דה־אצטילציה אולטרסונית של כיטין לכיטוזן

כיטוזן הוא ביופולימר המופק מכיטין, בעל יישומים רבים בתחומי התרופות, המזון, החקלאות והתעשייה. דה־אצטילציה אולטרסונית של כיטין לכיטוזן מגבירה משמעותית את עוצמת הטיפול – ומובילה לתהליך יעיל ומהיר עם תפוקה גבוהה של כיטוזן באיכות מעולה.

ייצור אולטרסוני של כיטוזן

כיטוזן מתקבל באמצעות N-דה־אצטילציה של כיטין. בדה־אצטילציה קונבנציונלית, כיטין מושרה בממסים בסיסיים מימיים (בדרך כלל 40 עד 50% (w/w) NaOH). תהליך ההשריה דורש טמפרטורות גבוהות של 100 עד 120ºC וגוזל זמן רב מאוד, בעוד שתפוקת הכיטוזן המתקבלת בכל שלב השריה נמוכה. השימוש באולטרסאונד בהספק גבוה מגביר משמעותית את עוצמת תהליך הדה־אצטילציה של כיטין ומניב תפוקה גבוהה של כיטוזן בעל משקל מולקולרי נמוך בטיפול מהיר בטמפרטורה נמוכה יותר. דה־אצטילציה אולטרסונית מניבה כיטוזן באיכות מעולה, המשמש כרכיב במזון ובתרופות, כדשן וביישומים תעשייתיים רבים נוספים.
טיפול אולטרסוני מביא לדרגת אצטילציה (DA) יוצאת דופן של כיטין, תוך הפחתת דרגת האצטילציה מכיטין עם DA≥90 לכיטוזן עם DA≤10.
מחקרים רבים מאשרים את יעילות הדה־אצטילציה האולטרסונית של כיטין לכיטוזן. Weiss J. ועמיתיו (2008) מצאו שסוניקציה משפרת באופן דרסטי את המרת הכיטין לכיטוזן. הטיפול האולטרסוני בכיטין מאפשר חיסכון משמעותי בזמן ומקצר את זמן התהליך הנדרש מ־12–24 שעות לשעות ספורות. יתרה מזאת, נדרשת כמות קטנה יותר של ממס להשגת המרה מלאה, דבר המפחית את ההשפעה הסביבתית הכרוכה בסילוק ובפינוי הממס המשומש או הממס שלא הגיב, כלומר NaOH מרוכז.

סוניקציה מקדמת דה־אצטילציה של כיטין לכיטוזן

מכשיר אולטרסוני בעל ביצועים גבוהים UIP4000hdT ליישומים תעשייתיים

UIP4000hdT – מערכת אולטרסונית בהספק של 4kW

עקרון הפעולה של טיפול אולטרסוני בכיטוזן

סוניקציה בהספק גבוה ובתדירות נמוכה (∼20–26kHz) יוצרת קוויטציה אקוסטית בנוזלים ובתרחיפים. אולטרסאונד בהספק גבוה מקדם את המרת הכיטין לכיטוזן, שכן הממס (למשל NaOH) מפרק את חלקיקי הכיטין המוצקים וחודר לתוכם, ובכך מגדיל את שטח הפנים ומשפר את מעבר המסה בין הפאזה המוצקה לפאזה הנוזלית. יתרה מזאת, כוחות הגזירה הגבוהים של הקוויטציה האולטרסונית יוצרים רדיקלים חופשיים המגבירים את התגובתיות של המגיב (כלומר NaOH) במהלך ההידרוליזה. כטכניקת עיבוד שאינה תרמית, סוניקציה מונעת פירוק תרמי ומניבה כיטוזן באיכות גבוהה. אולטרסאונד מקצר את זמני העיבוד הנדרשים להפקת כיטין מסרטנאים וכן מניב כיטין (ולפיכך, בהמשך, גם כיטוזן) ברמת טוהר גבוהה יותר בהשוואה לתנאי עיבוד מסורתיים. לפיכך, בייצור כיטין וכיטוזן, לאולטרסאונד יש פוטנציאל להוזיל את עלויות הייצור, לקצר את זמן העיבוד, לאפשר שליטה טובה יותר בתהליך הייצור ולהפחית את ההשפעה הסביבתית של פסולת התהליך.

יתרונות הייצור האולטרסוני של כיטוזן

תפוקת כיטוזן גבוהה יותר
איכות מעולה
זמן מקוצר
טמפרטורת תהליך נמוכה יותר
יעילות מוגברת
הפעלה קלה ובטוחה
ידידותי לסביבה

דה־אצטילציה אולטרסונית של כיטין לכיטוזן – פרוטוקול

1) הכנת הכיטין:
כאשר משתמשים בשריונות סרטנים כחומר מוצא, יש לשטוף אותם היטב כדי להסיר חומרים אורגניים מסיסים וזיהומים הדבוקים אליהם, לרבות אדמה וחלבון. לאחר מכן יש לייבש את חומר השריונות לחלוטין (למשל, ב־60ºC למשך 24h בתנור). לאחר מכן טוחנים את השריונות המיובשים (למשל באמצעות טחנת פטישים), מסירים מהם חלבונים בתווך בסיסי (למשל NaOH בריכוז של 0.125 עד 5.0 M), ומסירים מהם מינרלים באמצעות חומצה (למשל חומצה הידרוכלורית מהולה).
2) דה־אצטילציה אולטרסונית
לביצוע תגובת דה־אצטילציה אולטרסונית טיפוסית, מרחיפים חלקיקי בטא־כיטין (0.125 mm < d < 0.250 mm) בתמיסה מימית של 40% (w/w) NaOH ביחס של בטא־כיטין לתמיסת NaOH מימית של 1/10(g mL^-1), התרחיף מועבר לכוס כימית מזכוכית בעלת דופן כפולה ועובר סוניקציה באמצעות הומוגנייזר אולטרסוני של Hielscher מדגם UP400St . הפרמטרים הבאים (ראו Fiamingo et al. 2016) נשמרים קבועים בעת ביצוע תגובת דה־אצטילציה אולטרסונית של כיטין: (i) גשוש אולטרסוני (סונוטרודה Hielscher S24d22D, קוטר הקצה = 22 mm); (ii) מצב פולסים של סוניקציה (IP = 0.5sec); (iii) עוצמה אולטרסונית ליחידת שטח
(I = 52.6 W cm^-2), (iv) טמפרטורת התגובה (60ºC ±1ºC), (v) זמן התגובה (50 min), (vi) יחס משקל בטא־כיטין לנפח תמיסה מימית של נתרן הידרוקסידי בריכוז 40% (w/w) (BCHt/NaOH = 1/10 g mL^-1); (vii) נפח תרחיף הבטא־כיטין (50mL).
התגובה הראשונה נמשכת 50min תוך ערבול מגנטי מתמיד, ולאחר מכן מופסקת באמצעות קירור מהיר של התרחיף ל־0ºC. לאחר מכן מוסיפים חומצה הידרוכלורית מדוללת עד להשגת pH 8.5, והדגימה CHs1 מבודדת באמצעות סינון, נשטפת ביסודיות במים נטולי יונים ומיובשת בתנאי הסביבה. כאשר חוזרים על אותה דה־אצטילציה אולטרסונית כשלב שני על CHs1, מתקבלת הדגימה CHs2.

תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM) בהגדלה של 100× של א) גלדיוס, ב) גלדיוס שטופל באולטרסאונד, ג) β־כיטין, ד) β־כיטין שטופל באולטרסאונד, ו־ה) כיטוזן (מקור: Preto et al. 2017)

Fiamingo ועמיתיו מצאו כי דה־אצטילציה אולטרסונית של בטא־כיטין מייצרת ביעילות כיטוזן בעל משקל מולקולרי גבוה ודרגת אצטילציה נמוכה, ללא שימוש בתוספים, ללא אטמוספרה אינרטית וללא זמני תגובה ארוכים. זאת אף שתגובת הדה־אצטילציה האולטרסונית מתבצעת בתנאים מתונים יותר – כלומר בטמפרטורת תגובה נמוכה בהשוואה לרוב תהליכי הדה־אצטילציה התרמוכימיים. הדה־אצטילציה האולטרסונית של בטא־כיטין מאפשרת הכנת כיטוזן שעבר דה־אצטילציה באתרים אקראיים, בעל דרגת אצטילציה משתנה (4% ≤ DA ≤ 37%), משקל מולקולרי ממוצע משקלי גבוה (900,000 g mol^-1 ≤ M_w ≤ 1,200,000 g mol^-1 ) ופיזוריות נמוכה (1.3 ≤ Ð ≤ 1.4), באמצעות ביצוע שלוש תגובות רצופות (50 min/שלב) ב־60ºC.

Hielscher Ultrasonics מייצרת מכשירים אולטרסוניים בעלי ביצועים גבוהים ליישומים סונוכימיים.

מעבדים אולטרסוניים בהספק גבוה, מקנה מידה מעבדתי ועד קנה מידה של פיילוט ותעשייה.

מערכות אולטרסוניות בעלות ביצועים גבוהים לייצור כיטוזן

פירוק הכיטין למקטעים והדה־אצטילציה של כיטין לכיטוזן דורשים ציוד אולטרסוני רב־עוצמה ואמין, המסוגל לספק אמפליטודות גבוהות, מאפשר שליטה מדויקת בפרמטרים של התהליך ויכול לפעול 24/7 בעומס כבד ובסביבות תובעניות. מגוון המוצרים של Hielscher Ultrasonics נותן מענה לכם ולדרישות התהליך שלכם. המכשירים האולטרסוניים של Hielscher הם מערכות בעלות ביצועים גבוהים, שניתן לצייד באביזרים כגון סונוטרודות, מגברי אמפליטודה, ריאקטורים או תאי זרימה, כדי להתאים לצורכי התהליך שלכם באופן מיטבי.
תצוגה דיגיטלית צבעונית, אפשרות לתכנות מראש של מחזורי סוניקציה, רישום נתונים אוטומטי בכרטיס SD משולב, שליטה מרחוק באמצעות דפדפן ותכונות רבות נוספות מבטיחים את הרמה הגבוהה ביותר של שליטה בתהליך ונוחות שימוש. בשילוב עמידות ויכולת לשאת עומסים כבדים, המערכות האולטרסוניות של Hielscher הן סוס העבודה האמין שלכם בייצור.
פירוק כיטין למקטעים ודה־אצטילציה שלו דורשים אולטרסאונד רב־עוצמה כדי להשיג את ההמרה המבוקשת ותוצר כיטוזן סופי באיכות גבוהה. במיוחד לצורך פירוק פתיתי הכיטין למקטעים, אמפליטודות גבוהות ולחצים מוגברים הם חיוניים. המעבדים האולטרסוניים התעשייתיים של Hielscher Ultrasonics מספקים בקלות אמפליטודות גבוהות מאוד. ניתן להפעיל ברציפות אמפליטודות של עד 200µm בפעולה של 24/7. לאמפליטודות גבוהות אף יותר, זמינות סונוטרודות אולטרסוניות מותאמות אישית. יכולת ההספק של המערכות האולטרסוניות של Hielscher מאפשרת דה־אצטילציה יעילה ומהירה בתהליך בטוח וידידותי למשתמש.

הטבלה שלהלן נותנת מושג על קיבולת העיבוד המשוערת של המכשירים האולטרסוניים שלנו:

נפח אצווה	ספיקת זרימה	מכשירים מומלצים
1 עד 500mL	10 עד 200mL/min	UP100H
10 עד 2000mL	20 עד 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0.1 עד 20L	0.2 עד 4L/min	UIP2000hdT
10 עד 100L	2 עד 10L/min	UIP4000hdT
n.a.	10 עד 100L/min	UIP16000
n.a.	גבוהה יותר	אשכול של UIP16000

צרו איתנו קשר! / שאלו אותנו!

ספרות ומקורות

Butnaru E., Stoleru E., Brebu M.A., Darie-Nita R.N., Bargan A., Vasile C. (2019): יריעות ננו־מרוכבות ביולוגיות על בסיס כיטוזן שהוכנו בטכניקת אמולסיה לשימור מזון. Materials 2019, 12(3), 373.
Fiamingo A., de Moura Delezuk J.A., Trombotto St. David L., Campana-Filho S.P. (2016): כיטוזן בעל משקל מולקולרי גבוה שעבר דה־אצטילציה נרחבת באמצעות דה־אצטילציה רב־שלבית של בטא־כיטין בסיוע אולטרסאונד. Ultrasonics Sonochemistry 32, 2016. 79–85.
Kjartansson, G., Wu, T., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): המרת כיטין לכיטוזן בסיוע סונוכימי, מפגש החוקרים הראשיים של יוזמת המחקר הלאומית של USDA, ניו אורלינס, LA, June 28th.
Kjartansson, G., Kristbergsson, K. Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): השפעת הטמפרטורה במהלך דה־אצטילציה של כיטין לכיטוזן באמצעות אולטרסאונד בעוצמה גבוהה כטיפול מקדים, הכנס השנתי של המכון לטכנולוגי מזון, ניו אורלינס, LA, June 30th, 95-18.
Kjartansson, G., Kristbergsson, K., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): השפעת אולטרסאונד בעוצמה גבוהה על האצת המרת כיטין לכיטוזן, הכנס השנתי של המכון לטכנולוגי מזון, ניו אורלינס, LA, June 30th, 95-17.
Preto M.F., Campana-Filho S.P., Fiamingo A., Cosentino I.C., Tessari-Zampieri M.C., Abessa D.M.S., Romero A.F., Bordon I.C. (2017): גלדיוס ונגזרותיו כביו־סופחים פוטנציאליים לסולר ימי. Environmental Science and Pollution Research (2017) 24:22,932–22,939.
Wijesena R.N., Tissera N., Kannangara Y.Y., Lin Y., Amaratunga G.A.J., de Silva K.M.N. (2015): שיטה להכנת ננו־חלקיקים וננו־סיבים של כיטוזן בגישת מלמעלה למטה. Carbohydrate Polymers 117, 2015. 731–738.
Wu, T., Zivanovic, S., Hayes, D.G., Weiss, J. (2008). הפחתה יעילה של המשקל המולקולרי של כיטוזן באמצעות אולטרסאונד בעוצמה גבוהה: המנגנון שבבסיס התהליך והשפעת פרמטרי העיבוד. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(13):5112-5119.
Yadav M.; Goswami P.; Paritosh K.; Kumar M.; Pareek N.; Vivekanand V. (2019): פסולת מאכלי ים: מקור להכנת חומרי כיטין/כיטוזן הניתנים לשימוש מסחרי. Bioresources and Bioprocessing 6/8, 2019.

נושאים קשורים

עובדות שכדאי לדעת

כיצד פועלת דה־אצטילציה אולטרסונית של כיטין?

כאשר אולטרסאונד בהספק גבוה ובתדר נמוך (למשל, 20–26kHz) מועבר לתוך נוזל או תרחיף, הנוזל נתון למחזורי לחץ גבוה / לחץ נמוך לסירוגין, היוצרים דחיסה והקלשה. במהלך מחזורי הלחץ הגבוה / הלחץ הנמוך המתחלפים האלה נוצרות בועות ריק קטנות, הגדלות לאורך כמה מחזורי לחץ. כאשר בועות הריק אינן יכולות לספוג עוד אנרגיה, הן קורסות בעוצמה. במהלך קריסת הבועות פנימה נוצרים מקומית תנאים קיצוניים מאוד: טמפרטורות גבוהות של עד 5000K, לחצים של עד 2000atm, קצבי חימום/קירור גבוהים מאוד והפרשי לחצים. מכיוון שדינמיקת קריסת הבועות מהירה יותר ממעבר המסה והחום, האנרגיה בחלל הקורס מוגבלת לאזור קטן מאוד, המכונה גם ״נקודה חמה״. קריסת בועת הקוויטציה פנימה גורמת גם למערבולות זעירות, לסילוני נוזל במהירות של עד 280m/s ולכוחות גזירה הנובעים מכך. תופעה זו מכונה קוויטציה אולטרסונית או אקוסטית.
טיפות וחלקיקים בנוזל העובר סוניקציה נתונים לפגיעתם של כוחות הקוויטציה האלה, וכאשר החלקיקים המואצים מתנגשים זה בזה, הם מתנפצים עקב ההתנגשות בין החלקיקים. קוויטציה אקוסטית היא עקרון הפעולה של טחינה אולטרסונית, פיזור אולטרסוני, תחלוב אולטרסוני וסונוכימיה.
בדה־אצטילציה של כיטין, אולטרסאונד בעוצמה גבוהה מגדיל את שטח הפנים באמצעות הפעלת פני השטח וקידום מעבר המסה בין החלקיקים למגיב.

כיטוזן

כיטוזן הוא פולימר פחמימתי שעבר שינוי, קטיוני ולא רעיל, בעל מבנה כימי מורכב המורכב מיחידות גלוקוזאמין β-(1,4) כרכיב העיקרי שלו (>80%) ומיחידות N-אצטיל גלוקוזאמין (<20%), המפוזרות באקראי לאורך השרשרת. כיטוזן מופק מכיטין באמצעות דה־אצטילציה כימית או אנזימטית. דרגת הדה־אצטילציה (DA) קובעת את תכולת קבוצות האמינו החופשיות במבנה ומשמשת להבחנה בין כיטין לכיטוזן. כיטוזן מפגין מסיסות טובה בממסים מתונים כגון חומצה אצטית מדוללת ומציע כמה קבוצות אמין חופשיות כאתרים פעילים. תכונה זו מקנה לכיטוזן יתרון על פני כיטין בתגובות כימיות רבות.
כיטוזן מוערך בזכות התאימות הביולוגית וההתכלות הביולוגית המצוינות שלו, היעדר רעילות, פעילות אנטימיקרוביאלית טובה (נגד חיידקים ופטריות), אטימות לחמצן ותכונות של יצירת יריעות דקות. בהשוואה לכיטין, לכיטוזן יש יתרון בכך שהוא מסיס במים ולכן קל יותר לטיפול ולשימוש בפורמולציות.
כיטין הוא הרב־סוכר השני בשכיחותו אחרי תאית, ושכיחותו העצומה הופכת אותו לחומר גלם זול ובר־קיימא.

ייצור כיטוזן

כיטוזן מיוצר בתהליך דו־שלבי. בשלב הראשון, חומר הגלם, כגון שריונות סרטנאים (כלומר שרימפס, סרטנים ולובסטרים), עובר סילוק חלבונים, סילוק מינרלים וטיהור לקבלת כיטין. בשלב השני, הכיטין מטופל בבסיס חזק (למשל NaOH) להסרת שרשראות צד אצטיליות כדי לקבל כיטוזן. תהליך הייצור המקובל של כיטוזן ידוע כתהליך ממושך מאוד ועתיר עלויות.

כיטין

כיטין (C₈H₁₃O₅N)_n הוא פולימר בעל שרשרת ישרה של β-1,4-N-אצטילגלוקוזאמין ומסווג לכיטין מסוג α, מסוג β ומסוג γ. כנגזרת של גלוקוז, כיטין הוא מרכיב עיקרי בשלדים החיצוניים של פרוקי רגליים, כגון סרטנאים וחרקים, במגרדות של רכיכות, במקורים של ראש־רגליים ובקשקשים של דגים ודו־חיים מודרניים, וניתן למצוא אותו גם בדופנות התאים של פטריות. מבנה הכיטין דומה לזה של תאית, והוא יוצר ננו־סיבים גבישיים או גבישים מחטיים. תאית היא הרב־סוכר השכיח ביותר בעולם, ואחריה כיטין כרב־הסוכר השני בשכיחותו.

גלוקוזאמין

גלוקוזאמין (C₆H₁₃NO₅) הוא סוכר אמיני וחומר מוצא חשוב בסינתזה הביוכימית של חלבונים וליפידים שעברו גליקוזילציה. גלוקוזאמין הוא תרכובת הנפוצה בטבע ומהווה חלק מהמבנה של שני הרב־סוכרים, כיטוזן וכיטין, דבר ההופך אותו לאחד החד־סוכרים הנפוצים ביותר. רוב הגלוקוזאמין הזמין מסחרית מיוצר באמצעות הידרוליזה של שלדים חיצוניים של סרטנאים, כלומר שריונות סרטנים ולובסטרים.
גלוקוזאמין משמש בעיקר כתוסף תזונה, בצורות של גלוקוזאמין סולפט, גלוקוזאמין הידרוכלוריד או N-אצטיל גלוקוזאמין. תוספי גלוקוזאמין סולפט ניתנים דרך הפה לטיפול במצב כואב הנגרם מדלקת, מפירוק ובסופו של דבר מאובדן סחוס (אוסטאוארתריטיס).