Suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistus mitokondriaaldiagnostikaks
Mitokondriaaldiagnostikat tehakse teaduses ja kliinikutes mitmesuguste meetodite abil, näiteks sekveneerimise, PCR-i ja biokeemiliste analüüside abil. Neid meetodeid kasutatakse DNA mutatsioonide tuvastamiseks ja mitokondrite funktsiooni mõõtmiseks. Sekveneerimine aitab tuvastada geneetilisi mutatsioone, PCR aga võimaldab kvantifitseerida kindlaid DNA järjestusi. Biokeemilised analüüsid hindavad mitokondriaalsete valkude ja ensüümide funktsionaalsust.
Mitokondriaalsete haiguste diagnostika on eriti keeruline nende haiguste väljendunud kliinilise varieeruvuse ning kahe erineval viisil pärilduva genoomi – mitokondriaalse DNA (mtDNA) ja tuumagenoomi – keeruka koostoime tõttu.
DNA ekstraheerimine ja fragmenteerimine ultraheli töötluse (sonikeerimise) abil
DNA ekstraheerimine lihaskoest on eriti kasulik siis, kui kahtlustatakse koespetsiifilisi muutusi mtDNA-s. Need muutused võivad hõlmata mtDNA deletsioone kroonilise progresseeruva välise oftalmoplegia (CPEO) korral, mtDNA punktmutatsioone mitokondriaalsete müopaatiate korral või mtDNA depletsiooni Alpersi sündroomi korral. Lihaskoest ekstraheeritud DNA-d saab seejärel kasutada mitmesugusteks geneetilisteks testideks, näiteks Southern blot ja pikkade fragmentide PCR deletsioonide tuvastamiseks, reaalaja PCR depletsiooni tuvastamiseks või sekveneerimine punktmutatsioonide tuvastamiseks.
Intensiivsete ultrahelilainete abil toimuvat ultraheli töötlust (sonikeerimist) kasutatakse mitokondriaaldiagnostikas mitmel otstarbel. Seda kasutatakse rakkude lüüsimiseks, et ekstraheerida rakusiseseid komponente, näiteks mitokondreid ja DNA-d, DNA (näiteks mtDNA ja nDNA) fragmenteerimiseks sekveneerimiseks ning proovide homogeniseerimiseks.
UIP400MTP plaadisonikaator suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistuseks töötleb proove ühtlaselt ultrahelega mitmekoolulistel ja 96-koolulistel plaatidel
Kuidas eraldada mitokondreid rakkudest ja kudedest
Mitokondrite eraldamine koosneb kahest olulisest etapist: rakkude lõhkumisest nende sisu vabastamiseks ning diferentsiaalse tsentrifuugimise kasutamisest mitokondriaalsete fraktsioonide eraldamiseks ja kättesaamiseks.
Ultraheli töötlus (sonikeerimine)
Hielscheri sonikaatorid sobivad kasutamiseks standardsete lüüsipuhvrite ja komplektidega, mistõttu sobivad need mitokondrite eraldamiseks. Ultraheli töötlus (sonikeerimine) täidab kahte peamist eesmärki:
- Rakkude lüüs: Ultrahelilained lõhuvad rakumembraane ja vabastavad rakusisese sisu.
- Mitokondrite lõhkumine: Ultraheli töötlus (sonikeerimine) järgmises etapis võib mitokondrid avada, et vabastada mitokondriaalseid valke või mitokondriaalset DNA-d.
- mtDNA fragmenteerimine: Ultraheli töötlus (sonikeerimine) on töökindel meetod mitokondriaalse DNA fragmenteerimiseks sekveneerimise jaoks.
Mitmekoolulise plaadi sonikaator UIP400MTP võimaldab mitokondriaalsete proovide ettevalmistust suure läbilaskevõimega. Koos diferentsiaalse tsentrifuugimisega suurendab ultraheli töötlus (sonikeerimine) mitokondrite eraldamise efektiivsust ning tagab suure saagise terveid mitokondreid, mis sobivad mitmesugusteks järgnevateks rakendusteks.
Hielscher UIP400MTP mitmekoolulise plaadi sonikaator töötab iga standardse plaadiga
Mitmekoolulise plaadi sonikaator UIP400MTP pakub arvukalt eeliseid suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistuseks, nt mitokondriaaldiagnostikas.
UIP400MTP mitmekoolulise plaadi sonikaator suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistuseks biomarkerite diagnostikas.
Näidisjuhised mtDNA ultraheliga fragmenteerimiseks
Ettevalmistus ja ekstraheerimine:
- C57BL/6 hiired tapeti emakakaela nihestamise teel.
