ייצור אולטרסוני של בטא-גלוקנים מסוג סכיזופילן בדרגת טוהר גבוהה

סכיזופילן הוא β-גלוקן פטרייתי בעל תכונות מווסתות חיסון. כדי להשיג השפעות רפואיות בעלות פעילות גבוהה, סכיזופילן חייב להיות בעל משקל מולקולרי נמוך כדי להפגין זמינות ביולוגית משופרת. הוכח שטיפול אולטרסוני מפחית את המשקל המולקולרי של סכיזופילן. כשיטה אמינה ויעילה, ניתן ליישם סוניקציה בקלות לייצור סכיזופילן בעל משקל מולקולרי נמוך.

פטריות Schizophyllum ומיצוי אולטרסוני של בטא-גלוקן

מיני פטריות מהסוג Schizophyllum גדלים בטבע על עצים נרקבים לאחר עונות גשומות. גופי הפרי נאספים בעונה היבשה שלאחר מכן. מיני Schizophyllum עשירים בתרכובות ביוכימיות כגון גלוקנים, ולכן הם נצרכים כמזון וכתרופה, במיוחד במדינות טרופיות. בזכות תכונותיה מווסתות החיסון, נוגדות הפטריות, נוגדות הגידולים ונוגדות הנגיפים, Schizophyllum commune, הידועה גם כפטריית שסועית מצויה, משכה את תשומת ליבן של חברות ביוטכנולוגיה ותרופות.
הרב-סוכר סכיזופילן, הידוע גם בשם sizofiran, sonifilan או sizofilan, הוא ה-β-גלוקן העיקרי המצוי בפטריות Schizophyllum, המספקות את ה-β-גלוקן הביו-אקטיבי היעיל ביותר סכיזופילן.
פטריות Schizophyllum commune גדלות בטבע על עצים, וניתן לגדל גם את התפטיר במצע תסיסה נוזלי. ביישומים פרמצבטיים וקוסמטיים, סכיזופילן בעל משקל מולקולרי נמוך יעיל הרבה יותר מסכיזופילן בעל משקל מולקולרי גבוה. זאת משום שסכיזופילן בעל משקל מולקולרי נמוך מפגין זמינות ביולוגית ושיעורי ספיגה טובים יותר באופן משמעותי. נוסף על כך, סכיזופילן בעל משקל מולקולרי גבוה בעייתי לעיתים קרובות ביישומים, משום שהוא גורם לצמיגות גבוהה של תמיסותיו המימיות.
הקטנת גודל באמצעות אולטרסאונד היא טכניקה יעילה ביותר ואמינה להפחתת המשקל המולקולרי של סכיזופילן, ובכך לשיפור איכותה של מולקולת ה-β-גלוקן.

פרוטוקול לייצור סכיזופילן בעל משקל מולקולרי נמוך

מאחר שסכיזופילן בעל משקל מולקולרי מפגין זמינות ביולוגית ותכונות יישום טובות יותר באופן דרמטי, צוות המחקר של Smirnou בחן טיפול אולטרסוני לביקוע ולהקטנת הגודל של מולקולת ה-β-גלוקן סכיזופילן.

טיפול אולטרסוני בסכיזופילן

סכיזופילן (SPG), גלוקן מסוג β-1.3(1.6), יוצר באמצעות גידול הפטרייה S. commune בתרבית נוזלית בביוריאקטור, תוך שימוש בסוכרוז כמצע.
לאחר סיום הגידול, מצע התרבית הנוזלי דולל במים נטולי מינרלים לריכוז סכיזופילן של 2 g/L ועבר טיפול אולטרסוני באמצעות המעבד האולטרסוני UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, גרמניה) במצב סחרור חוזר, בפרמטרים ובתנאים הבאים: ספיקת זרימה של המדיום 50 mL/s, תדר 20 kHz, הספק מוצא 2000 W, סונוטרודה מסוג BS2d22, מגבר מסוג B2-1.4 ואמפליטודה 100%. טמפרטורת מצע התרבית הנוזלי בתחילת הסוניקציה הייתה 25°C. מצע התרבית הנוזלי שעבר טיפול אולטרסוני (תשומת אנרגיה סגולית 100 Ws/mL) סונן דרך מסנן עומק Seitz HS800 בלחץ של 1.5 bar ובטמפרטורה של 40°C. הסכיזופילן שעבר טיפול אולטרסוני (uSPG) לצורך אפיון כימי שוקע מהתסנין באמצעות כמות משולשת של איזופרופיל אלכוהול בטמפרטורת המעבדה, ויובש ב-60°C למשך 12h. תמיסות uSPG למחקרים אימונולוגיים הוכנו כדלקמן: (1) התסנין של מצע התרבית הנוזלי שעבר טיפול אולטרסוני עבר דיאפילטרציה דרך קסטת PES מסדרת T של Pall Centramate בשטח 0.1m2 (סף הפרדה 100 kDa) בלחץ של 0.8 bar, והדיאפילטרציה נמשכה עד שמוליכות הנוזל הנשאר הייתה 20 μS/cm; (2) התמיסה רוכזה באמצעות דיאפילטרציה לריכוז uSPG של 1 g/L ועוקרה באוטוקלב ב-120°C/20 min. uSPG שעבר דנטורציה הוכן באופן דומה, אלא ש-NaOH הוסף לתסנין של מצע התרבית הנוזלי בריכוז של 0.2 M, והתמיסה שהובססה הודגרה למשך 30 min בטמפרטורת המעבדה לפני הדיאפילטרציה.

שיטות אנליטיות

תפוקת התפטיר הוערכה בשיטה גרבימטרית: מצע התרבית הנוזלי דולל במים ביחס 1:4, סורכז ב־10,000 × g בטמפרטורה של 25°C במשך 20 min, והמשקע נשטף בכמות מים גדולה פי שלושה, יובש ב־60°C ונשקל. סכיזופילן שוקע מהנוזל העליון באמצעות כמות גדולה פי שלושה של איזופרופיל אלכוהול, יובש ב־60°C במשך 24h ותפוקתו נקבעה בשיטה גרבימטרית. pO2 במצע התרבית הנוזלי נמדד באמצעות גשוש אופטי Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, שווייץ).
הצמיגות הדינמית של מצע התרבית הנוזלי נמדדה במכשיר HAAKE Visco Tester 6L עם צירים 1L ו־2L ב־4°C ובמהירות סיבוב של 30 rpm. מהירות הסינון חושבה לפי זמן הסינון של 500 mL ממצע התרבית הנוזלי דרך מסנן עומק Seitz HS800 בגודל 200 × 200 mm (Pall, ארה״ב), בלחץ של 1.5 bar וב־40°C.
המשקל המולקולרי של uSPG נמדד באמצעות SEC-MALLS במערכת HPLC מסוג Alliance (Waters) עם עמודות PL aquagel OH60 ו־PL aquagel OH40 המחוברות בטור, והגלאי miniDAWN TREOS (Wyatt) רוכז באמצעות דיאפילטרציה לריכוז uSPG של 1 g/L ועוקר באוטוקלב ב־120°C/20 min. uSPG שעבר דנטורציה הוכן באופן דומה, אלא ש־NaOH נוסף לתסנין מצע התרבית בריכוז של 0.2 M והתמיסה שהובססה הודגרה במשך 30 min בטמפרטורת המעבדה לפני הדיאפילטרציה.

תוצאות:
הטיפול האולטרסוני יושם ישירות על מצע תרבית נוזלי של S. commune לאחר גידול של 144 שעות, עם התפטיר, כדי להקל על שלבי העיבוד בהמשך תהליך הפקת SPG.
 
מאפייני סכיזופילן שעבר סוניקציה: סכיזופילן שעבר טיפול אולטרסוני (uSPG) שוקע מתסנין מצע התרבית באמצעות אלכוהול ואופיין. באמצעות SEC-MALLS הוערך ה־Mw של uSPG בכ־1 MDa. המשקל המולקולרי הממוצע של סכיזופילן מתסיסה במצע נוזלי הוא כ־5 MDa, ואילו בגידול במצע מוצק הוא עשוי להגיע עד 10 MDa. בהשוואת המשקל המולקולרי של סכיזופילן שעבר טיפול אולטרסוני למשקלים המולקולריים של סכיזופילן טבעי שלא טופל, ניתן להבחין בירידה של פי 5 עד פי 10 במשקל המולקולרי בעקבות הטיפול האולטרסוני.
הרב־סוכר uSPG שעבר סוניקציה הכיל 0.7%w/w חלבון ו־1.0%w/w שארית לאחר שרפה. ההידרוליזט של uSPG הכיל יותר מ־99% גלוקוז. התוצאות האנליטיות מצביעות על כך שסוניקציה מבקעת את השלד של β-גלוקן באופן אקראי, בעוד שההסתעפויות הצדדיות נותרות שלמות, ובכך מפחיתה את גודלו ואת משקלו המולקולרי של סכיזופילן. מחקרים אימונולוגיים ב־uSPG שהיה למעשה נטול חלבון ואנדוטוקסינים הראו כי לסכיזופילן בעל Mw נמוך שעבר טיפול אולטרסוני יש פעילות מובהקת של ויסות מערכת החיסון.

 
הפחתת הצמיגות: הטיפול האולטרסוני הביא לירידה משמעותית בצמיגות מצע התרבית הנוזלי. במהלך הטיפול האולטרסוני השתנתה צמיגות מצע התרבית באופן לא ליניארי: הירידה בצמיגות הייתה מהירה בתחילת הטיפול האולטרסוני, אך בהמשך הואטה. תשומת אנרגיה סגולית של 100 Ws/mL הספיקה להפחתת צמיגות מצע התרבית כמעט פי 7.

