Προετοιμασία δειγμάτων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας για τη μιτοχονδριακή διαγνωστική
Η μιτοχονδριακή διαγνωστική στην έρευνα και στην κλινική πράξη πραγματοποιείται με διάφορες τεχνικές, όπως η αλληλούχηση, η PCR και οι βιοχημικές δοκιμασίες. Οι μέθοδοι αυτές χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση μεταλλάξεων του DNA και τη μέτρηση της μιτοχονδριακής λειτουργίας. Η αλληλούχηση βοηθά στην ανίχνευση γενετικών μεταλλάξεων, ενώ η PCR μπορεί να ποσοτικοποιήσει συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA. Οι βιοχημικές δοκιμασίες αξιολογούν τη λειτουργικότητα των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών και ενζύμων.
Η διάγνωση των μιτοχονδριακών νοσημάτων είναι ιδιαίτερα δύσκολη λόγω της έντονης κλινικής μεταβλητότητας αυτών των νοσημάτων, καθώς και λόγω της πολύπλοκης αλληλεπίδρασης μεταξύ δύο γονιδιωμάτων που κληρονομούνται με διαφορετικό τρόπο: του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) και του πυρηνικού γονιδιώματος.
Εκχύλιση και κατακερματισμός DNA με κατεργασία με υπερήχους
Η εκχύλιση DNA από μυϊκό ιστό είναι ιδιαίτερα χρήσιμη όταν υπάρχει υποψία ιστοειδικών μεταβολών του mtDNA. Αυτές οι μεταβολές ενδέχεται να περιλαμβάνουν ελλείψεις του mtDNA στη χρόνια προοδευτική εξωτερική οφθαλμοπληγία (CPEO), σημειακές μεταλλάξεις του mtDNA στις μιτοχονδριακές μυοπάθειες ή μείωση της ποσότητας του mtDNA στο σύνδρομο Alpers. Το DNA που εκχυλίζεται από μυϊκό ιστό μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί για διάφορες γενετικές εξετάσεις, όπως υβριδισμό Southern και PCR μεγάλου μήκους για τις ελλείψεις, PCR πραγματικού χρόνου για τη μείωση της ποσότητας του mtDNA ή αλληλούχηση για τις σημειακές μεταλλάξεις.
Η κατεργασία με υπερήχους, με τη χρήση έντονων υπερηχητικών κυμάτων, χρησιμοποιείται σε διάφορες εφαρμογές της μιτοχονδριακής διαγνωστικής. Χρησιμοποιείται για τη λύση κυττάρων με σκοπό την εκχύλιση ενδοκυτταρικού περιεχομένου, όπως μιτοχονδρίων και DNA, για τον κατακερματισμό DNA μέσω διάτμησης, όπως του mtDNA και του nDNA, για αλληλούχηση, καθώς και για την ομογενοποίηση δειγμάτων.
Συσκευή υπερήχων για πλάκες UIP400MTP για προετοιμασία δειγμάτων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας υποβάλλει ομοιόμορφα σε κατεργασία με υπερήχους δείγματα σε πλάκες πολλαπλών βοθρίων και πλάκες 96 βοθρίων
Πώς να απομονώσετε μιτοχόνδρια από κύτταρα και ιστούς
Η απομόνωση μιτοχονδρίων περιλαμβάνει δύο βασικά βήματα: τη διάρρηξη των κυττάρων για την απελευθέρωση του περιεχομένου τους και τη χρήση διαφορικής φυγοκέντρησης για τον διαχωρισμό και την ανάκτηση των μιτοχονδριακών κλασμάτων.
Κατεργασία με υπερήχους
Οι συσκευές υπερήχων της Hielscher είναι συμβατές με συνήθη ρυθμιστικά διαλύματα και κιτ λύσης, γεγονός που τις καθιστά κατάλληλες για την απομόνωση μιτοχονδρίων. Η κατεργασία με υπερήχους εξυπηρετεί δύο κύριους σκοπούς:
- Κυτταρική λύση: Τα υπερηχητικά κύματα διαρρηγνύουν τις κυτταρικές μεμβράνες, απελευθερώνοντας το ενδοκυτταρικό περιεχόμενο.
- Μιτοχονδριακή διάρρηξη: Η κατεργασία με υπερήχους σε επόμενο βήμα μπορεί να διαρρήξει τα μιτοχόνδρια για την απελευθέρωση μιτοχονδριακών πρωτεϊνών ή μιτοχονδριακού DNA.
- Κατακερματισμός mtDNA: Η κατεργασία με υπερήχους είναι μια αξιόπιστη τεχνική για τον κατακερματισμό του μιτοχονδριακού DNA μέσω διάτμησης για αλληλούχηση.
Η συσκευή υπερήχων για πλάκες πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP επιτρέπει την προετοιμασία μιτοχονδριακών δειγμάτων με υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα. Σε συνδυασμό με τη διαφορική φυγοκέντρηση, η κατεργασία με υπερήχους ενισχύει την αποτελεσματικότητα της απομόνωσης μιτοχονδρίων, εξασφαλίζοντας υψηλές αποδόσεις άθικτων μιτοχονδρίων κατάλληλων για διάφορες επακόλουθες εφαρμογές.
Η συσκευή υπερήχων για πλάκες πολλαπλών βοθρίων Hielscher UIP400MTP λειτουργεί με οποιαδήποτε τυπική πλάκα
Η συσκευή υπερήχων για πλάκες πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP προσφέρει πολυάριθμα πλεονεκτήματα για την προετοιμασία δειγμάτων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας, π.χ. στη μιτοχονδριακή διαγνωστική.
Συσκευή υπερήχων για πλάκες πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP για προετοιμασία δειγμάτων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας στη διαγνωστική με βιοδείκτες.
Ενδεικτικές οδηγίες για τον κατακερματισμό mtDNA με υπερήχους
Προετοιμασία και εκχύλιση:
- Ποντίκια C57BL/6 θανατώθηκαν με αυχενική εξάρθρωση.
- Τα ήπατα αφαιρέθηκαν γρήγορα και πλύθηκαν σε παγωμένο στείρο PBS.
Απομόνωση μιτοχονδρίων:
- Τα μιτοχόνδρια απομονώθηκαν με τη χρήση ομογενοποιητή ιστών Dounce 2-mL και ενός κιτ απομόνωσης μιτοχονδρίων από ιστό.
- Αρχική φυγοκέντρηση στα 700× g και 3.000× g.
- Εκτελέστε δύο επιπλέον βήματα πλύσης με ρυθμιστικό διάλυμα C.
Απομόνωση DNA:
- Το ίζημα από την πρώτη φυγοκέντρηση στα 700× g χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση πυρηνικού DNA (nDNA).
- Το DNA απομονώθηκε με τη χρήση στηλών φυγοκέντρησης.
- Το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) εκχυλίστηκε από απομονωμένα μιτοχόνδρια.
- Το πυρηνικό DNA (nDNA) εκχυλίστηκε από ακατέργαστα πυρηνικά εκχυλίσματα, και στις δύο περιπτώσεις από ηπατικό ιστό ποντικού.
Κατακερματισμός DNA:
- Το DNA κατακερματίστηκε επί πάγου με τη χρήση συσκευής υπερήχων UP50H 30-kHz/50-W με ηχοτρόδιο μικροάκρου 0,5-mm στα 14 μm για 2 × 30 δευτερόλεπτα.
Οπτικοποίηση και ποσοτικοποίηση του κατακερματισμού:
- Ο κατακερματισμός μετά την κατεργασία με υπερήχους απεικονίστηκε σε πήκτωμα αγαρόζης 1% με τη χρωστική DNA SYBR safe.
- Η σχετική αφθονία του mtDNA και του nDNA προσδιορίστηκε με qPCR.
(cf. Mariero et al., 2019)
Για την προετοιμασία δειγμάτων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας, η συσκευή υπερήχων πλακών πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP διευκολύνει την προετοιμασία μεγάλου αριθμού δειγμάτων σε τυπικές πλάκες 96 βοθρίων, πλάκες πολλαπλών βοθρίων και πλάκες μικροτιτλοδότησης.
Διαβάστε περισσότερα για τα πλεονεκτήματα της προετοιμασίας δειγμάτων υψηλής διεκπεραιωτικής ικανότητας με το UIP400MTP!
Συμβουλές για βέλτιστη απομόνωση μιτοχονδρίων με κατεργασία με υπερήχους:
- Έλεγχος θερμοκρασίας: Εκτελέστε όλα τα βήματα σε εύρος θερμοκρασίας από 0°C έως 4°C. Αυτό είναι κρίσιμο για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της λειτουργικότητας των μιτοχονδρίων.
- Αποτελεσματικότητα και ταχύτητα: Εργαστείτε γρήγορα και καθαρίστε τα μιτοχόνδρια μόνο στον βαθμό που απαιτείται για τη συγκεκριμένη εφαρμογή σας. Οι υπερβολικοί χειρισμοί μπορούν να οδηγήσουν σε σημαντικές απώλειες μιτοχονδριακού περιεχομένου.
- Αραίωση εναιωρημάτων: Διατηρήστε χαμηλές συγκεντρώσεις στα εναιωρήματα κυττάρων και οργανιδίων καθ’ όλη τη διαδικασία απομόνωσης. Αυτό συμβάλλει στην ελαχιστοποίηση των κινδύνων παγίδευσης και συγκόλλησης, βελτιώνοντας έτσι την καθαρότητα των απομονωμένων μιτοχονδρίων.
- Όγκος δείγματος: Επιλέξτε πολλαπλές παρασκευές μικρής κλίμακας αντί για μία μεγάλης κλίμακας. Αυτή η προσέγγιση συνήθως αποφέρει καλύτερες αποδόσεις, καθώς η αύξηση της κλίμακας δεν αυξάνει αναλογικά την ποσότητα των μιτοχονδρίων που μπορούν να ανακτηθούν. Η συσκευή υπερήχων πλακών πολλαπλών βοθρίων UIP400MTP διευκολύνει την ταχεία και αξιόπιστη λύση κυττάρων για την απομόνωση μιτοχονδρίων, καθώς και την εκχύλιση πρωτεϊνών από τα μιτοχόνδρια.
Αυτές οι κατευθυντήριες οδηγίες θα καταστήσουν αποτελεσματικότερη τη διαδικασία απομόνωσης με λύση μέσω υπερήχων και φυγοκέντρηση, αποδίδοντας μιτοχονδριακά παρασκευάσματα υψηλής ποιότητας, κατάλληλα για επακόλουθες εφαρμογές.
Συσκευές υπερήχων Hielscher – Ποιότητα κατασκευασμένη στη Γερμανία
Οι συσκευές υπερήχων Hielscher είναι ευρέως γνωστές για τα ανώτατα πρότυπα ποιότητας και σχεδιασμού τους. Η ανθεκτικότητα και η εύκολη λειτουργία επιτρέπουν την ομαλή ενσωμάτωση των συσκευών υπερήχων μας σε βιομηχανικές εγκαταστάσεις. Οι συσκευές υπερήχων Hielscher ανταποκρίνονται εύκολα σε αντίξοες συνθήκες και απαιτητικά περιβάλλοντα.
Η Hielscher Ultrasonics είναι εταιρεία πιστοποιημένη κατά ISO και δίνει ιδιαίτερη έμφαση στις συσκευές υπερήχων υψηλών επιδόσεων που διαθέτουν τεχνολογία αιχμής και είναι φιλικές προς τον χρήστη. Φυσικά, οι συσκευές υπερήχων Hielscher συμμορφώνονται με τις απαιτήσεις CE και πληρούν τις απαιτήσεις UL, CSA και RoHs.
Συσκευή υπερήχων πλακών 96 βοθρίων UIP400MTP για την κατεργασία πλακών μικροτιτλοδότησης και πλακών πολλαπλών βοθρίων με υπερήχους
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Συχνές ερωτήσεις για τα μιτοχόνδρια και τη μιτοχονδριακή διαγνωστική
Τι είναι τα μιτοχόνδρια;
Τα μιτοχόνδρια είναι οργανίδια που περιβάλλονται από μεμβράνη και βρίσκονται στα κύτταρα των περισσότερων ευκαρυωτικών οργανισμών. Είναι γνωστά ως οι σταθμοί παραγωγής ενέργειας του κυττάρου, επειδή παράγουν ενέργεια με τη μορφή τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) μέσω της διαδικασίας της κυτταρικής αναπνοής. Επιπλέον, τα μιτοχόνδρια έχουν το δικό τους DNA και διαδραματίζουν βασικούς ρόλους σε άλλες κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού θανάτου.
Τι διαφοροποιεί το mtDNA από το γονιδιωματικό DNA;
Το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) διαφέρει από το γονιδιωματικό DNA (gDNA) σε αρκετά βασικά σημεία. Το mtDNA βρίσκεται στα μιτοχόνδρια, είναι κυκλικό και κληρονομείται από τη μητέρα, ενώ το gDNA βρίσκεται στον κυτταρικό πυρήνα, είναι γραμμικό και κληρονομείται και από τους δύο γονείς. Το mtDNA είναι πολύ μικρότερο και κωδικοποιεί μόνο 37 γονίδια, ενώ το gDNA περιέχει περίπου 20.000–25.000 γονίδια. Το mtDNA υπάρχει σε πολλαπλά αντίγραφα ανά κύτταρο, έχει υψηλότερο ρυθμό μεταλλάξεων και κωδικοποιεί κυρίως πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη μιτοχονδριακή λειτουργία. Αντίθετα, το gDNA είναι συνήθως διπλοειδές, έχει χαμηλότερο ρυθμό μεταλλάξεων και κωδικοποιεί ένα ευρύτατο σύνολο γονιδίων απαραίτητων για την ανάπτυξη και τη λειτουργία του οργανισμού. Επιπλέον, η μεταγραφή και η μετάφραση του mtDNA πραγματοποιούνται μέσα στα μιτοχόνδρια, ενώ η μεταγραφή του gDNA πραγματοποιείται στον πυρήνα και η μετάφρασή του στο κυτταρόπλασμα. Αυτές οι διαφορές αντικατοπτρίζουν τους διακριτούς ρόλους και την εξελικτική τους προέλευση.
Τι είναι το εκχύλισμα ελεύθερο κυττάρων;
Ένα εκχύλισμα ελεύθερο κυττάρων είναι ένα διάλυμα που περιέχει το περιεχόμενο κυττάρων που έχουν υποστεί λύση, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων και άλλων κυτταρικών συστατικών, αλλά χωρίς ακέραιες κυτταρικές μεμβράνες. Το εκχύλισμα αυτό χρησιμοποιείται στην έρευνα της βιοχημείας και της μοριακής βιολογίας για τη μελέτη κυτταρικών διεργασιών in vitro, επιτρέποντας στους ερευνητές να αναλύουν αντιδράσεις και μηχανισμούς εκτός ζωντανών κυττάρων.
Ποιον ρόλο διαδραματίζουν οι εξετάσεις PCR στη μιτοχονδριακή διαγνωστική;
Οι εξετάσεις PCR διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στη μιτοχονδριακή διαγνωστική, επιτρέποντας την ανίχνευση μεταλλάξεων, ελλείψεων ή μεταβολών στον αριθμό αντιγράφων του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA). Επιτρέπουν την ενίσχυση συγκεκριμένων περιοχών του mtDNA για τον εντοπισμό παθογόνων παραλλαγών που σχετίζονται με μιτοχονδριακές διαταραχές. Τεχνικές που βασίζονται στην PCR, όπως η ποσοτική PCR (qPCR) και η PCR μεγάλου μήκους, χρησιμοποιούνται επίσης για την αξιολόγηση της ακεραιότητας του mtDNA, των επιπέδων ετεροπλασμίας και της εξάντλησης του mtDNA, παρέχοντας ουσιώδεις πληροφορίες για τη μιτοχονδριακή λειτουργία και νόσο.
Μάθετε πώς η συσκευή υπερήχων μικροπλακών UIP400MTP διευκολύνει τις εξετάσεις και τις δοκιμασίες PCR!
Τι είναι η διαφορική φυγοκέντρηση;
Η διαφορική φυγοκέντρηση είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική για την κυτταρική κλασμάτωση και την απομόνωση μιτοχονδρίων. Η μέθοδος αυτή διαχωρίζει τις κυτταρικές δομές με βάση τον συντελεστή καθίζησής τους, ο οποίος εξαρτάται τόσο από την πυκνότητα όσο και από το σχήμα τους. Η διαδικασία περιλαμβάνει την εφαρμογή φυγόκεντρης δύναμης διαφορετικής έντασης σε δείγματα μέσα σε ρυθμισμένα αλατούχα διαλύματα με συγκεκριμένες πυκνότητες. Δομές με παρόμοιους συντελεστές καθίζησης καθιζάνουν στον πυθμένα του σωλήνα συλλογής ταυτόχρονα, επιτρέποντας την ανάκτησή τους.
Πώς χρησιμοποιείται η διαφορική φυγοκέντρηση για την απομόνωση μιτοχονδρίων;
Η διαφορική φυγοκέντρηση επιτρέπει στους ερευνητές να διαχωρίζουν αποτελεσματικά τα μιτοχονδριακά κλάσματα από άλλα κυτταρικά συστατικά. Η απομόνωση μιτοχονδρίων περιλαμβάνει αρκετά στάδια φυγοκέντρησης και την επακόλουθη ανάκτηση του απομονωμένου υλικού.
Αρχική φυγοκέντρηση: Εφαρμόστε χαμηλή φυγόκεντρη δύναμη για την καθίζηση μεγάλων κυτταρικών υπολειμμάτων και πυρήνων.
Επόμενες φυγοκεντρήσεις: Αυξήστε σταδιακά τη φυγόκεντρη δύναμη ώστε να σχηματιστούν ιζήματα από κλάσματα εμπλουτισμένα σε μιτοχόνδρια. Κάθε στάδιο φυγοκέντρησης απομακρύνει δομές με προοδευτικά υψηλότερους συντελεστές καθίζησης.
Ανάκτηση κλασμάτων: Μετά από κάθε φυγοκέντρηση, συλλέγεται το ίζημα και το υπερκείμενο υποβάλλεται σε υψηλότερες δυνάμεις g για την απομόνωση του επόμενου κλάσματος. Αυτό επαναλαμβάνεται μέχρι να επιτευχθεί η επιθυμητή καθαρότητα των μιτοχονδρίων.