Suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamine mitokondriaalseks diagnostikaks
Mitokondriaalne diagnostika teadusuuringutes ja kliinikutes viiakse läbi erinevate tehnikate abil, nagu sekveneerimine, PCR ja biokeemilised analüüsid. Neid meetodeid kasutatakse DNA mutatsioonide tuvastamiseks ja mitokondriaalse funktsiooni mõõtmiseks. Sekveneerimine aitab tuvastada geneetilisi mutatsioone, samas kui PCR võib kvantifitseerida spetsiifilisi DNA järjestusi. Biokeemilised analüüsid hindavad mitokondriaalsete valkude ja ensüümide funktsionaalsust.
Mitokondriaalsete haiguste diagnoosimine on eriti keeruline nende haiguste väljendunud kliinilise varieeruvuse tõttu, samuti kahe erinevalt päritud genoomi: mitokondriaalse DNA (mtDNA) ja tuumagenoomi keerulise koostoime tõttu.
DNA ekstraheerimine ja killustumine ultrahelitöötluse abil
DNA eraldamine lihaskoest on eriti kasulik siis, kui kahtlustatakse koespetsiifilisi muutusi mtDNA-s. Need muutused võivad hõlmata mtDNA deletsioone kroonilises progresseeruvas välises oftalmopleegias (CPEO), mtDNA punktmutatsioone mitokondriaalsetes müopaatiates või mtDNA ammendumist Alpersi sündroomi korral. Lihaskoest ekstraheeritud DNA-d saab seejärel kasutada mitmesugusteks geneetilisteks testideks, näiteks Southern blot ja pikamaa PCR deletsioonide jaoks, reaalajas PCR ammendumiseks või sekveneerimine punktmutatsioonide jaoks.
Sonikatsiooni, kasutades intensiivseid ultraheli laineid, rakendatakse mitmetes rakendustes mitokondriaalses diagnostikas. Seda kasutatakse rakkude lüüsimiseks rakusisese sisu, näiteks mitokondrite ja DNA ekstraheerimiseks, DNA (nt mtDNA ja nDNA) nihutamiseks sekveneerimiseks ja proovide homogeniseerimiseks.
UIP400MTP Plate Sonicator suure läbilaskevõimega proovi ettevalmistamiseks sonikeerib ühtlaselt proove mitme kaevu ja 96 auguga plaatidel
Kuidas eraldada mitokondrid rakkudest ja kudedest
Mitokondriaalne isolatsioon koosneb kahest olulisest etapist: rakkude häirimine nende sisu vabastamiseks ja diferentsiaalse tsentrifuugimise kasutamine mitokondriaalsete fraktsioonide eraldamiseks ja taastamiseks.
ultrahelitöötlus
Hielscheri sonikaatorid ühilduvad standardsete lüüsipuhvrite ja komplektidega, muutes need sobivaks mitokondrite isoleerimiseks. Sonikatsioon teenib kahte peamist eesmärki:
- Rakkude lüüs: Ultraheli lained häirivad rakumembraane, vabastades rakusisese sisu.
- Mitokondriaalsed häired: Sonikatsioon järgnevas etapis võib mitokondrid lahti murda, et vabastada mitokondriaalsed valgud või mitokondriaalne DNA.
- mtDNA killustatus: Sonikatsioon on usaldusväärne meetod mitokondriaalse DNA lõikamiseks sekveneerimiseks.
Mitme kaevuga plaadi sonikaatori UIP400MTP võimaldab mitokondriaalsete proovide suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamist. Koos diferentsiaalse tsentrifuugimisega suurendab ultrahelitöötlus mitokondriaalse isolatsiooni efektiivsust, tagades tervete mitokondrite kõrge saagise, mis sobivad erinevatele järgnevatele rakendustele.
Hielscher UIP400MTP mitmekihilise plaadi sonikaator Töötab mis tahes standardplaadiga
Mitme auguga plaadi sonikaatori UIP400MTP pakub arvukalt eeliseid suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamiseks, nt mitokondriaalses diagnostikas.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator suure läbilaskevõimega proovide ettevalmistamiseks biomarkeri diagnostikas.
Ultraheli mtDNA killustumise eeskujulikud juhised
Valmistamine ja ekstraheerimine:
- C57BL/6 hiired tapeti emakakaela dislokatsiooni tõttu.
- Maksad ekstraheeriti kiiresti ja pesti jääkülmas steriilses fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses.
Mitokondrite isolatsioon:
- Mitokondrid eraldati 2-ml Dounce koeveski ja mitokondrite koeisolatsioonikomplekti abil.
- Esialgne tsentrifuugimine 700× g ja 3 000× g juures.
- Tehke kaks täiendavat pesemisetappi puhvriga C.
DNA eraldamine:
- Esimesel tsentrifuugimisel saadud pelletit 700× g juures kasutati tuuma DNA (nDNA) eraldamiseks.
- DNA eraldati spin-kolonnide abil.
- Mitokondriaalne DNA (mtDNA) eraldati isoleeritud mitokondritest.
- Tuuma DNA (nDNA) ekstraheeriti töötlemata tuumaekstraktidest, mõlemad hiire maksakoest.
DNA killustatus:
- DNA killustati jääl, kasutades 30-kHz / 50-W ultraheli sonikaatorit UP50H koos 0,5 mm mikrootsaga sonotrode 14 μm juures 2 × 30 sekundit.
Killustatuse visualiseerimine ja kvantifitseerimine:
- Killustumine pärast ultraheliuuringut visualiseeriti 1% agaroosgeelil SYBR-ohutu DNA värviga.
- MtDNA ja nDNA suhteline arvukus määrati qPCR-iga.
(vrd Mariero et al., 2019)
Suure läbilaskevõimega proovi ettevalmistamiseks hõlbustab mitme auguga plaadi sonikaatori UIP400MTP suurte proovinumbrite ettevalmistamist standardsetes 96-süvendi, mitme kaevu ja mikrotiiterplaatides.
Lisateavet suure läbilaskevõimega proovi ettevalmistamise eeliste kohta leiate UIP400MTP abil!
Nõuanded optimaalseks mitokondrite isoleerimiseks ultrahelitöötluse abil:
- Temperatuuri reguleerimine: Tehke kõik sammud temperatuurivahemikus 0 ° C kuni 4 ° C. See on mitokondrite terviklikkuse ja funktsionaalsuse säilitamiseks kriitilise tähtsusega.
- Tõhusus ja kiirus: Töötage kiiresti ja puhastage mitokondrid ainult teie konkreetse rakenduse jaoks vajalikus ulatuses. Liigne manipuleerimine võib põhjustada mitokondriaalse sisu olulist kadu.
- Suspensioonide lahjendamine: Raku- ja organellisuspensioonide madalaid kontsentratsioone säilitatakse kogu isolatsiooniprotsessi vältel. See aitab minimeerida püüniste ja aglutinatsiooni riske, parandades seeläbi isoleeritud mitokondrite puhtust.
- Proovi maht: Valige mitu väikesemahulist preparaati, mitte üks suur. Selle lähenemisviisi tulemuseks on tavaliselt parem saagikus, kuna suurendamine ei suurenda proportsionaalselt kaetavate mitokondrite hulka. Mitme auguga plaadi sonikaatori UIP400MTP hõlbustab raku kiiret ja usaldusväärset lüüsi mitokondrite isoleerimiseks, samuti valgu ekstraheerimist mitokondritest.
Need juhised muudavad isoleerimisprotsessi ultraheli lüüsi ja tsentrifuugimise abil tõhusamaks, saades kvaliteetseid mitokondriaalseid preparaate, mis sobivad järgnevateks rakendusteks.
Hielscher Sonicators – Kvaliteet Valmistatud Saksamaal
Hielscheri ultrasonikaatorid on tuntud oma kõrgeimate kvaliteedi- ja disainistandardite poolest. Vastupidavus ja lihtne kasutamine võimaldavad meie ultrasonikaatorite sujuvat integreerimist tööstusrajatistesse. Hielscheri ultrasonikaatorid saavad kergesti käsitseda karmid tingimused ja nõudlikud keskkonnad.
Hielscher Ultrasonics on ISO sertifitseeritud ettevõte ja paneb erilist rõhku suure jõudlusega ultrasonikaatoritele, millel on tipptasemel tehnoloogia ja kasutajasõbralikkus. Loomulikult on Hielscheri ultrasonikaatorid CE-nõuetele vastavad ja vastavad UL, CSA ja RoHs nõuetele.
96-augulise plaadi sonikaatori UIP400MTP mikrotiiteri ja mitmekihiliste plaatide ultraheliga töötlemiseks
Kirjandus / Viited
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Korduma kippuvad küsimused mitokondrite ja mitokondriaalse diagnostika kohta
Mis on mitokondrid?
Mitokondrid on membraaniga seotud organellid, mida leidub enamiku eukarüootsete organismide rakkudes. Neid tuntakse raku jõujaamadena, kuna nad toodavad raku hingamise protsessi kaudu energiat adenosiintrifosfaadi (ATP) kujul. Lisaks on mitokondritel oma DNA ja nad mängivad võtmerolli teistes rakulistes protsessides, sealhulgas rakutsükli reguleerimisel ja rakusurmal.
Mis eristab mtDNA-d genoomsest DNA-st?
Mitokondriaalne DNA (mtDNA) erineb genoomsest DNA-st (gDNA) mitmel olulisel viisil. MtDNA asub mitokondrites, on ringikujuline ja emalt päritud, samas kui gDNA asub rakutuumas, on lineaarne ja pärineb mõlemalt vanemalt. MtDNA on palju väiksem, kodeerides ainult 37 geeni, samas kui gDNA sisaldab umbes 20 000–25 000 geeni. MtDNA esineb mitmes koopias raku kohta, sellel on suurem mutatsioonikiirus ja peamiselt mitokondriaalses funktsioonis osalevate valkude koodid. Seevastu gDNA on tavaliselt diploidne, madalama mutatsioonikiirusega ja kodeerib suurt hulka geene, mis on vajalikud organismi arenguks ja toimimiseks. Lisaks toimub mitokondrites mtDNA transkriptsioon ja translatsioon, samas kui gDNA transkriptsioon toimub tuumas ja translatsioon toimub tsütoplasmas. Need erinevused peegeldavad nende erinevaid rolle ja evolutsioonilist päritolu.
Mis on rakuvaba ekstrakt?
Rakuvaba ekstrakt on lahus, mis sisaldab lüüsitud rakkude sisu, sealhulgas valke, nukleiinhappeid ja muid rakulisi komponente, kuid ilma puutumata rakumembraanideta. Seda ekstrakti kasutatakse biokeemilistes ja molekulaarbioloogia uuringutes rakuprotsesside uurimiseks in vitro, võimaldades teadlastel analüüsida reaktsioone ja mehhanisme väljaspool elusrakke.
Milline roll on PCR-testidel mitokondriaalses diagnostikas?
PCR-testid mängivad mitokondriaalses diagnostikas kriitilist rolli, võimaldades tuvastada mitokondriaalse DNA (mtDNA) mutatsioone, deletsioone või koopiate arvu variatsioone. Need võimaldavad võimendada spetsiifilisi mtDNA piirkondi, et tuvastada mitokondriaalsete häiretega seotud patogeenseid variante. PCR-põhiseid tehnikaid, nagu kvantitatiivne PCR (qPCR) ja pikamaa PCR, kasutatakse ka mtDNA terviklikkuse, heteroplasmia taseme ja mtDNA ammendumise hindamiseks, pakkudes olulist teavet mitokondrite funktsiooni ja haiguste kohta.
Siit saate teada, kuidas UIP400MTP Microplate Sonicator hõlbustab PCR-teste ja analüüse!
Mis on diferentsiaalne tsentrifuugimine?
Diferentsiaalne tsentrifuugimine on laialdaselt kasutatav meetod rakkude fraktsioneerimiseks ja mitokondriaalseks eraldamiseks. See meetod eraldab rakustruktuurid nende settimiskoefitsiendi alusel, mis sõltub nii tihedusest kui ka kujust. Protsess hõlmab erineva tsentrifugaaljõu rakendamist proovidele puhverdatud soolalahustes, millel on spetsiifilised tihedused. Sarnaste setteteguritega struktuurid settivad samal ajal kogumistoru põhja, võimaldades nende taastumist.
Kuidas kasutatakse mitokondrite isoleerimiseks diferentsiaaltsentrifuugimist?
Diferentsiaalne tsentrifuugimine võimaldab teadlastel tõhusalt eraldada mitokondriaalseid fraktsioone teistest rakulistest komponentidest. Mitokondrite isoleerimine hõlmab mitmeid tsentrifuugimise etappe ja sellele järgnevat isolaadi taastumist.
Esialgne tsentrifuugimine: Rakendage madalat tsentrifugaaljõudu setetele, suurtele rakulistele prahtidele ja tuumadele.
Järgnevad tsentrifuugimised: Tsentrifugaaljõudu suurendatakse järk-järgult mitokondritega rikastatud pelletifraktsioonideni. Iga tsentrifuugimise etapp eemaldab järk-järgult kõrgemate setitusteguritega struktuurid.
Fraktsioonide taaskasutamine: Pärast iga tsentrifuugimist kogutakse pellet kokku ja supernatandile rakendatakse järgmise fraktsiooni eraldamiseks suuremaid g-jõude. Seda korratakse, kuni saavutatakse mitokondrite soovitud puhtus.