Προετοιμασία δείγματος υψηλής απόδοσης για μιτοχονδριακή διάγνωση
Η μιτοχονδριακή διάγνωση στην έρευνα και τις κλινικές πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας διάφορες τεχνικές όπως αλληλούχιση, PCR και βιοχημικές δοκιμασίες. Αυτές οι μέθοδοι χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό μεταλλάξεων DNA και τη μέτρηση της λειτουργίας των μιτοχονδρίων. Η αλληλούχιση βοηθά στην ανίχνευση γενετικών μεταλλάξεων, ενώ η PCR μπορεί να ποσοτικοποιήσει συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA. Οι βιοχημικές δοκιμασίες αξιολογούν τη λειτουργικότητα των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών και ενζύμων.
Η διάγνωση των μιτοχονδριακών ασθενειών είναι ιδιαίτερα δύσκολη λόγω της έντονης κλινικής μεταβλητότητας αυτών των ασθενειών, καθώς και λόγω της πολύπλοκης αλληλεπίδρασης μεταξύ δύο διαφορετικά κληρονομικών γονιδιωμάτων: του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) και του πυρηνικού γονιδιώματος.
Εκχύλιση DNA και κατακερματισμός χρησιμοποιώντας κατεργασία με υπερήχους
Η εξαγωγή DNA από μυϊκό ιστό είναι ιδιαίτερα χρήσιμη όταν υπάρχει υποψία για αλλαγές στο mtDNA που αφορούν συγκεκριμένους ιστούς. Αυτές οι αλλαγές μπορεί να περιλαμβάνουν διαγραφές του mtDNA σε χρόνια προοδευτική εξωτερική οφθαλμοπληγία (CPEO), σημειακές μεταλλάξεις του mtDNA σε μιτοχονδριακές μυοπάθειες ή εξάντληση του mtDNA στο σύνδρομο Alpers. Το DNA που εξάγεται από τον μυϊκό ιστό μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί για διάφορες γενετικές εξετάσεις, όπως η νότια κηλίδα και η PCR μεγάλης εμβέλειας για διαγραφές, η PCR σε πραγματικό χρόνο για εξάντληση ή η αλληλούχιση για σημειακές μεταλλάξεις.
Κατεργασία με υπερήχους, χρησιμοποιώντας έντονα κύματα υπερήχων, εφαρμόζεται για διάφορες εφαρμογές στη μιτοχονδριακή διάγνωση. Χρησιμοποιείται για τη λύση κυττάρων για την εξαγωγή ενδοκυτταρικών περιεχομένων όπως μιτοχόνδρια και DNA, για τη διάτμηση DNA όπως mtDNA και nDNA για αλληλούχιση και για την ομογενοποίηση δειγμάτων.
UIP400MTP Υπερήχων πλάκας για προετοιμασία δείγματος υψηλής απόδοσης ομοιόμορφα δείγματα υπερήχων σε πλάκες πολλαπλών φρεατίων και 96 φρεατίων
Πώς να απομονώσετε τα μιτοχόνδρια από κύτταρα και ιστούς
Η μιτοχονδριακή απομόνωση περιλαμβάνει δύο βασικά βήματα: τη διατάραξη των κυττάρων για να απελευθερώσουν το περιεχόμενό τους και τη χρήση διαφορικής φυγοκέντρησης για το διαχωρισμό και την ανάκτηση μιτοχονδριακών κλασμάτων.
Υπερήχηση
Hielscher υπερήχων είναι συμβατά με τυποποιημένα ρυθμιστικά λύσης και κιτ, καθιστώντας τα κατάλληλα για την απομόνωση των μιτοχονδρίων. Κατεργασία με υπερήχους εξυπηρετεί δύο κύριους σκοπούς:
- Κυτταρική λύση: Τα υπερηχητικά κύματα διαταράσσουν τις κυτταρικές μεμβράνες, απελευθερώνοντας ενδοκυτταρικό περιεχόμενο.
- Μιτοχονδριακή διαταραχή: Κατεργασία με υπερήχους σε ένα επόμενο βήμα μπορεί να σπάσει ανοίξει τα μιτοχόνδρια για να απελευθερώσει μιτοχονδριακές πρωτεΐνες ή μιτοχονδριακό DNA.
- Κατακερματισμός mtDNA: Κατεργασία με υπερήχους είναι μια αξιόπιστη τεχνική για τη διάτμηση μιτοχονδριακού DNA για αλληλούχιση.
Η UIP400MTP υπερήχων πλάκας πολλαπλών φρεατίων επιτρέπει την προετοιμασία δειγμάτων μιτοχονδριακών δειγμάτων υψηλής απόδοσης. Σε συνδυασμό με τη διαφορική φυγοκέντρηση, η υπερήχηση ενισχύει την αποτελεσματικότητα της μιτοχονδριακής απομόνωσης, εξασφαλίζοντας υψηλές αποδόσεις άθικτων μιτοχονδρίων κατάλληλων για διάφορες κατάντη εφαρμογές.
Hielscher UIP400MTP υπερήχων πλάκας πολλαπλών φρεατίων λειτουργεί με οποιαδήποτε τυπική πλάκα
Η UIP400MTP υπερήχων πλάκας πολλαπλών φρεατίων προσφέρει πολλά οφέλη για την προετοιμασία δειγμάτων υψηλής απόδοσης, π.χ. στη μιτοχονδριακή διάγνωση.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator για προετοιμασία δείγματος υψηλής απόδοσης στη διάγνωση βιοδεικτών.
Υποδειγματικές οδηγίες για υπερηχητικό κατακερματισμό mtDNA
Προετοιμασία και εκχύλιση:
- Τα ποντίκια C57BL/6 θανατώθηκαν από εξάρθρημα του τραχήλου της μήτρας.
- Τα συκώτια εξήχθησαν γρήγορα και πλύθηκαν σε παγωμένο αποστειρωμένο PBS.
Απομόνωση μιτοχονδρίων:
- Τα μιτοχόνδρια απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μύλο ιστού Dounce 2-mL και ένα κιτ απομόνωσης μιτοχονδρίων για ιστό.
- Αρχική φυγοκέντρηση στα 700× g και 3.000× g.
- Εκτελέστε δύο επιπλέον βήματα πλύσης με ρυθμιστικό διάλυμα C.
Απομόνωση DNA:
- Το σφαιρίδιο από την πρώτη φυγοκέντρηση στα 700× g χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση του πυρηνικού DNA (nDNA).
- Το DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας στήλες σπιν.
- Το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) εξήχθη από απομονωμένα μιτοχόνδρια.
- Το πυρηνικό DNA (nDNA) εξήχθη από ακατέργαστα πυρηνικά εκχυλίσματα, και τα δύο από ιστό ήπατος ποντικού.
Κατακερματισμός DNA:
- Το DNA κατακερματίστηκε σε πάγο χρησιμοποιώντας έναν υπερηχητικό υπερηχητικό υπερήχων 30-kHz / 50-W UP50H με ένα sonotrode μικρο-άκρων 0,5 mm στα 14 μm για 2 × 30 δευτερόλεπτα.
Οπτικοποίηση και ποσοτικοποίηση κατακερματισμού:
- Ο κατακερματισμός μετά από υπερήχους απεικονίστηκε σε γέλη αγαρόζης 1% με ασφαλή βαφή DNA SYBR.
- Η σχετική αφθονία mtDNA και nDNA προσδιορίστηκε με qPCR.
(πρβλ. Mariero et al., 2019)
Για την προετοιμασία δειγμάτων υψηλής απόδοσης, ο υπερηχητής πλάκας πολλαπλών φρεατίων διευκολύνει UIP400MTP την προετοιμασία μεγάλων αριθμών δειγμάτων σε τυποποιημένες πλάκες 96-φρεατίων, πολλαπλών φρεατίων και μικροτιτλοδότησης.
Διαβάστε περισσότερα σχετικά με τα πλεονεκτήματα της προετοιμασίας δείγματος υψηλής απόδοσης χρησιμοποιώντας το UIP400MTP!
Συμβουλές για βέλτιστη απομόνωση μιτοχονδρίων χρησιμοποιώντας υπερήχους:
- Έλεγχος θερμοκρασίας: Εκτελέστε όλα τα βήματα σε εύρος θερμοκρασιών από 0°C έως 4°C. Αυτό είναι κρίσιμο για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της λειτουργικότητας των μιτοχονδρίων.
- Αποδοτικότητα και ταχύτητα: Εργαστείτε γρήγορα και καθαρίστε τα μιτοχόνδρια μόνο στο βαθμό που απαιτείται για τη συγκεκριμένη εφαρμογή σας. Η υπερβολική χειραγώγηση μπορεί να οδηγήσει σε σημαντικές απώλειες μιτοχονδριακού περιεχομένου.
- Αραίωση εναιωρημάτων: Διατηρήστε χαμηλές συγκεντρώσεις εναιωρημάτων κυττάρων και οργανιδίων καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας απομόνωσης. Αυτό βοηθά στην ελαχιστοποίηση των κινδύνων παγίδευσης και συγκόλλησης, βελτιώνοντας έτσι την καθαρότητα των απομονωμένων μιτοχονδρίων.
- Όγκος δείγματος: Επιλέξτε πολλαπλές προετοιμασίες μικρής κλίμακας αντί για μία μεγάλη. Αυτή η προσέγγιση συνήθως οδηγεί σε καλύτερες αποδόσεις, καθώς η κλιμάκωση δεν αυξάνει αναλογικά την ποσότητα των ανακτήσιμων μιτοχονδρίων. Ο υπερηχητικός πλάκα πολλαπλών φρεατίων διευκολύνει UIP400MTP την ταχεία και αξιόπιστη λύση του κυττάρου για απομόνωση μιτοχονδρίων καθώς και την εκχύλιση πρωτεϊνών από μιτοχόνδρια.
Αυτές οι κατευθυντήριες γραμμές θα κάνουν τη διαδικασία απομόνωσης χρησιμοποιώντας υπερηχητική λύση και φυγοκέντρηση πιο αποτελεσματική, αποδίδοντας υψηλής ποιότητας μιτοχονδριακά παρασκευάσματα κατάλληλα για κατάντη εφαρμογές.
Hielscher Sonicators – Ποιότητα Made in Germany
Hielscher υπερήχων είναι γνωστή για την υψηλότερη ποιότητα και τα πρότυπα σχεδιασμού τους. Η ευρωστία και η εύκολη λειτουργία επιτρέπουν την ομαλή ενσωμάτωση των υπερήχων μας σε βιομηχανικές εγκαταστάσεις. Οι σκληρές συνθήκες και τα απαιτητικά περιβάλλοντα αντιμετωπίζονται εύκολα από τους υπερήχους Hielscher.
Hielscher Υπέρηχοι είναι μια πιστοποιημένη εταιρεία ISO και δίνουν ιδιαίτερη έμφαση σε υψηλής απόδοσης υπερήχων που διαθέτουν state-of-the-art τεχνολογία και φιλικότητα προς το χρήστη. Φυσικά, Hielscher υπερήχων είναι CE συμβατό και πληρούν τις απαιτήσεις των UL, CSA και RoHs.
Υπερήχων πλάκας 96 φρεατίων UIP400MTP για την υπερήχηση πλακών μικροτιτλοδότησης και πολλαπλών φρεατίων
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Συχνές ερωτήσεις σχετικά με τα μιτοχόνδρια και τη διάγνωση των μιτοχονδρίων
Τι είναι τα μιτοχόνδρια;
Τα μιτοχόνδρια είναι οργανίδια συνδεδεμένα με μεμβράνη που βρίσκονται στα κύτταρα των περισσότερων ευκαρυωτικών οργανισμών. Είναι γνωστά ως τα εργοστάσια παραγωγής ενέργειας του κυττάρου επειδή παράγουν ενέργεια με τη μορφή τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) μέσω της διαδικασίας της κυτταρικής αναπνοής. Επιπλέον, τα μιτοχόνδρια έχουν το δικό τους DNA και παίζουν βασικούς ρόλους σε άλλες κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού θανάτου.
Τι διαφοροποιεί το mtDNA από το γονιδιωματικό DNA;
Το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) διαφέρει από το γονιδιωματικό DNA (gDNA) με διάφορους βασικούς τρόπους. Το MtDNA βρίσκεται στα μιτοχόνδρια, είναι κυκλικό και κληρονομείται από τη μητέρα, ενώ το gDNA βρίσκεται στον πυρήνα του κυττάρου, είναι γραμμικό και κληρονομείται και από τους δύο γονείς. Το MtDNA είναι πολύ μικρότερο, κωδικοποιώντας μόνο 37 γονίδια, ενώ το gDNA περιέχει περίπου 20.000-25.000 γονίδια. Το MtDNA υπάρχει σε πολλαπλά αντίγραφα ανά κύτταρο, έχει υψηλότερο ρυθμό μετάλλαξης και κωδικοποιεί κυρίως πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη λειτουργία των μιτοχονδρίων. Αντίθετα, το gDNA είναι τυπικά διπλοειδές, έχει χαμηλότερο ρυθμό μετάλλαξης και κωδικοποιεί μια τεράστια ποικιλία γονιδίων που είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη και τη λειτουργία του οργανισμού. Επιπλέον, η μεταγραφή και η μετάφραση mtDNA συμβαίνουν μέσα στα μιτοχόνδρια, ενώ η μεταγραφή gDNA συμβαίνει στον πυρήνα και η μετάφραση συμβαίνει στο κυτταρόπλασμα. Αυτές οι διαφορές αντικατοπτρίζουν τους διακριτούς ρόλους τους και την εξελικτική τους προέλευση.
Τι είναι το εκχύλισμα χωρίς κύτταρα;
Ένα εκχύλισμα χωρίς κύτταρα είναι ένα διάλυμα που περιέχει το περιεχόμενο των λυμένων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών, των νουκλεϊνικών οξέων και άλλων κυτταρικών συστατικών, αλλά χωρίς άθικτες κυτταρικές μεμβράνες. Αυτό το εκχύλισμα χρησιμοποιείται στην έρευνα βιοχημικής και μοριακής βιολογίας για τη μελέτη κυτταρικών διεργασιών in vitro, επιτρέποντας στους ερευνητές να αναλύσουν αντιδράσεις και μηχανισμούς έξω από τα ζωντανά κύτταρα.
Τι δοκιμές PCR παιχνιδιού ρόλων στη μιτοχονδριακή διάγνωση;
Οι δοκιμές PCR διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στη διάγνωση των μιτοχονδρίων, επιτρέποντας την ανίχνευση μεταλλάξεων, διαγραφών ή παραλλαγών αριθμού αντιγράφων στο μιτοχονδριακό DNA (mtDNA). Επιτρέπουν την ενίσχυση συγκεκριμένων περιοχών mtDNA για τον εντοπισμό παθογόνων παραλλαγών που σχετίζονται με μιτοχονδριακές διαταραχές. Οι τεχνικές που βασίζονται στην PCR, όπως η ποσοτική PCR (qPCR) και η PCR μεγάλης εμβέλειας, χρησιμοποιούνται επίσης για την αξιολόγηση της ακεραιότητας του mtDNA, των επιπέδων ετεροπλασίας και της εξάντλησης του mtDNA, παρέχοντας βασικές πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία και τη νόσο των μιτοχονδρίων.
Μάθετε πώς το UIP400MTP Microplate Sonicator διευκολύνει τις δοκιμές και τις δοκιμασίες PCR!
Τι είναι η διαφορική φυγοκέντρηση;
Η διαφορική φυγοκέντρηση είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική για κυτταρική κλασμάτωση και μιτοχονδριακή απομόνωση. Αυτή η μέθοδος διαχωρίζει τις κυτταρικές δομές με βάση τον συντελεστή καθίζησής τους, ο οποίος εξαρτάται τόσο από την πυκνότητα όσο και από το σχήμα. Η διαδικασία περιλαμβάνει την εφαρμογή ποικίλων επιπέδων φυγόκεντρης δύναμης σε δείγματα σε ρυθμιστικά διαλύματα αλάτων με συγκεκριμένες πυκνότητες. Δομές με παρόμοιους συντελεστές καθίζησης θα εγκατασταθούν ταυτόχρονα στον πυθμένα του σωλήνα συλλογής, επιτρέποντας την ανάκτησή τους.
Πώς χρησιμοποιείται η διαφορική φυγοκέντρηση για την απομόνωση των μιτοχονδρίων;
Η διαφορική φυγοκέντρηση επιτρέπει στους ερευνητές να διαχωρίζουν αποτελεσματικά τα μιτοχονδριακά κλάσματα από άλλα κυτταρικά συστατικά. Η απομόνωση των μιτοχονδρίων περιλαμβάνει διάφορα στάδια φυγοκέντρησης και την επακόλουθη ανάκτηση του απομονωμένου στελέχους.
Αρχική φυγοκέντρηση: Εφαρμόστε χαμηλή φυγόκεντρη δύναμη σε ιζήματα μεγάλων κυτταρικών υπολειμμάτων και πυρήνων.
Μεταγενέστερες φυγοκεντρήσεις: Αυξήστε τη φυγόκεντρο δύναμη σταδιακά σε κλάσματα σφαιριδίων εμπλουτισμένα με μιτοχόνδρια. Κάθε βήμα φυγοκέντρησης αφαιρεί δομές με προοδευτικά υψηλότερους συντελεστές καθίζησης.
Ανάκτηση κλάσματος: Μετά από κάθε φυγοκέντρηση, συλλέγεται το σφαιρίδιο και το υπερκείμενο υγρό υποβάλλεται σε υψηλότερες δυνάμεις g για να απομονωθεί το επόμενο κλάσμα. Αυτό επαναλαμβάνεται μέχρι να επιτευχθεί η επιθυμητή καθαρότητα των μιτοχονδρίων.