođenje topline.

Viskoznost i koncentracija

Ultrazvučno mljevenje i dispergiranje procesi su koji se odvijaju u tekućini. Čestice moraju biti u suspenziji, npr. u vodi, ulju, otapalima ili smolama. Upotrebom ultrazvučnih protočnih sustava postaje moguće sonicirati vrlo viskozan, pastozan materijal.
Ultrazvučni procesor velike snage može raditi pri prilično visokim koncentracijama krutih tvari. Visoka koncentracija osigurava učinkovitost ultrazvučne obrade jer učinak ultrazvučnog mljevenja proizlazi iz međusobnih sudara čestica. Istraživanja su pokazala da brzina usitnjavanja silicijeva dioksida ne ovisi o koncentraciji krutih tvari do 50% masenog udjela. Obrada koncentrata s visokim udjelom materijala uobičajen je proizvodni postupak u kojem se primjenjuje sonikacija.

Snaga i intenzitet u odnosu na energiju

Površinski intenzitet i ukupna snaga opisuju samo intenzitet obrade. Pri opisivanju procesa sonikacije potrebno je uzeti u obzir volumen soniciranog uzorka i vrijeme izlaganja pri određenom intenzitetu kako bi se omogućilo povećanje opsega procesa i njegova ponovljivost. Za zadanu konfiguraciju parametara rezultat procesa, npr. veličina čestica ili kemijska pretvorba, ovisit će o energiji po volumenu (E/V).

Rezultat = f (E /V )

Pri čemu je energija (E) umnožak izlazne snage (P) i vremena izlaganja (t).

E[Ws] = P[W]*t[s]

Promjene konfiguracije parametara promijenit će funkciju rezultata. To će pak promijeniti količinu energije (E) potrebnu za zadanu vrijednost uzorka (V) kako bi se postigla određena vrijednost rezultata. Zbog toga za postizanje rezultata nije dovoljno primijeniti određenu snagu ultrazvuka u procesu. Potreban je složeniji pristup kako bi se utvrdile potrebna snaga i konfiguracija parametara pri kojoj tu snagu treba prenijeti u materijal koji se obrađuje. (Hielscher 2005)

Proizvodnja bioetanola potpomognuta ultrazvukom

Već je poznato da ultrazvuk poboljšava proizvodnju bioetanola. Preporučuje se tekućinu zgusnuti biomasom do vrlo viskozne suspenzije koja se još uvijek može pumpati. Ultrazvučni reaktori mogu obrađivati prilično visoke koncentracije krutih tvari, pa se postupak sonikacije može provoditi najučinkovitije. Što je više materijala sadržano u suspenziji, to će se obrađivati manja količina noseće tekućine, koja nema koristi od postupka sonikacije. Budući da unos energije u tekućinu prema zakonu termodinamike uzrokuje zagrijavanje tekućine, to znači da se ultrazvučna energija u najvećoj mogućoj mjeri primjenjuje na ciljni materijal. Takvim učinkovitim oblikovanjem procesa izbjegava se nepotrebno zagrijavanje viška noseće tekućine.
Ultrazvuk potpomaže ekstrakciju unutarstaničnog materijala i time ga čini dostupnim za enzimsku fermentaciju. Blaga ultrazvučna obrada može povećati enzimsku aktivnost, ali za ekstrakciju biomase bit će potreban intenzivniji ultrazvuk. Stoga enzime treba dodati u suspenziju biomase nakon sonikacije jer intenzivan ultrazvuk inaktivira enzime, što je neželjen učinak.

Trenutačni rezultati znanstvenih istraživanja:

Istraživanja Yoswathana i sur. (2010) o proizvodnji bioetanola iz rižine slame pokazala su da kombinacija kiselinske predobrade i ultrazvučne obrade prije enzimske obrade dovodi do povećanog prinosa šećera do 44% (na osnovi rižine slame). To pokazuje učinkovitost kombinacije fizikalne i kemijske predobrade prije enzimske hidrolize lignoceluloznog materijala u šećer. 

Grafikon 2 grafički prikazuje pozitivne učinke ultrazvučnog ozračivanja tijekom proizvodnje bioetanola iz rižine slame. (Drveni ugljen upotrijebljen je za detoksikaciju uzoraka prethodno obrađenih kiselinskom/enzimskom predobradom i ultrazvučnom predobradom.)

U drugom nedavnom istraživanju ispitan je utjecaj sonikacije na izvanstanične i unutarstanične razine enzima β-galaktozidaze. Sulaiman i sur. (2011) uspjeli su znatno poboljšati produktivnost proizvodnje bioetanola primjenom ultrazvuka pri kontroliranoj temperaturi, čime su potaknuli rast kvasca Kluyveromyces marxianus (ATCC 46537). Autori rada zaključuju da je povremena sonikacija ultrazvukom velike snage (20 kHz) pri radnim ciklusima od ≤20% potaknula proizvodnju biomase, metabolizam laktoze i proizvodnju etanola u K. marxianus pri relativno visokom intenzitetu sonikacije od 11,8Wcm². U najboljim uvjetima sonikacija je povećala konačnu koncentraciju etanola gotovo 3,5 puta u odnosu na kontrolu. To je odgovaralo povećanju produktivnosti proizvodnje etanola od 3,5 puta, ali je zahtijevalo dodatni unos snage od 952W po kubičnom metru fermentacijske podloge putem sonikacije. Taj dodatni zahtjev za energijom svakako je bio unutar prihvatljivih radnih normi za bioreaktore, a za proizvode visoke vrijednosti mogao se lako nadoknaditi povećanom produktivnošću.

Zaključak: prednosti ultrazvučno potpomognute fermentacije

Ultrazvučna obrada pokazala se učinkovitom i inovativnom tehnikom za povećanje prinosa bioetanola. Ultrazvuk se prvenstveno upotrebljava za ekstrakciju unutarstaničnog materijala iz biomase, kao što su kukuruz, soja, slama, lignocelulozni materijal ili biljni otpadni materijali.

• Povećanje prinosa bioetanola
• Dezintegracija/razaranje stanica i oslobađanje unutarstaničnog materijala
• Poboljšana anaerobna razgradnja
• Aktivacija enzima blagom sonikacijom
• Poboljšanje učinkovitosti procesa primjenom suspenzija visoke koncentracije

Jednostavno ispitivanje, ponovljivo povećanje mjerila i jednostavna ugradnja (i u već postojeće proizvodne tokove) čine ultrazvučnu tehnologiju isplativom i učinkovitom. Dostupni su pouzdani industrijski ultrazvučni procesori za komercijalnu obradu koji omogućuju sonikaciju praktički neograničenih volumena tekućine.