Ultrazvučna proizvodnja visoko prečišćenih šizofilan beta-glukana

Schizophyallan je gljivični β-glukan sa imunomodulirajućim svojstvima. Za visoko aktivne medicinske efekte, shizofilan mora imati nisku molekularnu težinu kako bi pokazao poboljšanu bioraspoloživost. Dokazano je da ultrazvuk smanjuje molekularnu težinu shizofilana. Kao pouzdana i učinkovita metoda, ultrazvuk se može lako primijeniti za proizvodnju šizofilana niske molekularne težine.

Schizophyllum gljive i ultrazvučna ekstrakcija beta-glukana

Vrste gljive Schizophyllum rastu u prirodi na propadajućim stablima nakon kišnih sezona. Plodovi se sakupljaju u narednoj sušnoj sezoni. Vrste Schizophyllum bogate su biohemijskim spojevima kao što su glukani i stoga se konzumiraju posebno u tropskim zemljama kao hrana i lijek. Zbog svojih imunomodulatornih, antifungalnih, antineoplastičnih i antivirusnih svojstava, Schizophyllum commune, poznata i kao Splitgill gljiva, privukla je biotehnološke i farmaceutske kompanije.
Polisaharid šizofilan, takođe poznat kao sizofiran, sonifilan ili sizofilan, je glavni β-glukan koji se nalazi u gljivama Schizophyllum, koje nude visoko efikasan bioaktivni β-glukan šizofilan.
Schizophyllum commune gljive rastu u prirodi na drveću, micelij se također može uzgajati u fermentacionom bujonu. Za farmaceutske i kozmetičke primjene, šizofilan niske molekularne težine je mnogo učinkovitiji od šizofilana visoke molekularne težine. To je zbog činjenice da šizofilan niske molekularne težine pokazuje značajno bolju bioraspoloživost i stope apsorpcije. Dodatno, šizofilan visoke molekularne težine često je problematičan u primjeni jer rezultira visokim viskozitetom njegovih vodenih otopina.
Ultrazvučno smanjenje veličine je vrlo efikasna i pouzdana tehnika za smanjenje molekularne težine shizofilana, čime se povećava kvalitet molekula β-glukana.

Protokol za proizvodnju šizofilana niske molekularne težine

Budući da šizofilan molekularne težine pokazuje drastično bolju bioraspoloživost i svojstva primjene, istraživački tim Smirnoua istražio je ultrazvuk za cijepanje i smanjenje veličine molekula β-glukana šizofilana.

Ultrazvuk šizofilana

β-1.3(1.6)-Glucan shizophyllan (SPG) je proizveden potopljenim uzgojem S. commune gljive u bioreaktoru koristeći saharozu kao supstrat.
Nakon završetka kultivacije, bujon kulture razrijeđen je demineraliziranom vodom do koncentracije šizofilana od 2 g/L i ultrazvučno obrađen sa Ultrazvučni procesor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Njemačka) u režimu recikliranja pri sljedećim parametrima i uslovima: protok medija 50 mL/s, frekvencija 20 kHz, izlaz 2000 W, tip sonotrode BS2d22, tip pojačala B2-1.4 i amplituda 100%. Temperatura bujona kulture na početku sonikacije bila je 25°C. Ultrazvučni bujon kulture (specifični energetski unos 100 Ws/mL) je filtriran kroz Seitz HS800 dubinski filter pod pritiskom od 1,5 bara na 40°C. Ultrazvučni šizofilan (uSPG) za hemijsku karakterizaciju istaložen je iz filtrata trostrukom količinom izopropil alkohola na laboratorijskoj temperaturi i sušen na 60°C 12 h. USPG rastvori za imunološke studije pripremljeni su na sledeći način: (1) ultrazvučni filtrat bujona kulture je dijafiltriran kroz 0,1m2 Pall Centramate T-serije PES kasetu (100 kDa cut-off) na 0,8 bara i dijafiltracija je nastavljena sve dok provodljivost retentata nije bila 20 μS/cm; (2) otopina je koncentrirana dijafiltracijom do koncentracije uSPG od 1 g/L i sterilizirana autoklaviranjem na 120°C/20 min. Denaturirani uSPG je pripremljen na sličan način, samo što je u filtrat juhe kulture dodan NaOH u koncentraciji 0,2 M i alkalizirani rastvor je inkubiran 30 minuta na laboratorijskoj temperaturi prije dijafiltracije.

Analitičke metode

Prinos micelija je procijenjen gravimetrijski: bujon kulture razrijeđen je vodom 1:4, centrifugiran 10000 × g na 25°C 20 min, talog je ispran trostrukom količinom vode, osušen na 60°C i izmjeren. Šizofilan je precipitiran iz supernatanta trostrukom količinom izopropil alkohola, sušen na 60°C tokom 24h i njegov prinos je određen gravimetrijski. pO2 u bujonu kulture mjeren je optičkom sondom Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Švicarska).
Dinamička viskoznost bujona kulture mjerena je na HAAKE Visco Testeru 6L sa vretenima 1L i 2L na 4°C i brzini rotacije od 30 o/min. Brzina filtriranja izračunata je iz vremena filtracije 500 mL bujona kulture kroz dubinski filter Seitz HS800 (Pall, SAD) od 200 × 200 mm pri pritisku od 1,5 bara i 40°C.
Molekularnu težinu uSPG mjerio je SEC-MALLS na HPLC sistemu Alliance (Waters) sa serijski povezanim PL aquagel OH60 i PL aquagel OH40 kolonama, a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) je koncentriran dijafiltracijom do koncentracije uSPG 1 g/L i steriliziran pomoću autoklaviranje na 120°C/20 min. Denaturirani uSPG je pripremljen na sličan način, samo što je u filtrat juhe kulture dodan NaOH u koncentraciji 0,2 M i alkalizirani rastvor je inkubiran 30 minuta na laboratorijskoj temperaturi prije dijafiltracije.

AFM slika (na vrhu) i topografski profil (na dnu) prirodnog ultrazvučnog šizofilana. Merenje u polukontaktnom režimu sa rezolucijom 512 × 512 pxs2. Uvjeti: zlatni premaz, konstanta opruge 15,3 N/m, ugao vrha konusa <22°.r/>(picture and study: ©Smirnou et al., 2017)

 
Smanjena viskoznost: Ultrazvuk je rezultirao značajnim smanjenjem viskoznosti čorbe kulture. Tokom ultrazvučne obrade, viskoznost bujona za kulturu se mijenjala nelinearno: smanjenje viskoznosti je bilo brzo na početku ultrazvučne obrade, ali je kasnije usporilo. Specifični unos energije od 100 Ws/mL bio je dovoljan da smanji viskozitet bujona kulture skoro 7 puta.

Ultrazvučna obrada bujona kulture S.commune, koji je dobijen kultivacijom gljive u bioreaktoru 144h. Utjecaj perioda ultrazvučne obrade (izražen specifičnim energetskim unosom u Ws/mL) na brzinu dubinske filtracije bujona kulture (crni stupac) i koncentraciju šizofilana (SPG) u filtratu (siva kolona). Uslovi ultrazvuka: Ultrazvučni procesor UIP2000hd (20 kHz, 2000W), sonotroda BS2d22, buster B2-1.4, amplituda 100%, brzina protoka 50 mL/s.
(slika i studija: ©Smirnou et al., 2017.)

Poboljšana filtracija: Ultrazvučno tretirana juha za kulturu prolazila je kroz filter brže od netretirane kulture (specifični energetski unos 0 Ws/mL) sa visokomolekularnim SPG. Osim toga, ultrazvučna obrada značajno smanjuje gubitak proizvoda tokom filtracije. Filtrat netretirane kulture bujona sa visokomolekularnim SPG (specifični energetski unos 0 Ws/mL) sadržavao je 0,3 ± 0,07 g/L SPG, dok je koncentracija SPG prije dubinske filtracije bila 2 g/L. Nasuprot tome, filtrat ultrazvučne kulture od 100 Ws/mL sadržavao je SPG u koncentraciji 2,2 ± 0,2 g/L, što odgovara gotovo nultom gubitku proizvoda.

Ultrazvučna obrada bujona kulture S.commune, koji je dobijen kultivacijom gljive u bioreaktoru 144h. Utjecaj perioda ultrazvučne obrade (izražen specifičnim energetskim unosom u Ws/mL) na brzinu dubinske filtracije bujona kulture (crni stupac) i koncentraciju šizofilana (SPG) u filtratu (siva kolona). Uslovi ultrazvuka: Ultrazvučni procesor UIP2000hd (20 kHz, 2000W), sonotroda BS2d22, buster B2-1.4, amplituda 100%, brzina protoka 50 mL/s.
(slika i studija: ©Smirnou et al., 2017.)

 
Pročitajte više o jednostavnom povećanju ekstrakcije gljiva!
 

Ultrazvučna oprema visokih performansi za obradu gljivičnih glukana

Fragmentacija polisaharida kao što su glukani kao i drugih bioaktivnih jedinjenja kao što su hitin i hitozan može se pouzdano procesirati sa Hielscher ultrazvučnom opremom visokih performansi. Naši ultrasonikatori mogu da isporuče velike amplitude, nude preciznu kontrolu nad parametrima procesa i mogu raditi 24/7 pod velikim opterećenjem i u zahtevnim okruženjima. Hielscher Ultrasonics asortiman opreme pouzdano ispunjava ove zahtjeve. Osim izvanrednih ultrazvučnih performansi, Hielscher ultrasonikatori se mogu pohvaliti visokom energetskom učinkovitošću, što je značajna ekonomska prednost – posebno kada se koristi u komercijalnoj proizvodnji velikih razmjera.
Hielscher ultrasonicatori su sistemi visokih performansi koji mogu biti opremljeni dodacima kao što su sonotrode, pojačivači, reaktori ili protočne ćelije kako bi na optimalan način odgovarali vašim potrebama procesa. Sa digitalnim displejom u boji, osigurana je opcija za unapred podešene sonikacije, automatsko snimanje podataka na integrisanu SD karticu, daljinska kontrola pretraživača i mnoge druge funkcije, najveća kontrola procesa i jednostavnost za korisnika. Upareni sa robusnošću i velikim kapacitetom nosivosti, Hielscher ultrazvučni sistemi su vaš pouzdan radni konj u proizvodnji. Smanjenje molekularne težine β-glukana kao što je shizofilan zahtijeva snažan ultrazvuk da bi se dobio ciljani cijepanje i konačni shizofilan proizvod visokog kvaliteta, koji se može koristiti u farmaceutskoj primjeni.
 
Ovdje pronađite više informacija o ultrazvučnom ekstrakciji beta-glukana iz gljiva, uključujući upute korak po korak!
 
Tabela ispod daje vam indikaciju približnih kapaciteta obrade naših ultrazvučnih aparata: