Schizophyallan je gljivična β-glukan sa imunomodulirajućim svojstvima. Za vrlo aktivne ljekovite efekte, šizofilan mora imati nisku molekularnu težinu kako bi pokazao poboljšanu bioraspoložljivost. Dokazano je da ultrasonication smanjuje molekularnu težinu šizofilana. Kao pouzdana i učinljiva metoda, sonication se može lako primijeniti za proizvodnju shizofilana niske molekularne težine.

Schizophyllum gljive i ultrazvučna beta-glukanska ekstrakcija

Vrste Schizophyllum gljiva rastu u prirodi na raspadajućem drveću nakon kišnih godišnjih doba. Voćna tijela se prikupljaju u sljedećoj suhoj sezoni. Šizofilumske vrste su bogate biohemijskim spojem kao što su glukani i stoga se konzumiraju posebno u tropskim zemljama kao hrana i medicina. Zbog imunomodulatornih, antifungalnih, antineoplastičkih i antivirusnih svojstava, Schizophyllum komuna, poznata i kao Splitgill gljiva, privukla je biotehnološka i farmaceutska preduzeća.
Lysacharide schizophyllan, također poznat kao sizofiran, sonifilan, ili sizofilan, je glavni β-glukan pronađen u Schizophyllum gljivama, koje nude vrlo učinkovit bioaktivni β-glukan šizofilan.
Schizophyllum commune gljive rastu u prirodi na drveću, micelij se također može kulturati u fermentacijsku čorbu. Za farmaceutske i kozmetičke primjene, shizofilan niske molekularne težine je mnogo učinkniji od shizofilana visoke molekularne težine. To je zbog činjenice da shizofilan niske molekularne težine pokazuje znatno bolju bioraspoložljivost i stopu apsorpcije. Adicionalno, shizofilan visoke molekularne težine često je problematičan u primjenama budući da rezultira visokom viskoznosti svojih vakuumskih rastvora.
Ultrazvučno smanjenje veličine je vrlo učinkovita i pouzdana tehnika za snižavanje molekularne težine šizofilana, te time povećava kvalitet β-glukanske molekule.

Protokol za proizvodnju niske molekularne težine Schizophyllan

Budući da molekularna težina šizofilan pokazuje drastično bolju bioraspoložljivost i svojstva primjene, istraživački tim Smirnoua istraživao je ultrasonication za dekolte i smanjenje veličine β-glukanske molekule šizofilana.

Ultrasonication of Schizophyllan

β-1.3(1.6)-Glucan shizophyllan (SPG) je proizveden potopljenim kultivom S. commune gljivica u bioreaktoru koristeći saharozu kao supstrat.
Nakon završetka kultivacije, kultura je razrijeđena demineraliziranom vodom do shizofilane koncentracije 2 g/L i ultrasonicirana sa Ultrazvučni procesor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Germany) u načinu recikliranja na sljedećim parametrima i uvjetima: srednji protok 50 mL/s, frekvencija 20 kHz, izlaz 2000 W, sonotrode tipa BS2d22, booster tip B2-1.4 i amplituda 100%. Kultura Temperatura čorbe na početku sonikacije je bila 25°C. Ultrazvučna kultura juha (specifični ulaz energije 100 Ws/mL) filtrirana je kroz Seitz HS800 filter dubine pod pritiskom od 1,5 bara na 40°C. Ultrasonicirani šizofilan (uSPG) za hemijsku karakterizaciju precipitiran je iz filtrata s trostrukom količinom izopropil alkohola na laboratorijskoj temperaturi, a sušen na 60°C za 12h uSPG otopine za imunološka ispitivanja pripremljene su kako slijedi: (1) Ultrazvučna kultura juha filtrat je diafiltriran kroz 0,1m2 Pall Centramate T-serije PES kaseta (100 kDa cut-off) na 0,8 bar i diafiltracija se nastavila dok retentat provodljivost nije bila 20 μS/cm; (2) otopina je bila koncentrirana dijafiltracijom na koncentraciju USPG 1 g/L i sterilizirana autoklavom na 120°C/20 min. Denaturiran uSPG je pripremljen na sličan način, osim što je NaOH dodan u culture broth filterate u koncentraciji 0,2 M, a alkalizirana otopina je inkubiran 30 min na laboratorijskoj temperaturi prije dijafiltracije.

Analitičke metode

Prinos micelija procijenjen je gravimetrijski: kultura juha je razrijeđena vodom 1:4, centrifugirana 10000 × g na 25°C 20 min, padavina je bila oprana trostrukom količinom vode, sušena na 60°C i potegana. Šizofilan je bio precipitiran iz supernatanta sa trostrukom količinom izopropil alkohola, sušen na 60°C za 24h i njegov prinos je određen gravimetrijski. PO2 u kulturnoj juhi mjerila je optička sonda Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Švicarska).
Kultura čorbu dinamička viskoznost je izmjerena na HAAKE Visco Tester 6L sa spindles 1L i 2L na 4°C i brzina rotacije od 30 o/s. Brzina filtracije je izračunata iz vremena filtracije od 500 mL kulture juhe kroz 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, SAD) filter dubine pri 1,5 bar pritisak i 40°C.
USPG molekularnu težinu mjerio je SEC-MALLS na HPLC sustavu Alliance (Waters) sa nizom povezanim PL aquagel OH60 i PL aquagel OH40 stupcima, a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) bio je koncentriran diafiltracijom na koncentraciju USPG-a 1 g/L i steriliziran autoklavom na 120°C/20 min. Denaturiran uSPG je pripremljen na sličan način, osim što je NaOH dodan u culture broth filterate u koncentraciji 0,2 M, a alkalizirana otopina je inkubiran 30 min na laboratorijskoj temperaturi prije dijafiltracije.