- Maksad eemaldati kiiresti ja pesti jääkülmas steriilses PBS-is.
Mitokondrite eraldamine:
- Mitokondrid eraldati 2 mL Dounce’i koehomogenisaatori ja koe mitokondrite eraldamise komplekti abil.
- Esialgne tsentrifuugimine kiirendusega 700× g ja 3 000× g.
- Tehke kaks täiendavat pesemisetappi puhvriga C.
DNA eraldamine:
- Esimese tsentrifuugimise 700× g sade kasutati tuuma-DNA (nDNA) eraldamiseks.
- DNA eraldati tsentrifuugikolonnide abil.
- Mitokondriaalne DNA (mtDNA) ekstraheeriti eraldatud mitokondritest.
- Tuuma-DNA (nDNA) ekstraheeriti toortuumaekstraktidest, mõlemad hiire maksakoest.
DNA fragmenteerimine:
- DNA fragmenteeriti jääl 30 kHz/50 W ultraheli sonikaatoriga UP50H, kasutades 0,5 mm mikrotipp-sonotroodi sagedusel 14 μm 2 × 30 sekundi jooksul.
Fragmenteerimise visualiseerimine ja kvantifitseerimine:
- Fragmentatsiooni pärast ultraheli töötlust visualiseeriti 1% agaroosgeelil SYBR safe DNA värvainega.
- mtDNA ja nDNA suhteline hulk määrati qPCR-iga.
(vt Mariero et al., 2019)
Suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistuseks võimaldab mitmekaevuliste plaatide sonikaator UIP400MTP valmistada ette suurel hulgal proove standardsetes 96-kaevulistes, mitmekaevulistes ja mikrotiiterplaatides.
Loe lähemalt suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistuse eelistest UIP400MTP abil!
Näpunäited mitokondrite optimaalseks isoleerimiseks ultraheli töötluse abil:
- Temperatuuri kontroll: Viige kõik etapid läbi temperatuurivahemikus 0°C kuni 4°C. See on mitokondrite terviklikkuse ja funktsionaalsuse säilitamiseks ülioluline.
- Tõhusus ja kiirus: Töötage kiiresti ja puhastage mitokondreid ainult määral, mida teie konkreetne rakendus nõuab. Liigne käsitsemine võib põhjustada mitokondriaalse sisu märkimisväärseid kadusid.
- Suspensioonide lahjendamine: Hoidke rakkude ja organellide suspensioonide kontsentratsioonid kogu isoleerimisprotsessi vältel madalad. See aitab vähendada lõksustumise ja aglutinatsiooni riske ning parandab seeläbi isoleeritud mitokondrite puhtust.
- Proovi maht: Eelistage mitut väikesemahulist ettevalmistust ühele suurele. See lähenemine annab tavaliselt parema saagise, kuna mastaabi suurendamine ei suurenda proportsionaalselt taaskasutatavate mitokondrite hulka. Mitmekaevuliste plaatide sonikaator UIP400MTP võimaldab kiiret ja usaldusväärset rakkude lüüsi mitokondrite isoleerimiseks ning samuti valkude ekstraheerimist mitokondritest.
Need juhised muudavad ultraheli lüüsi ja tsentrifuugimisega isoleerimisprotsessi tõhusamaks ning annavad kvaliteetseid mitokondrite preparaate, mis sobivad järgnevateks rakendusteks.
Hielscheri sonikaatorid – Saksamaal valmistatud kvaliteet
Hielscheri ultrahelisonikaatorid on tuntud oma kõrgeima kvaliteedi ja disainistandardite poolest. Töökindlus ja lihtne kasutus võimaldavad meie ultrahelisonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusettevõtetesse. Hielscheri ultrahelisonikaatorid tulevad raskete tingimuste ja nõudlike keskkondadega hõlpsasti toime.
Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifitseeritud ettevõte ning pöörab erilist tähelepanu suure jõudlusega ultrahelisonikaatoritele, mis põhinevad tipptasemel tehnoloogial ja on kasutajasõbralikud. Loomulikult vastavad Hielscheri ultrahelisonikaatorid CE nõuetele ning UL-i, CSA ja RoHs nõuetele.
96-kaevuliste plaatide sonikaator UIP400MTP mikrotiiter- ja mitmekaevuliste plaatide ultraheli töötluseks
Kirjandus / viited
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Korduma kippuvad küsimused mitokondrite ja mitokondriaalse diagnostika kohta
Mis on mitokondrid?
Mitokondrid on membraaniga ümbritsetud organellid, mida leidub enamiku eukarüootsete organismide rakkudes. Neid tuntakse rakkude energiajaamadena, sest nad toodavad rakuhingamise käigus energiat adenosiintrifosfaadi (ATP) kujul. Lisaks on mitokondritel oma DNA ning neil on oluline roll teistes rakulistes protsessides, sealhulgas rakutsükli ja rakusurma reguleerimisel.
Mille poolest erineb mtDNA genoomsest DNA-st?
Mitokondriaalne DNA (mtDNA) erineb genoomsest DNA-st (gDNA) mitmes olulises aspektis. MtDNA asub mitokondrites, on ringikujuline ja päritakse emaliini kaudu, samas kui gDNA asub rakutuumas, on lineaarne ja päritakse mõlemalt vanemalt. MtDNA on palju väiksem ning kodeerib vaid 37 geeni, samas kui gDNA sisaldab umbes 20 000-25 000 geeni. MtDNA esineb raku kohta mitmes koopias, selle mutatsioonimäär on kõrgem ning see kodeerib peamiselt mitokondrite talitluses osalevaid valke. Seevastu gDNA on tavaliselt diploidne, selle mutatsioonimäär on madalam ning see kodeerib suurt hulka geene, mis on vajalikud organismi arenguks ja talitluseks. Lisaks toimuvad mtDNA transkriptsioon ja translatsioon mitokondrites, samas kui gDNA transkriptsioon toimub tuumas ja translatsioon tsütoplasmas. Need erinevused peegeldavad nende erinevaid rolle ja evolutsioonilist päritolu.
Mis on rakuvaba ekstrakt?
Rakuvaba ekstrakt on lahus, mis sisaldab lüüsitud rakkude sisu, sealhulgas valke, nukleiinhappeid ja muid rakukomponente, kuid mitte puutumatuid rakumembraane. Seda ekstrakti kasutatakse biokeemia- ja molekulaarbioloogiauuringutes rakuliste protsesside uurimiseks in vitro, võimaldades teadlastel analüüsida reaktsioone ja mehhanisme väljaspool elusrakke.
Millist rolli mängivad PCR-testid mitokondriaalses diagnostikas?
PCR-testid mängivad mitokondriaalses diagnostikas olulist rolli, võimaldades tuvastada mitokondriaalse DNA (mtDNA) mutatsioone, deletsioone või koopiaarvu variatsioone. Need võimaldavad amplifitseerida konkreetseid mtDNA piirkondi, et tuvastada mitokondriaalsete häiretega seotud patogeenseid variante. PCR-põhiseid meetodeid, nagu kvantitatiivne PCR (qPCR) ja pikkade fragmentide PCR (long-range PCR), kasutatakse ka mtDNA terviklikkuse, heteroplasmia taseme ja mtDNA depletsiooni hindamiseks, andes olulist teavet mitokondrite funktsiooni ja haiguste kohta.
Lugege, kuidas UIP400MTP mikroplaadi sonikaator hõlbustab PCR-teste ja -analüüse!
Mis on diferentsiaaltsentrifuugimine?
Diferentsiaaltsentrifuugimine on laialdaselt kasutatav meetod rakkude fraktsioneerimiseks ja mitokondrite isoleerimiseks. See meetod eraldab rakustruktuurid nende settimiskoefitsiendi alusel, mis sõltub nii tihedusest kui ka kujust. Protsess hõlmab erineva tsentrifugaaljõu rakendamist proovidele pufeeritud soolalahustes, millel on kindlad tihedused. Sarnaste settimiskoefitsientidega struktuurid settivad kogumistoru põhja samal ajal, mis võimaldab neid taastada.
Kuidas kasutatakse diferentsiaaltsentrifuugimist mitokondrite isoleerimiseks?
Diferentsiaaltsentrifuugimine võimaldab teadlastel mitokondriaalseid fraktsioone teistest rakukomponentidest tõhusalt eraldada. Mitokondrite isoleerimine hõlmab mitut tsentrifuugimisetappi ja isolaadi järgnevat taastamist.
Esialgne tsentrifuugimine: Rakendage madalat tsentrifugaaljõudu, et settitada suured rakujäägid ja tuumad.
Järgnevad tsentrifuugimised: Suurendage tsentrifugaaljõudu astmeliselt, et sadestada mitokondritega rikastatud fraktsioonid. Iga tsentrifuugimisetapp eemaldab struktuurid üha suuremate settimiskoefitsientidega.
Fraktsiooni taastamine: Pärast iga tsentrifuugimist kogutakse sade ning supernatant allutatakse suuremale g-jõule, et isoleerida järgmine fraktsioon. Seda korratakse, kuni saavutatakse mitokondrite soovitud puhtus.