שיפור הסינון: מצע התרבית הנוזלי שטופל באולטרסאונד עבר דרך המסנן מהר יותר ממצע התרבית הנוזלי שלא טופל (תשומת אנרגיה סגולית של 0 Ws/mL), שהכיל SPG בעל משקל מולקולרי גבוה. בנוסף, הסוניקציה הפחיתה במידה ניכרת את אובדן התוצר במהלך הסינון. התסנין של מצע התרבית הנוזלי שלא טופל והכיל SPG בעל משקל מולקולרי גבוה (תשומת אנרגיה סגולית של 0 Ws/mL) הכיל 0.3 ± 0.07 g/L של SPG, בעוד שריכוז ה-SPG לפני סינון העומק היה 2 g/L. לעומת זאת, התסנין של מצע התרבית הנוזלי שעבר סוניקציה בתשומת אנרגיה סגולית של 100 Ws/mL הכיל SPG בריכוז של 2.2 ± 0.2 g/L, נתון התואם אובדן תוצר כמעט אפסי.

מסקנה: במסקנתו מסכם צוות המחקר כי עיבוד אולטרסוני הוא טכנולוגיה יעילה לייצור סכיזופילן בעל משקל מולקולרי נמוך, שבו ניתן להשתמש לאחר מכן בקוסמטיקה וברפואה. סוניקציה של מצע התרבית הנוזלי בשלמותו, כולל התפטיר, מעניקה יתרונות מסוימים לייצור סכיזופילן. היא מפחיתה אובדן תוצר בשלבי העיבוד שלאחר הגידול ומאפשרת ייצור של רב-סוכר בדרגת טוהר גבוהה הודות לשימוש יעיל באולטרה-פילטרציה.
בנוסף, החוקרים מצאו כי ניתן להגדיל בקלות את קנה המידה של העיבוד האולטרסוני של סכיזופילן. יחידה אחת של המפרק האולטרסוני UIP2000hdT במתקן הפיילוט עיבדה 1 ליטר של מצע תרבית נוזלי בתוך 110 s במצב זרימה. ניתן להגדיל בקלות את תפוקת המערכת באמצעות חיבור טורי של יחידות אולטרסאונד נוספות.

 
קראו עוד על הגדלת קנה המידה הפשוטה של מיצוי מפטריות!
 

ציוד אולטרסוני בעל ביצועים גבוהים לעיבוד גלוקנים מפטריות

ניתן לבצע באופן אמין פירוק למקטעים של רב-סוכרים כגון גלוקנים, וכן של תרכובות ביו-אקטיביות אחרות כגון כיטין וכיטוזן, באמצעות הציוד האולטרסוני בעל הביצועים הגבוהים של Hielscher. מכשירי האולטרסאונד שלנו יכולים לספק משרעות גבוהות, מאפשרים שליטה מדויקת בפרמטרים של התהליך וניתנים להפעלה 24/7 בעומס כבד ובסביבות תובעניות. מגוון הציוד של Hielscher Ultrasonics עומד בדרישות אלה באופן אמין. לצד ביצועי אולטרסאונד יוצאי דופן, מכשירי האולטרסאונד של Hielscher מתאפיינים ביעילות אנרגטית גבוהה, המהווה יתרון כלכלי משמעותי – במיוחד בשימוש בייצור מסחרי בקנה מידה גדול.
מכשירי האולטרסאונד של Hielscher הם מערכות בעלות ביצועים גבוהים, שניתן לצייד באביזרים כגון סונוטרודות, מגברי משרעת, ריאקטורים או תאי זרימה כדי להתאים אותם באופן מיטבי לצורכי התהליך שלכם.
תצוגה דיגיטלית צבעונית, אפשרות לתכנות מראש של מחזורי סוניקציה, רישום נתונים אוטומטי בכרטיס SD מובנה, שליטה מרחוק באמצעות דפדפן ותכונות רבות נוספות מבטיחים שליטה בתהליך וידידותיות למשתמש ברמה הגבוהה ביותר. בשילוב עם עמידות ויכולת לשאת עומסים כבדים, מערכות האולטרסאונד של Hielscher הן סוס העבודה האמין שלכם בייצור.
הפחתת המשקל המולקולרי של β-גלוקנים כגון סכיזופילן דורשת אולטרסאונד רב-עוצמה כדי להשיג את הביקוע הרצוי ותוצר סופי של סכיזופילן באיכות גבוהה, שניתן להשתמש בו ביישומים פרמצבטיים.
 
כאן תמצאו מידע נוסף על מיצוי אולטרסוני של בטא-גלוקנים מפטריות, כולל הוראות שלב אחר שלב!
 
הטבלה שלהלן מציגה את קיבולת העיבוד המשוערת של המכשירים האולטרסוניים שלנו: