ייצור על-קולי של סכיזופילן בטא-גלוקנים מטוהרים במיוחד

סכיזופילן הוא β-גלוקן פטרייתי בעל תכונות אימונומודולציה. עבור השפעות רפואיות פעילות מאוד, סכיזופילן חייב להיות בעל משקל מולקולרי נמוך על מנת להראות זמינות ביולוגית משופרת. אולטרסוניקציה הוכחה כמפחיתה את המשקל המולקולרי של סכיזופילן. כשיטה אמינה ויעילה, סוניקציה יכולה להיות מיושמת בקלות לייצור סכיזופילן במשקל מולקולרי נמוך.

פטריות סכיזופילום ומיצוי בטא-גלוקן על-קולי

מינים של פטריית סכיזופילום גדלים בטבע על עצים נרקבים לאחר עונות גשומות. גופי הפרי נאספים בעונה היבשה הבאה. מיני סכיזופילום עשירים בתרכובות ביוכימיות כגון גלוקנים ולכן נצרכים במיוחד במדינות טרופיות כמזון ותרופות. בשל תכונותיה האימונומודולטוריות, האנטי-פטרייתיות, האנטינאופלסטיות והאנטי-ויראליות, קומונה סכיזופילום, הידועה גם בשם פטריית ספליטגיל, משכה חברות ביוטק ותרופות.
סכיזופילן רב-סוכרי (באנגלית: polysaccharide schizophyllan), הידוע גם בשם סיזופירן (sizofiran), סוניפילן (sonifilan) או סיזופילן (sizofilan), הוא ה-β-גלוקן העיקרי המצוי בפטריות סכיזופילום, אשר מציעות את הסכיזופילן β-גלוקן הביו-אקטיבי היעיל ביותר.
פטריות קומונה סכיזופילום גדלות בטבע על עצים, התפטיר יכול להיות מתורבת גם בציר תסיסה. עבור יישומים פרמצבטיים וקוסמטיים, סכיזופילן במשקל מולקולרי נמוך הוא הרבה יותר יעיל מאשר סכיזופילן במשקל מולקולרי גבוה. זאת בשל העובדה כי סכיזופילן במשקל מולקולרי נמוך מראה זמינות ביולוגית טובה יותר באופן משמעותי ושיעורי ספיגה. מבחינה אדיציונית, סכיזופילן במשקל מולקולרי גבוה הוא לעתים קרובות בעייתי ביישומים מכיוון שהוא גורם לצמיגות גבוהה של התמיסות המימיות שלו.
הפחתת גודל קולי היא טכניקה יעילה ואמינה ביותר כדי להפחית את המשקל המולקולרי של סכיזופילן, ובכך להגדיל את האיכות של מולקולת β-גלוקן.

פרוטוקול לייצור סכיזופילן בעל משקל מולקולרי נמוך

מכיוון שסכיזופילן בעל משקל מולקולרי מדגים זמינות ביולוגית טובה יותר באופן דרסטי ותכונות יישום, צוות המחקר של סמירנו חקר אולטרסוניקציה להפחתת המחשוף והגודל של מולקולת ה-β-גלוקן סכיזופילן.

אולטרסוניקציה של סכיזופילן

β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) הופק על ידי גידול שקוע של פטריית S. commune בביוריאקטור תוך שימוש בסוכרוז כמצע.
לאחר סיום הגידול, מרק תרבית היה מדולל עם מים demineralized לריכוז סכיזופילן 2 גרם / ליטר ו ultrasoniced עם מעבד קולי UIP2000HDT (Hielscher Ultrasonics GmbH, גרמניה) במצב מיחזור בפרמטרים ובתנאים הבאים: זרימה בינונית 50 מ"ל/שנייה, תדר 20 קילוהרץ, פלט 2000 W, סוג סונוטרודה BS2d22, סוג מאיץ B2-1.4 ומשרעת 100%. טמפרטורת מרק התרבית בתחילת הסוניק הייתה 25 מעלות צלזיוס. ציר התרבית העל-קולי (קלט אנרגיה ספציפי 100 Ws/mL) סונן דרך מסנן עומק Seitz HS800 תחת לחץ של 1.5 בר ב-40°C. סכיזופילן אולטרה-סוני (uSPG) לאפיון כימי הואץ מהתסנין עם כמות משולשת של אלכוהול איזופרופיל בטמפרטורת מעבדה, וייבש ב-60 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות תמיסות uSPG למחקרים אימונולוגיים הוכנו כדלקמן: (1) תסנין מרק התרבית העל-קולי עבר סינון דרך קלטת PES מסדרת Pall Centramate T בגודל 0.1 מ"ר (חיתוך של 100 kDa ) ב-0.8 בר והדיאפילטרציה נמשכה עד שמוליכות החזרה הייתה 20 μS/cm; (2) התמיסה רוכזה על ידי דיאסינון לריכוז uSPG 1 גרם / ליטר ועוקרה על ידי autoclaving ב 120 ° C / 20 דקות. uSPG מפורק הוכן באופן דומה, אלא ש-NaOH נוסף לתסנין מרק התרבית בריכוז 0.2 מ' והתמיסה האלקלית הודגרה במשך 30 דקות בטמפרטורת מעבדה לפני הדיאפילטרציה.