Rezultati:
Ultrasonication tretman je primijenjen direktno na S. commune 144-h kulture juhu s micelijem kako bi se olakšala SPG nizvodnu obradu.
Karakteristike Sonicated Schizophyllan: Ultrazvučni šizofilan (uSPG) je bio precipitiran iz kulture čorbu filtrat alkoholom i okarakteriziran. SEC-MALLS je procijenio da je Mw USPG oko 1 MDa. Prosječna molekularna težina šizofilana od tekuće fermentacije je oko 5 MDa, dok u gajenju čvrstog stanja može dostići i do 10 MDa. Uspoređujući molekularnu težinu ultrasoniciranog šizofilana sa molekularnim težinama neliječenog šizofilana, zbog ultrasonikacije može se promatrati smanjena molekularna težina od 5 do 10 puta.
Soniciran polisaharid uSPG je sadržao 0,7%w/w proteina i 1,0%w/w talinu nakon paljenja. uSPG hidrolisat se sastoji od glukoze sa više od 99%. Analitički rezultati ukazuju da sonikacija nasumice cijepa β-glukansku okosnice i bocne grane ostaju netaknute čime se smanjuje veličina i molekularna težina šizofilana. Imunološka ispitivanja u suštini proteina i endotoksina slobodnog uSPG-a pokazala su, da je ultrasoniciran nisko-Mw shizophyllan izgovarao imunomodulatornu aktivnost.

Smanjena viskoznost: Ultrasonication je rezultirao značajnim smanjenjem viskoznosti kulture čorbom. Tokom ultrasonication, kultura broth viskoznost se promijenila nelinearly: pad viskoznosti je bio brz na početku ultra-sonication, ali kasnije je usporio. Specifični ulaz energije 100 Ws/mL je bio dovoljan da se smanji viskoznost čorbom kulture skoro 7 puta.

Poboljšana filtracija: Ultrazvukom tretirana kultura čorbu je tekao kroz filter brže od neliječenog kultura čorbu (specifični energetski ulaz 0 Ws/mL) s visoko-molekularnim SPG. Osim toga, ultrazvuka je značajno smanjila gubitak proizvoda tokom filtracije. Filtrat neliječenog kultura čorbom s visoko-molekularnim SPG (specifični ulaz energije 0 Ws/mL) sadržavao je 0,3 ± 0,07 g/L SPG, dok je KONCENTRACIJA SPG prije filtracije dubine bila 2 g/L. Suprotno tome, filtrat od 100 Ws/mL ultrazvučne kulture obojica su sadržavali SPG u koncentraciji 2,2 ± 0,2 g/L, što odgovara gotovo nultom gubitku proizvoda.

Zaključak: U svom zaključku istraživački tim nastavlja da je ultrazvučna obrada učtiva tehnologija za proizvodnju šizofilana niske molekularne težine, koja se zatim može koristiti u kozmetici i medicini. Ultrasonication, kada se nanese na kompletnu kulturnu juhu s micelijem, donosi određene prednosti shizofilskoj proizvodnji. Smanjuje gubitke proizvoda tokom nizvodne obrade i čini proizvodnju visoko pročišćenog polisaharida mogućim zbog efikasne potrošnje ultrafiltracije.
Osim toga, istraživači su otkrili da je ultrazvučna obrada šizofilana lako skalablna. Jedna jedinica pilot postrojenja ultrazvučni dezintegrator UIP2000hdT obradio je 1 litru kulture juhu u 110 s u režimu protoka. Produktivnost sistema se može lako povećati sekvencijalnom vezom dodatnih ultrazvučnih jedinica.

Ultrazvučna oprema visokih performansi za gljivičnu glukan obradu

Fragmentacija polisaharida kao što su glukani kao i drugi bioaktivni spojovi kao što su chitin i chitosan mogu biti pouzdani procesi uz Hielscherovu ultrazvučnu opremu visokih performansi. Naši ultrazvučnici mogu isporučiti visoke amplitude, nude preciznu kontrolnost nad parametrima procesa i mogu se upravljati 24/7 pod teškim teretom i u zahtjevnim okruženjima. Hielscher Ultrasonicsov domet opreme pouzdano ispunjava ove zahtjeve. Osim izvanrednih ultrazvučnih performansi, Hielscher ultrasonicators se može hvaliti visokim energetskim efikasnostima, što je značajna ekonomska prednost – posebno kada se zapošljavaju na komercijalnoj proizvodnji velikih razmjera.
Hielscher ultrasonicators su sistemi visokih performansi koji mogu biti opremljeni priborom kao što su sonotrodi, boosteri, reaktori ili protočni ćelije kako bi odgovarali vašim potrebama procesa na optimalan način. Uz digitalni prikaz boja, osigurana je opcija za predodređenje sonication runova, automatsko snimanje podataka na integrisanoj SD kartici, daljinska kontrola preglednika i mnogo više funkcija, najviše kontrole procesa i korisničko-ljubaznost. Upareni sa robusnošću i teškim nosivim kapacitetom, Hielscherovi ultrazvučni sistemi su vaš pouzdani rad konj u proizvodnji. Smanjenje molekularne težine β-glukana kao što je šizofilan zahtijeva snažan ultrazvuk kako bi se dobio ciljani dekolte i konačni shizofilanski proizvod visoke kvalitete, koji se može koristiti za farmaceutske primjene.
 
Više informacija o ultrazvučnoj ekstrakciji beta-glukana iz gljiva, uključujući uputstva korak po korak ovde!
 
Tabela u nastavku daje naznaku približan kapacitet prerade naših ultrasonicators: