માઇટોકોન્ડ્રીયલ નિદાન માટે ઉચ્ચ થ્રૂપુટવાળી નમૂના તૈયારી
સંશોધન અને ક્લિનિકોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ નિદાન સિક્વન્સિંગ, PCR અને જૈવરાસાયણિક પરીક્ષણો જેવી વિવિધ તકનીકોનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે. આ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ DNAમાં થતા ઉત્પરિવર્તનો ઓળખવા અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ કાર્ય માપવા માટે થાય છે. સિક્વન્સિંગ આનુવંશિક ઉત્પરિવર્તનો શોધવામાં મદદ કરે છે, જ્યારે PCR ચોક્કસ DNA અનુક્રમોનું પરિમાણ નક્કી કરી શકે છે. જૈવરાસાયણિક પરીક્ષણો માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રોટીન અને ઉત્સેચકોની કાર્યક્ષમતાનું મૂલ્યાંકન કરે છે.
માઇટોકોન્ડ્રીયલ રોગોનું નિદાન ખાસ કરીને મુશ્કેલ છે, કારણ કે આ રોગોની ક્લિનિકલ અભિવ્યક્તિમાં નોંધપાત્ર વિવિધતા હોય છે અને અલગ અલગ રીતે વારસામાં મળતા બે જીનોમ – માઇટોકોન્ડ્રીયલ DNA (mtDNA) અને કોષકેન્દ્રીય જીનોમ – વચ્ચે જટિલ આંતરક્રિયા થાય છે.
સોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને DNAનું નિષ્કર્ષણ અને ખંડન
જ્યારે mtDNAમાં પેશી-વિશિષ્ટ ફેરફારોની શંકા હોય ત્યારે સ્નાયુ પેશીમાંથી DNAનું નિષ્કર્ષણ ખાસ ઉપયોગી છે. આ ફેરફારોમાં ક્રોનિક પ્રોગ્રેસિવ એક્સટર્નલ ઑફ્થાલ્મોપ્લેજિયા (CPEO)માં mtDNAના અંશોનું વિલોપન, માઇટોકોન્ડ્રીયલ માયોપથીમાં mtDNAના બિંદુ ઉત્પરિવર્તનો અથવા Alpers સિન્ડ્રોમમાં mtDNAના પ્રમાણમાં ઘટાડો સામેલ હોઈ શકે છે. ત્યારબાદ સ્નાયુ પેશીમાંથી નિષ્કર્ષિત DNAનો ઉપયોગ વિવિધ આનુવંશિક પરીક્ષણો માટે કરી શકાય છે, જેમ કે વિલોપનો માટે સધર્ન બ્લોટ અને લોંગ-રેન્જ PCR, પ્રમાણમાં ઘટાડા માટે રિયલ-ટાઇમ PCR અથવા બિંદુ ઉત્પરિવર્તનો માટે સિક્વન્સિંગ.
તીવ્ર અલ્ટ્રાસાઉન્ડ તરંગોનો ઉપયોગ કરતું સોનિકેશન માઇટોકોન્ડ્રીયલ નિદાનમાં વિવિધ ઉપયોગો માટે લાગુ કરવામાં આવે છે. તેનો ઉપયોગ માઇટોકોન્ડ્રિયા અને DNA જેવા અંતઃકોષીય ઘટકોનું નિષ્કર્ષણ કરવા માટે કોષોનું લયન કરવા, સિક્વન્સિંગ માટે mtDNA અને nDNA જેવા DNAનું કર્તન કરવા અને નમૂનાઓનું સમાનાંગીકરણ કરવા માટે થાય છે.
ઉચ્ચ થ્રૂપુટવાળી નમૂના તૈયારી માટેનું UIP400MTP પ્લેટ સોનિકેટર મલ્ટિ-વેલ અને 96-વેલ પ્લેટોમાં નમૂનાઓનું એકસમાન રીતે સોનિકેશન કરે છે
કોષો અને પેશીઓમાંથી માઇટોકોન્ડ્રિયા કેવી રીતે અલગ કરવા
માઇટોકોન્ડ્રિયાના અલગીકરણમાં બે આવશ્યક પગલાં સામેલ છે: કોષોના ઘટકો મુક્ત કરવા માટે કોષોનું વિઘટન કરવું અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ અંશોને અલગ કરવા તથા પુનઃપ્રાપ્ત કરવા માટે વિભેદક અપકેન્દ્રણનો ઉપયોગ કરવો.
સોનિકેશન
Hielscher સોનિકેટરો પ્રમાણભૂત લયન બફરો અને કિટો સાથે સુસંગત છે, તેથી તેઓ માઇટોકોન્ડ્રિયાના અલગીકરણ માટે યોગ્ય છે. સોનિકેશન બે મુખ્ય હેતુઓ પૂરા કરે છે:
- કોષ લયન: અલ્ટ્રાસોનિક તરંગો કોષપટલોનું વિઘટન કરે છે, જેનાથી અંતઃકોષીય ઘટકો મુક્ત થાય છે.
- માઇટોકોન્ડ્રિયાનું વિઘટન: ત્યારપછીના પગલામાં સોનિકેશન માઇટોકોન્ડ્રિયાને તોડી ખોલી શકે છે, જેથી માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રોટીન અથવા માઇટોકોન્ડ્રીયલ DNA મુક્ત થાય છે.
- mtDNAનું ખંડન: સિક્વન્સિંગ માટે માઇટોકોન્ડ્રીયલ DNAનું કર્તન કરવા સોનિકેશન એક વિશ્વસનીય તકનીક છે.
મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP માઇટોકોન્ડ્રીયલ નમૂનાઓની ઉચ્ચ થ્રૂપુટવાળી તૈયારી શક્ય બનાવે છે. વિભેદક અપકેન્દ્રણ સાથે સંયોજનમાં સોનિકેશન માઇટોકોન્ડ્રિયાના અલગીકરણની કાર્યક્ષમતા વધારે છે અને વિવિધ અનુવર્તી ઉપયોગો માટે યોગ્ય અખંડ માઇટોકોન્ડ્રિયાની ઊંચી ઉપજ સુનિશ્ચિત કરે છે.
Hielscher UIP400MTP મલ્ટિવેલ પ્લેટ સોનિકેટર કોઈપણ પ્રમાણભૂત પ્લેટ સાથે કાર્ય કરે છે
મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP ઉચ્ચ થ્રૂપુટવાળી નમૂના તૈયારી માટે, ઉદાહરણ તરીકે માઇટોકોન્ડ્રીયલ નિદાનમાં, અનેક લાભો પ્રદાન કરે છે.
બાયોમાર્કર નિદાનમાં ઉચ્ચ થ્રૂપુટવાળી નમૂના તૈયારી માટેનું UIP400MTP મલ્ટિવેલ પ્લેટ સોનિકેટર.
અલ્ટ્રાસોનિક mtDNA ખંડન માટે ઉદાહરણરૂપ સૂચનાઓ
તૈયારી અને નિષ્કર્ષણ:
- C57BL/6 ઉંદરોને ગરદનના મણકાનું સાંધામાંથી વિસ્થાપન કરીને મારી નાખવામાં આવ્યા હતા.
- યકૃતોને ઝડપથી બહાર કાઢવામાં આવ્યાં હતાં અને બરફ જેટલા ઠંડા જંતુરહિત PBSમાં ધોવામાં આવ્યાં હતાં.
માઇટોકોન્ડ્રિયાનું અલગીકરણ:
- 2-mL Dounce ટિશ્યુ ગ્રાઇન્ડર અને પેશી માટેની માઇટોકોન્ડ્રિયા અલગીકરણ કિટનો ઉપયોગ કરીને માઇટોકોન્ડ્રિયાને અલગ કરવામાં આવ્યાં હતાં.
- 700× g અને 3,000× g પર પ્રારંભિક અપકેન્દ્રણ.
- બફર C સાથે ધોવાનાં બે વધારાનાં પગલાં કરો.
DNAનું અલગીકરણ:
- 700× g પરના પ્રથમ અપકેન્દ્રણથી મળેલા પેલેટનો ઉપયોગ કોષકેન્દ્રીય DNA (nDNA)ને અલગ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.
- સ્પિન કૉલમોનો ઉપયોગ કરીને DNAને અલગ કરવામાં આવ્યું હતું.
- અલગ કરાયેલા માઇટોકોન્ડ્રિયામાંથી માઇટોકોન્ડ્રીયલ DNA (mtDNA)નું નિષ્કર્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
- કોષકેન્દ્રોના અશુદ્ધ અર્કમાંથી કોષકેન્દ્રીય DNA (nDNA)નું નિષ્કર્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું; બંને પ્રકારના DNA ઉંદરની યકૃત પેશીમાંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા.
DNAનું ખંડન:
- 0.5-mm માઇક્રો-ટિપ સોનોટ્રોડ ધરાવતા 30-kHz/50-W અલ્ટ્રાસોનિક સોનિકેટર UP50H નો ઉપયોગ કરીને બરફ પર 14 μm પર 2 × 30 સેકન્ડ માટે DNAનું ખંડન કરવામાં આવ્યું હતું.
ખંડનનું દૃશ્યીકરણ અને પરિમાણ નિર્ધારણ:
- અલ્ટ્રાસાઉન્ડ સારવાર પછી થયેલું ખંડન SYBR safe DNA રંગક સાથે 1% એગેરોઝ જેલ પર દૃશ્યમાન કરવામાં આવ્યું હતું.
- mtDNA અને nDNA ની સાપેક્ષ વિપુલતા qPCR દ્વારા નિર્ધારિત કરવામાં આવી હતી.
(cf. Mariero et al., 2019)
ઉચ્ચ સંખ્યામાં નમૂનાઓની તૈયારી માટે, મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP પ્રમાણભૂત 96-વેલ, મલ્ટિ-વેલ અને માઇક્રોટાઇટર પ્લેટોમાં મોટી સંખ્યામાં નમૂનાઓ તૈયાર કરવાની સુવિધા આપે છે.
UIP400MTP નો ઉપયોગ કરીને ઉચ્ચ સંખ્યામાં નમૂનાઓ તૈયાર કરવાના ફાયદાઓ વિશે વધુ વાંચો!
સોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને માઇટોકોન્ડ્રિયાના શ્રેષ્ઠ અલગીકરણ માટેની સૂચનાઓ:
- તાપમાનનું નિયંત્રણ: બધાં પગલાં 0°C થી 4°C ની તાપમાન શ્રેણીમાં કરો. માઇટોકોન્ડ્રિયાની અખંડિતતા અને કાર્યક્ષમતા જાળવવા માટે આ અત્યંત જરૂરી છે.
- કાર્યદક્ષતા અને ઝડપ: ઝડપથી કામ કરો અને તમારા ચોક્કસ ઉપયોગ માટે જરૂરી હોય તેટલી હદ સુધી જ માઇટોકોન્ડ્રિયાનું શુદ્ધીકરણ કરો. વધુ પડતી પ્રક્રિયાઓ કરવાથી માઇટોકોન્ડ્રિયાની સામગ્રીમાં નોંધપાત્ર નુકસાન થઈ શકે છે.
- નિલંબનોનું મંદન: સમગ્ર અલગીકરણ પ્રક્રિયા દરમિયાન કોષો અને કોષાંગોના નિલંબનોની સાંદ્રતા ઓછી રાખો. આનાથી ફસાઈ જવાના અને ગુંચ્છન થવાના જોખમો ઘટાડવામાં મદદ મળે છે, જેનાથી અલગ કરાયેલા માઇટોકોન્ડ્રિયાની શુદ્ધતા સુધરે છે.
- નમૂનાનું આયતન: એક જ મોટા પાયાની તૈયારી કરવાને બદલે નાના પાયે અનેક તૈયારીઓ કરવાનું પસંદ કરો. આ અભિગમથી સામાન્ય રીતે વધુ સારી ઉપજ મળે છે, કારણ કે પ્રક્રિયાના પાયામાં વધારો કરવાથી પુનઃપ્રાપ્ત કરી શકાય તેવા માઇટોકોન્ડ્રિયાની માત્રામાં પ્રમાણસર વધારો થતો નથી. મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP માઇટોકોન્ડ્રિયાના અલગીકરણ માટે કોષોનું ઝડપી અને વિશ્વસનીય લયન કરવાની તેમજ માઇટોકોન્ડ્રિયામાંથી પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ કરવાની સુવિધા આપે છે.
આ માર્ગદર્શિકાઓ અલ્ટ્રાસોનિક લયન અને સેન્ટ્રિફ્યુગેશનનો ઉપયોગ કરતી અલગીકરણ પ્રક્રિયાને વધુ કાર્યક્ષમ બનાવશે, જેનાથી અનુગામી ઉપયોગો માટે યોગ્ય ઉચ્ચ ગુણવત્તાની માઇટોકોન્ડ્રિયલ તૈયારીઓ પ્રાપ્ત થશે.
Hielscher સોનિકેટર્સ – જર્મનીમાં નિર્મિત ગુણવત્તા
Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ તેમની સર્વોચ્ચ ગુણવત્તા અને ડિઝાઇનના ધોરણો માટે જાણીતા છે. મજબૂતાઈ અને સરળ સંચાલનને કારણે અમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સને ઔદ્યોગિક સુવિધાઓમાં સરળતાથી એકીકૃત કરી શકાય છે. Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ કઠોર પરિસ્થિતિઓ અને પડકારજનક વાતાવરણનો સરળતાથી સામનો કરે છે.
Hielscher Ultrasonics એ ISO પ્રમાણિત કંપની છે અને તે અત્યાધુનિક ટેક્નોલોજી તથા વપરાશમાં સરળતા ધરાવતા ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતાવાળા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ પર વિશેષ ભાર મૂકે છે. અલબત્ત, Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ CE અનુરૂપ છે અને UL, CSA તથા RoHs ની જરૂરિયાતોને પૂર્ણ કરે છે.
માઇક્રોટાઇટર અને મલ્ટિવેલ પ્લેટોના સોનિકેશન માટે 96-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP
સાહિત્ય / સંદર્ભો
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
માઇટોકોન્ડ્રિયા અને માઇટોકોન્ડ્રિયલ નિદાન વિશે વારંવાર પૂછાતા પ્રશ્નો
માઇટોકોન્ડ્રિયા શું છે?
માઇટોકોન્ડ્રિયા એ મોટાભાગના સુકોષકેન્દ્રી સજીવોના કોષોમાં જોવા મળતા પટલથી ઘેરાયેલા કોષાંગો છે. તેઓ કોષનાં ઊર્જામથકો તરીકે ઓળખાય છે, કારણ કે તેઓ કોષીય શ્વસનની પ્રક્રિયા દ્વારા એડેનોસિન ટ્રાઇફોસ્ફેટ (ATP) ના સ્વરૂપમાં ઊર્જા ઉત્પન્ન કરે છે. વધુમાં, માઇટોકોન્ડ્રિયા પોતાનું DNA ધરાવે છે અને કોષચક્ર તથા કોષમૃત્યુના નિયમન સહિતની અન્ય કોષીય પ્રક્રિયાઓમાં મુખ્ય ભૂમિકાઓ ભજવે છે.
mtDNA ને જીનોમિક DNA થી શું અલગ પાડે છે?
માઇટોકોન્ડ્રિયલ DNA (mtDNA) અનેક મુખ્ય બાબતોમાં જીનોમિક DNA (gDNA) થી અલગ પડે છે. MtDNA માઇટોકોન્ડ્રિયામાં આવેલું હોય છે, વર્તુળાકાર હોય છે અને માતા તરફથી વારસામાં મળે છે, જ્યારે gDNA કોષકેન્દ્રમાં આવેલું હોય છે, રેખીય હોય છે અને માતા તથા પિતા બંને તરફથી વારસામાં મળે છે. MtDNA ઘણું નાનું હોય છે અને માત્ર 37 જનીનોનું સંકેતન કરે છે, જ્યારે gDNA માં લગભગ 20,000–25,000 જનીનો હોય છે. દરેક કોષમાં MtDNA ની અનેક નકલો હોય છે, તેનો ઉત્પરિવર્તન દર વધુ હોય છે અને તે મુખ્યત્વે માઇટોકોન્ડ્રિયાના કાર્યમાં સામેલ પ્રોટીનોનું સંકેતન કરે છે. તેની સરખામણીએ, gDNA સામાન્ય રીતે દ્વિગુણિત હોય છે, તેનો ઉત્પરિવર્તન દર ઓછો હોય છે અને તે સજીવના વિકાસ અને કાર્ય માટે જરૂરી જનીનોના વિશાળ સમૂહનું સંકેતન કરે છે. વધુમાં, mtDNA નું અનુલેखन અને ભાષાંતરણ માઇટોકોન્ડ્રિયાની અંદર થાય છે, જ્યારે gDNA નું અનુલેखन કોષકેન્દ્રમાં થાય છે અને ભાષાંતરણ કોષરસમાં થાય છે. આ તફાવતો તેમની અલગ ભૂમિકાઓ અને ઉત્ક્રાંતિજન્ય ઉદ્ભવને પ્રતિબિંબિત કરે છે.
કોષમુક્ત અર્ક શું છે?
કોષમુક્ત અર્ક એ એવું દ્રાવણ છે જેમાં વિઘટિત કોષોની સામગ્રી હોય છે, જેમાં પ્રોટીન, ન્યુક્લિક ઍસિડ અને અન્ય કોષીય ઘટકોનો સમાવેશ થાય છે, પરંતુ અખંડ કોષપટલો હોતા નથી. આ અર્કનો ઉપયોગ જૈવરાસાયણિક અને આણ્વિક જીવવિજ્ઞાનના સંશોધનમાં ઇન વિટ્રો કોષીય પ્રક્રિયાઓનો અભ્યાસ કરવા માટે થાય છે, જેથી સંશોધકો જીવંત કોષોની બહાર પ્રતિક્રિયાઓ અને ક્રિયાતંત્રોનું વિશ્લેષણ કરી શકે છે.
માઇટોકોન્ડ્રીય નિદાનમાં PCR પરીક્ષણો શું ભૂમિકા ભજવે છે?
PCR પરીક્ષણો માઇટોકોન્ડ્રીય DNA (mtDNA)માં ઉત્પરિવર્તનો, વિલોપનો અથવા નકલસંખ્યામાં ભિન્નતાઓ શોધવાનું શક્ય બનાવીને માઇટોકોન્ડ્રીય નિદાનમાં નિર્ણાયક ભૂમિકા ભજવે છે. તે માઇટોકોન્ડ્રીય વિકારો સાથે સંકળાયેલા રોગકારક પ્રકારોને ઓળખવા માટે ચોક્કસ mtDNA વિસ્તારોનું પ્રવર્ધન શક્ય બનાવે છે. ક્વોન્ટિટેટિવ PCR (qPCR) અને લોંગ-રેન્જ PCR જેવી PCR-આધારિત તકનીકોનો ઉપયોગ mtDNAની અખંડિતતા, હેટેરોપ્લાઝ્મીના સ્તરો અને mtDNAના ક્ષયનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે પણ થાય છે, જે માઇટોકોન્ડ્રીય કાર્ય અને રોગ વિશે આવશ્યક સમજ પૂરી પાડે છે.
UIP400MTP માઇક્રોપ્લેટ સોનિકેટર PCR પરીક્ષણો અને વિશ્લેષણોને કેવી રીતે સરળ બનાવે છે તે જાણો!
વિભેદક અપકેન્દ્રણ શું છે?
વિભેદક અપકેન્દ્રણ એ કોષીય અંશીકરણ અને માઇટોકોન્ડ્રિયાના અલગીકરણ માટે વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાતી તકનીક છે. આ પદ્ધતિ કોષીય સંરચનાઓને તેમના અવસાદન ગુણાંકના આધારે અલગ કરે છે, જે ઘનતા અને આકાર બંને પર આધાર રાખે છે. આ પ્રક્રિયામાં ચોક્કસ ઘનતા ધરાવતા બફરયુક્ત ક્ષાર દ્રાવણોમાં રહેલા નમૂનાઓ પર વિવિધ સ્તરનું અપકેન્દ્રીય બળ લાગુ કરવામાં આવે છે. સમાન અવસાદન ગુણાંક ધરાવતી સંરચનાઓ સંગ્રહ નળીના તળિયે એક જ સમયે બેસી જાય છે, જેથી તેમને પુનઃપ્રાપ્ત કરી શકાય છે.
માઇટોકોન્ડ્રિયાના અલગીકરણ માટે વિભેદક અપકેન્દ્રણનો ઉપયોગ કેવી રીતે થાય છે?
વિભેદક અપકેન્દ્રણ સંશોધકોને માઇટોકોન્ડ્રીય અંશોને અન્ય કોષીય ઘટકોથી અસરકારક રીતે અલગ કરવા સક્ષમ બનાવે છે. માઇટોકોન્ડ્રિયાના અલગીકરણમાં અપકેન્દ્રણનાં અનેક પગલાં અને ત્યારબાદ અલગ કરેલી સામગ્રીની પુનઃપ્રાપ્તિનો સમાવેશ થાય છે.
પ્રારંભિક અપકેન્દ્રણ: મોટા કોષીય અવશેષો અને કોષકેન્દ્રોને તળિયે બેસાડવા માટે ઓછું અપકેન્દ્રીય બળ લાગુ કરો.
અનુગામી અપકેન્દ્રણો: માઇટોકોન્ડ્રિયાથી સમૃદ્ધ અંશોને અવસાદના ગોળા તરીકે એકત્ર કરવા માટે અપકેન્દ્રીય બળ ક્રમશઃ વધારો. અપકેન્દ્રણનું દરેક પગલું ક્રમશઃ વધુ ઊંચા અવસાદન ગુણાંક ધરાવતી સંરચનાઓને દૂર કરે છે.
અંશની પુનઃપ્રાપ્તિ: દરેક અપકેન્દ્રણ પછી, અવસાદનો ગોળો એકત્ર કરવામાં આવે છે અને પછીનો અંશ અલગ કરવા માટે ઉપરના પ્રવાહી પર વધુ ઊંચાં g-બળો લાગુ કરવામાં આવે છે. માઇટોકોન્ડ્રિયાની ઇચ્છિત શુદ્ધતા પ્રાપ્ત થાય ત્યાં સુધી આ પ્રક્રિયાનું પુનરાવર્તન કરવામાં આવે છે.