שיטות אנליטיות

תפוקת התפטיר הוערכה בכבידה: ציר תרבית נמהל במים ביחס של 1:4, צנטריפוגה של 10,000 × גרם ב-25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, המשקע נשטף בכמות משולשת של מים, יובש ב-60 מעלות צלזיוס ושוקלל. סכיזופילן הוזרז מסופרנאטנט עם כמות משולשת של אלכוהול איזופרופיל, יובש ב-60 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ותפוקתו נקבעה באופן כבידתי. pO2 במרק התרבית נמדד על ידי הגשושית האופטית Hamilton-Visiferm DO 120 (המילטון, שוויץ).
צמיגות דינמית של מרק תרבית נמדדה ב-HAAKE Visco Tester 6L עם צירים 1L ו-2L ב-4°C ומהירות סיבוב של 30 סל"ד. מהירות הסינון חושבה מזמן הסינון של מרק תרבית 500 מ"ל ועד מסנן עומק 200 × 200 מ"מ Seitz HS800 (פאל, ארה"ב) בלחץ של 1.5 בר ו-40 מעלות צלזיוס.
המשקל המולקולרי של uSPG נמדד על ידי SEC-MALLS במערכת HPLC Alliance (Waters) עם עמודות PL aquagel OH60 ו-PL aquagel OH40 המחוברות לסדרות, והגלאי miniDAWN TREOS (Wyatt) רוכז על ידי דיאפילטרציה לריכוז uSPG 1 גרם/ליטר ועוקר על ידי אוטוקלאבינג ב-120°C/20 דקות. uSPG מפורק הוכן באופן דומה, אלא ש-NaOH נוסף לתסנין מרק התרבית בריכוז 0.2 מ' והתמיסה האלקלית הודגרה במשך 30 דקות בטמפרטורת מעבדה לפני הדיאפילטרציה.

תוצאות:
הטיפול באולטרסוניקציה הוחל ישירות על מרק תרבית S. commune 144-h עם תפטיר כדי להקל על עיבוד SPG במורד הזרם.
 
מאפיינים של סכיזופילן סוני: סכיזופילן אולטרה-סוני (uSPG) הוזרז מתסנין מרק תרבית על ידי אלכוהול ואופיין. SEC-MALLS העריכה כי Mw של uSPG הוא סביב 1 MDa. המשקל המולקולרי הממוצע של סכיזופילן מתסיסה נוזלית הוא כ-5 MDa, בעוד שבגידול מצב מוצק הוא עשוי להגיע עד 10 MDa. השוואת המשקל המולקולרי של סכיזופילן אולטרה-סוני עם המשקלים המולקולריים של סכיזופילן טבעי לא מטופל, ניתן לראות משקל מולקולרי מופחת פי 5 עד פי 10 עקב אולטרה-סוניקציה.
uSPG הרב-סוכרי הסוני הכיל חלבון 0.7%w/w ושאריות של 1.0%w/w לאחר ההצתה. uSPG הידרוליזה כללה גלוקוז עם יותר מ 99%. התוצאות האנליטיות מצביעות על כך שסוניקציה חותכת את עמוד השדרה β-גלוקן באופן אקראי והענפים הצדדיים נשארים שלמים ובכך מפחיתים את הגודל והמשקל המולקולרי של סכיזופילן. מחקרים אימונולוגיים על uSPG נטול חלבון ואנדוטוקסין הראו, כי סכיזופילן אולטרה-סוני בעל מגה-וואט נמוך הדגים פעילות אימונומודולטורית מובהקת.

 
צמיגות מופחתת: אולטרה-סוניקציה הביאה לירידה משמעותית בצמיגות מרק התרבית. במהלך האולטרה-סוניקציה, צמיגות מרק התרבית השתנתה באופן לא ליניארי: ירידת הצמיגות הייתה מהירה בתחילת האולטרה-סוניקציה, אך מאוחר יותר היא האטה. קלט אנרגיה ספציפי 100 Ws/mL הספיק כדי להפחית את צמיגות מרק התרבית כמעט פי 7.

סינון משופר: מרק התרבית שטופל באולטרסאונד זרם דרך הפילטר מהר יותר מאשר מרק התרבית הלא מטופל (קלט אנרגיה ספציפי 0 Ws/mL) עם SPG מולקולרי גבוה. חוץ מזה, ultrasonication הפחית באופן משמעותי אובדן המוצר במהלך סינון. התסנין של מרק תרבית לא מטופל עם SPG מולקולרי גבוה (קלט אנרגיה ספציפי 0 Ws/mL) הכיל 0.3 ± 0.07 גרם / L SPG, בעוד ריכוז SPG לפני סינון עומק היה 2 גרם / ליטר. לעומת זאת, התסנין של תרבית אולטרסונית 100 Ws/mL הכיל SPG בריכוז 2.2 ± 0.2 גרם לליטר, המתאים לאובדן מוצר כמעט אפסי.

מסקנה: במסקנתם צוות המחקר חוזר כי עיבוד קולי הוא טכנולוגיה יעילה לייצור סכיזופילן במשקל מולקולרי נמוך, אשר לאחר מכן יכול לשמש קוסמטיקה ורפואה. Ultrasonication, כאשר מוחל על מרק תרבית מלאה עם תפטיר, מביא יתרונות מסוימים לייצור סכיזופילן. הוא מפחית את הפסדי המוצר במהלך עיבוד במורד הזרם ומאפשר ייצור של פוליסכריד מטוהר מאוד הודות לשימוש יעיל באולטרה-סינון.
בנוסף, החוקרים מצאו כי עיבוד קולי של סכיזופילן ניתן להרחבה בקלות. יחידה אחת של מפעל הפיילוט מפרק קולי UIP2000hdT עיבד 1 ליטר מרק תרבית ב 110 s במצב זרימה. הפרודוקטיביות של המערכת ניתן להגדיל בקלות על ידי חיבור רציף של יחידות אולטרסאונד נוספות.

 
קראו עוד על ההרחבה הפשוטה של מיצוי פטריות!
 

ציוד קולי בעל ביצועים גבוהים לעיבוד גלוקן פטרייתי

פיצול של סוכרים כגון גלוקנים, כמו גם תרכובות ביו-אקטיביות אחרות כגון chitin ו chitosan יכול להיות תהליכים אמינים עם ציוד קולי ביצועים גבוהים Hielscher. האולטרסוניקטורים שלנו יכולים לספק אמפליטודות גבוהות, מציעים יכולת שליטה מדויקת על פרמטרי התהליך וניתן להפעיל אותם 24/7 תחת עומס כבד ובסביבות תובעניות. טווח ציוד Hielscher Ultrasonics ממלא דרישות אלה בצורה אמינה. מלבד ביצועי אולטרסאונד מצטיינים, אולטרסוניקטורים Hielscher להתפאר יעילות אנרגיה גבוהה, המהווה יתרון כלכלי משמעותי – במיוחד כאשר מועסקים על ייצור מסחרי בקנה מידה גדול.
Hielscher ultrasonicators הם מערכות ביצועים גבוהים שניתן לצייד עם אביזרים כגון sonotrodes, מאיצים, כורים או תאי זרימה על מנת להתאים את צרכי התהליך שלך בצורה אופטימלית. עם תצוגת צבע דיגיטלית, האפשרות להגדיר מראש ריצות סוניקציה, הקלטת נתונים אוטומטית על כרטיס SD משולב, בקרת דפדפן מרחוק ותכונות רבות נוספות, בקרת התהליך הגבוהה ביותר וידידותיות למשתמש מובטחים. בשילוב עם חוסן ויכולת נשיאת עומס כבדה, מערכות קוליות Hielscher הן סוס העבודה האמין שלך בייצור. הפחתת המשקל המולקולרי של β-גלוקנים כגון סכיזופילן דורשת אולטרסאונד רב עוצמה כדי להשיג את המחשוף הממוקד ומוצר סכיזופילן סופי באיכות גבוהה, אשר יכול לשמש ליישומים פרמצבטיים.
 
ניתן למצוא מידע נוסף על מיצוי בטא-גלוקן על-קולי מפטריות כולל הוראות שלב אחר שלב כאן!
 
הטבלה הבאה נותנת לך אינדיקציה ליכולת העיבוד המשוערת של האולטרסאונד שלנו: