آماده‌سازی نمونه‌ها با ظرفیت پردازش بالا برای تشخیص‌های میتوکندریایی
تشخیص‌های میتوکندریایی در پژوهش و مراکز بالینی با استفاده از روش‌های گوناگونی مانند توالی‌یابی، PCR و سنجش‌های بیوشیمیایی انجام می‌شوند. این روش‌ها برای شناسایی جهش‌های DNA و اندازه‌گیری عملکرد میتوکندری به کار می‌روند. توالی‌یابی به شناسایی جهش‌های ژنتیکی کمک می‌کند، درحالی‌که PCR می‌تواند توالی‌های مشخص DNA را کمّی‌سازی کند. سنجش‌های بیوشیمیایی، عملکرد پروتئین‌ها و آنزیم‌های میتوکندریایی را ارزیابی می‌کنند.
تشخیص بیماری‌های میتوکندریایی به‌ویژه به دلیل تنوع بالینی چشمگیر این بیماری‌ها و نیز برهم‌کنش پیچیده میان دو ژنوم با الگوهای وراثتی متفاوت، یعنی DNA میتوکندریایی (mtDNA) و ژنوم هسته‌ای، دشوار است.
استخراج و قطعه‌قطعه‌سازی DNA با استفاده از فراصوت‌دهی
استخراج DNA از بافت عضلانی به‌ویژه زمانی مفید است که احتمال تغییرات اختصاصی بافت در mtDNA مطرح باشد. این تغییرات ممکن است شامل حذف‌های mtDNA در افتالموپلژی خارجی پیشرونده مزمن (CPEO)، جهش‌های نقطه‌ای mtDNA در میوپاتی‌های میتوکندریایی یا کاهش مقدار mtDNA در سندرم آلپرز باشند. سپس می‌توان از DNA استخراج‌شده از بافت عضلانی برای آزمایش‌های ژنتیکی گوناگون استفاده کرد؛ مانند ساترن بلات و PCR دوربرد برای حذف‌ها، PCR زمان واقعی برای کاهش مقدار، یا توالی‌یابی برای جهش‌های نقطه‌ای.
فراصوت‌دهی با استفاده از امواج فراصوت شدید، کاربردهای متعددی در تشخیص‌های میتوکندریایی دارد. این روش برای لیز سلول‌ها به‌منظور استخراج محتویات درون‌سلولی مانند میتوکندری و DNA، برش DNA مانند mtDNA و nDNA برای توالی‌یابی، و همگن‌سازی نمونه‌ها به کار می‌رود.
سونیکاتور پلیت UIP400MTP برای آماده‌سازی نمونه‌ها با ظرفیت پردازش بالا نمونه‌ها را در پلیت‌های چندخانه‌ای و 96 خانه‌ای به‌طور یکنواخت فراصوت‌دهی می‌کند
نحوه جداسازی میتوکندری از سلول‌ها و بافت‌ها
جداسازی میتوکندری شامل دو مرحله اساسی است: تخریب سلول‌ها برای آزادسازی محتویات آن‌ها، و استفاده از سانتریفیوژ افتراقی برای جداسازی و بازیابی فراکسیون‌های میتوکندریایی.
فراصوت‌دهی
سونیکاتورهای Hielscher با بافرها و کیت‌های استاندارد لیز سازگارند و ازاین‌رو برای جداسازی میتوکندری مناسب هستند. فراصوت‌دهی دو هدف اصلی دارد:
- لیز سلولی: امواج فراصوت غشاهای سلولی را تخریب می‌کنند و محتویات درون‌سلولی را آزاد می‌سازند.
- تخریب میتوکندری: فراصوت‌دهی در مرحله‌ای بعدی می‌تواند میتوکندری‌ها را بشکافد و پروتئین‌های میتوکندریایی یا DNA میتوکندریایی را آزاد کند.
- قطعه‌قطعه‌سازی mtDNA: فراصوت‌دهی روشی قابل‌اعتماد برای برش DNA میتوکندریایی به‌منظور توالی‌یابی است.
سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP امکان آماده‌سازی نمونه‌های میتوکندریایی را با ظرفیت پردازش بالا فراهم می‌کند. فراصوت‌دهی همراه با سانتریفیوژ افتراقی، کارایی جداسازی میتوکندری را افزایش می‌دهد و بازده بالای میتوکندری‌های سالم و مناسب برای کاربردهای گوناگون مراحل بعدی را تضمین می‌کند.
سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای Hielscher UIP400MTP با هر پلیت استانداردی کار می‌کند
سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP مزایای متعددی برای آماده‌سازی نمونه‌ها با ظرفیت پردازش بالا، برای مثال در تشخیص‌های میتوکندریایی، ارائه می‌دهد.
سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP برای آماده‌سازی نمونه‌ها با ظرفیت پردازش بالا در تشخیص مبتنی بر نشانگرهای زیستی.
نمونه دستورالعمل برای قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی mtDNA
آماده‌سازی و استخراج:
- موش‌های C57BL/6 با دررفتگی مهره‌های گردنی کشته شدند.
- کبدها به‌سرعت خارج و در PBS استریل و سردشده تا دمای یخ شسته شدند.
جداسازی میتوکندری:
- میتوکندری‌ها با استفاده از یک هموژنایزر بافت Dounce با حجم 2-mL و یک کیت جداسازی میتوکندری از بافت جدا شدند.
- سانتریفیوژ اولیه در 700× g و 3٬000× g.
- دو مرحله شست‌وشوی اضافی با بافر C انجام دهید.
جداسازی DNA:
- رسوب حاصل از نخستین سانتریفیوژ در 700× g برای جداسازی DNA هسته‌ای (nDNA) استفاده شد.
- DNA با استفاده از ستون‌های اسپین جدا شد.
- DNA میتوکندریایی (mtDNA) از میتوکندری‌های جداشده استخراج شد.
- DNA هسته‌ای (nDNA) از عصاره‌های خام هسته‌ای استخراج شد؛ هر دو نوع DNA از بافت کبد موش به دست آمدند.
قطعه‌قطعه‌سازی DNA:
- DNA روی یخ با استفاده از سونیکاتور فراصوتی UP50H با مشخصات 30-kHz/50-W، مجهز به سونوتْرود با ریزنوک 0٫5-mm، در دامنه 14 μm و به مدت 2 × 30 ثانیه قطعه‌قطعه شد.
مشاهده و کمّی‌سازی قطعه‌قطعه‌شدن:
- قطعه‌قطعه‌شدن پس از فراصوت‌دهی، روی ژل آگارز 1% با رنگ DNA موسوم به SYBR safe مشاهده شد.
- فراوانی نسبی mtDNA و nDNA با qPCR تعیین شد.
(رجوع کنید به Mariero et al., 2019)
برای آماده‌سازی نمونه‌ها با ظرفیت پردازش بالا، سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP آماده‌سازی تعداد زیادی نمونه را در پلیت‌های استاندارد 96 خانه‌ای، چندخانه‌ای و میکروتیتر تسهیل می‌کند.
درباره مزایای آماده‌سازی نمونه‌ها با ظرفیت پردازش بالا با استفاده از UIP400MTP بیشتر بخوانید!
نکاتی برای جداسازی بهینه میتوکندری با استفاده از فراصوت‌دهی:
- کنترل دما: تمام مراحل را در بازه دمایی 0°C تا 4°C انجام دهید. این امر برای حفظ یکپارچگی و عملکرد میتوکندری‌ها حیاتی است.
- کارایی و سرعت: سریع کار کنید و میتوکندری‌ها را فقط تا حد لازم برای کاربرد مشخص خود خالص‌سازی کنید. دست‌کاری بیش‌ازحد می‌تواند به اتلاف قابل‌توجه محتوای میتوکندریایی منجر شود.
- رقیق‌سازی سوسپانسیون‌ها: در سراسر فرایند جداسازی، غلظت سوسپانسیون‌های سلولی و اندامکی را پایین نگه دارید. این کار به به حداقل رساندن خطر به‌دام‌افتادن و آگلوتیناسیون کمک می‌کند و در نتیجه خلوص میتوکندری‌های جداشده را بهبود می‌بخشد.
- حجم نمونه: به‌جای یک آماده‌سازی در مقیاس بزرگ، چندین آماده‌سازی در مقیاس کوچک انجام دهید. این رویکرد معمولاً بازده بهتری دارد، زیرا افزایش مقیاس، مقدار میتوکندری قابل‌بازیابی را به همان نسبت افزایش نمی‌دهد. سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP لیز سریع و قابل‌اعتماد سلول‌ها برای جداسازی میتوکندری و نیز استخراج پروتئین از میتوکندری‌ها را تسهیل می‌کند.
این راهنماها فرایند جداسازی با استفاده از لیز فراصوتی و سانتریفیوژ را کارآمدتر می‌کنند و نمونه‌های میتوکندریایی آماده‌شده با کیفیت بالا و مناسب برای کاربردهای مراحل بعدی به دست می‌دهند.
سونیکاتورهای Hielscher – کیفیت ساخت آلمان
سونیکاتورهای Hielscher به برخورداری از بالاترین استانداردهای کیفیت و طراحی شناخته می‌شوند. استحکام و کاربری آسان، ادغام بی‌دردسر سونیکاتورهای ما در تأسیسات صنعتی را امکان‌پذیر می‌کند. سونیکاتورهای Hielscher به‌آسانی از عهده شرایط سخت و محیط‌های پرفشار برمی‌آیند.
Hielscher Ultrasonics شرکتی دارای گواهینامه ISO است و بر سونیکاتورهای پربازده مجهز به فناوری روز و برخوردار از سهولت استفاده، تأکید ویژه‌ای دارد. البته سونیکاتورهای Hielscher با CE انطباق دارند و الزامات UL، CSA و RoHs را برآورده می‌کنند.
سونیکاتور پلیت 96 خانه‌ای UIP400MTP برای فراصوت‌دهی پلیت‌های میکروتیتر و چندخانه‌ای
منابع علمی / مراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
پرسش‌های متداول درباره میتوکندری و تشخیص‌های میتوکندریایی
میتوکندری چیست؟
میتوکندری‌ها اندامک‌های غشاداری هستند که در سلول‌های بیشتر جانداران یوکاریوتی یافت می‌شوند. آن‌ها به نیروگاه‌های سلول معروف‌اند، زیرا طی فرایند تنفس سلولی، انرژی را به شکل آدنوزین تری‌فسفات (ATP) تولید می‌کنند. افزون بر این، میتوکندری‌ها DNA اختصاصی خود را دارند و در دیگر فرایندهای سلولی، از جمله تنظیم چرخه سلولی و مرگ سلولی، نقش‌های کلیدی ایفا می‌کنند.
چه تفاوتی میان mtDNA و DNA ژنومی وجود دارد؟
DNA میتوکندریایی (mtDNA) از چند جنبه کلیدی با DNA ژنومی (gDNA) تفاوت دارد. mtDNA در میتوکندری‌ها قرار دارد، حلقوی است و از مادر به ارث می‌رسد، درحالی‌که gDNA در هسته سلول قرار دارد، خطی است و از هر دو والد به ارث می‌رسد. mtDNA بسیار کوچک‌تر است و تنها 37 ژن را رمزگذاری می‌کند، درحالی‌که gDNA حدود 20٬000–25٬000 ژن دارد. mtDNA در هر سلول در چندین نسخه وجود دارد، نرخ جهش بالاتری دارد و عمدتاً پروتئین‌های دخیل در عملکرد میتوکندری را رمزگذاری می‌کند. در مقابل، gDNA معمولاً دیپلوئید است، نرخ جهش پایین‌تری دارد و مجموعه گسترده‌ای از ژن‌های ضروری برای رشد و عملکرد جاندار را رمزگذاری می‌کند. همچنین، رونویسی و ترجمه mtDNA درون میتوکندری‌ها انجام می‌شود، درحالی‌که رونویسی gDNA در هسته و ترجمه آن در سیتوپلاسم رخ می‌دهد. این تفاوت‌ها بازتاب نقش‌ها و خاستگاه‌های تکاملی متمایز آن‌ها هستند.
عصاره بدون سلول چیست؟
عصاره بدون سلول، محلولی حاوی محتویات سلول‌های لیزشده، از جمله پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک و سایر اجزای سلولی است، اما غشاهای سلولی سالم ندارد. این عصاره در پژوهش‌های بیوشیمی و زیست‌شناسی مولکولی برای مطالعه فرایندهای سلولی در شرایط برون‌تنی استفاده می‌شود و به پژوهشگران امکان می‌دهد واکنش‌ها و سازوکارها را خارج از سلول‌های زنده تحلیل کنند.
آزمایش‌های PCR چه نقشی در تشخیص‌های میتوکندریایی دارند؟
آزمایش‌های PCR با فراهم کردن امکان شناسایی جهش‌ها، حذف‌ها یا تغییرات تعداد نسخه در DNA میتوکندریایی (mtDNA)، نقشی حیاتی در تشخیص‌های میتوکندریایی دارند. این آزمایش‌ها امکان تکثیر نواحی مشخص mtDNA را برای شناسایی واریانت‌های بیماری‌زای مرتبط با اختلالات میتوکندریایی فراهم می‌کنند. روش‌های مبتنی بر PCR، مانند PCR کمّی (qPCR) و PCR دوربرد، برای ارزیابی یکپارچگی mtDNA، سطوح هتروپلاسمی و کاهش مقدار mtDNA نیز به کار می‌روند و اطلاعاتی اساسی درباره عملکرد میتوکندری و بیماری ارائه می‌دهند.
با نحوه تسهیل آزمایش‌ها و سنجش‌های PCR توسط سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP آشنا شوید!
سانتریفیوژ افتراقی چیست؟
سانتریفیوژ افتراقی روشی پرکاربرد برای تفکیک اجزای سلولی و جداسازی میتوکندری است. این روش ساختارهای سلولی را بر اساس ضریب رسوب‌گذاری آن‌ها جدا می‌کند؛ ضریبی که هم به چگالی و هم به شکل وابسته است. این فرایند شامل اعمال سطوح مختلف نیروی گریز از مرکز به نمونه‌ها در محلول‌های نمکی بافری با چگالی‌های مشخص است. ساختارهایی با ضرایب رسوب‌گذاری مشابه به‌طور هم‌زمان در کف لوله جمع‌آوری ته‌نشین می‌شوند و امکان بازیابی آن‌ها فراهم می‌شود.
سانتریفیوژ افتراقی چگونه برای جداسازی میتوکندری به کار می‌رود؟
سانتریفیوژ افتراقی به پژوهشگران امکان می‌دهد فراکسیون‌های میتوکندریایی را به‌طور مؤثر از سایر اجزای سلولی جدا کنند. جداسازی میتوکندری شامل چندین مرحله سانتریفیوژ و سپس بازیابی بخش جداشده است.
سانتریفیوژ اولیه: برای رسوب دادن بقایای بزرگ سلولی و هسته‌ها، نیروی گریز از مرکز پایینی اعمال کنید.
سانتریفیوژهای بعدی: نیروی گریز از مرکز را به‌صورت مرحله‌ای افزایش دهید تا فراکسیون‌های غنی از میتوکندری رسوب کنند. هر مرحله سانتریفیوژ، ساختارهایی با ضرایب رسوب‌گذاری به‌تدریج بالاتر را حذف می‌کند.
بازیابی فراکسیون: پس از هر سانتریفیوژ، رسوب جمع‌آوری می‌شود و مایع رویی برای جداسازی فراکسیون بعدی در معرض نیروهای g بالاتری قرار می‌گیرد. این کار تا دستیابی به خلوص مطلوب میتوکندری‌ها تکرار می‌شود.