Ultrazvučna proizvodnja visoko pročišćenih beta-glukana šizofilana

Šizofilan je gljivični β-glukan s imunomodulirajućim svojstvima. Za visoku ljekovitu aktivnost šizofilan mora imati nisku molekulsku masu kako bi pokazao poboljšanu bioraspoloživost. Dokazano je da ultrazvučna obrada smanjuje molekulsku masu šizofilana. Kao pouzdana i djelotvorna metoda, sonikacija se može jednostavno primijeniti za proizvodnju šizofilana niske molekulske mase.

Gljive roda Schizophyllum i ultrazvučna ekstrakcija beta-glukana

Vrste gljive Schizophyllum u prirodi rastu na trulim stablima nakon kišnih sezona. Plodna tijela se sabiru u narednoj sušnoj sezoni. Vrste Schizophyllum bogate su biohemijskim spojevima poput glukana te se stoga, posebno u tropskim zemljama, koriste kao hrana i lijek. Zbog svojih imunomodulirajućih, antifungalnih, antineoplastičnih i antivirusnih svojstava, gljiva Schizophyllum commune, poznata i kao gljiva Splitgill, privukla je biotehnološke i farmaceutske kompanije.
Polisaharid šizofilan, poznat i kao sizofiran, sonifilan ili sizofilan, glavni je β-glukan koji se nalazi u gljivama Schizophyllum, koje nude visoko djelotvoran bioaktivni β-glukan šizofilan.
Gljive Schizophyllum commune u prirodi rastu na drveću, a micelij se može uzgajati i u fermentacijskoj tečnosti. Za farmaceutsku i kozmetičku primjenu, šizofilan niske molekulske mase mnogo je djelotvorniji od šizofilana visoke molekulske mase. To je zato što šizofilan niske molekulske mase pokazuje znatno bolju bioraspoloživost i stope apsorpcije. Osim toga, šizofilan visoke molekulske mase često je problematičan u primjeni jer dovodi do visokog viskoziteta njegovih vodenih otopina.
Ultrazvučno smanjenje veličine visoko je djelotvorna i pouzdana tehnika za snižavanje molekulske mase šizofilana, čime se povećava kvalitet β-glukanske molekule.

Protokol za proizvodnju šizofilana niske molekulske mase

Budući da šizofilan s molekulskom masom pokazuje drastično bolju bioraspoloživost i svojstva primjene, istraživački tim Smirnou ispitao je ultrazvučnu obradu za cijepanje i smanjenje veličine β-glukanske molekule šizofilana.

Ultrazvučna obrada šizofilana

β-1.3(1.6)-glukan šizofilan (SPG) proizveden je submerznim uzgojem gljive S. commune u bioreaktoru uz saharozu kao supstrat.
Nakon završetka uzgoja, kulturna tečnost razrijeđena je demineraliziranom vodom do koncentracije šizofilana 2 g/L i ultrazvučno obrađena pomoću ultrazvučnog procesora UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Njemačka) u recirkulacijskom načinu rada pri sljedećim parametrima i uslovima: protok medija 50 mL/s, frekvencija 20 kHz, izlazna snaga 2000 W, tip sonotrode BS2d22, tip boostera B2-1.4 i amplituda 100%. Temperatura kulturne tečnosti na početku sonikacije iznosila je 25°C. Ultrazvučno obrađena kulturna tečnost (specifični unos energije 100 Ws/mL) filtrirana je kroz Seitz HS800 dubinski filter pod pritiskom od 1,5 bar na 40°C. Ultrazvučno obrađeni šizofilan (uSPG) za hemijsku karakterizaciju istaložen je iz filtrata trostrukom količinom izopropilnog alkohola na laboratorijskoj temperaturi i sušen na 60°C 12h. Otopine uSPG-a za imunološke studije pripremljene su na sljedeći način: (1) filtrat ultrazvučno obrađene kulturne tečnosti diafiltriran je kroz 0,1m2 Pall Centramate T-series PES kasetu (granica 100 kDa) pri 0,8 bar, a diafiltracija je nastavljena dok provodljivost retentata nije iznosila 20 μS/cm; (2) otopina je koncentrirana diafiltracijom do koncentracije uSPG 1 g/L i sterilizirana autoklaviranjem na 120°C/20 min. Denaturirani uSPG pripremljen je na sličan način, osim što je filtratu kulturne tečnosti dodan NaOH u koncentraciji 0,2 M, a alkalizirana otopina inkubirana je 30 min na laboratorijskoj temperaturi prije diafiltracije.

Analitičke metode

Prinos micelija procijenjen je gravimetrijski: kulturna tečnost razrijeđena je vodom 1:4, centrifugirana 10.000 × g na 25°C 20 min, talog je ispran trostrukom količinom vode, sušen na 60°C i izvagan. Šizofilan je istaložen iz supernatanta trostrukom količinom izopropilnog alkohola, sušen na 60°C 24h, a njegov prinos određen je gravimetrijski. pO2 u kulturnoj tečnosti mjeren je optičkom sondom Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Švicarska).
Dinamički viskozitet kulturne tečnosti mjeren je na HAAKE Visco Tester 6L s vretenima 1L i 2L na 4°C i brzini rotacije od 30 rpm. Brzina filtracije izračunata je iz vremena filtracije 500 mL kulturne tečnosti kroz Seitz HS800 (Pall, SAD) dubinski filter dimenzija 200 × 200 mm pri pritisku od 1,5 bar i na 40°C.
Molekulska masa uSPG mjerena je pomoću SEC-MALLS na HPLC sistemu Alliance (Waters) sa serijski povezanim kolonama PL aquagel OH60 i PL aquagel OH40, a detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) koncentriran je diafiltracijom do koncentracije uSPG 1 g/L i steriliziran autoklaviranjem na 120°C/20 min. Denaturirani uSPG pripremljen je na sličan način, osim što je filtratu kulturne tečnosti dodan NaOH u koncentraciji 0,2 M, a alkalizirana otopina inkubirana je 30 min na laboratorijskoj temperaturi prije diafiltracije.

Rezultati:
Ultrazvučna obrada primijenjena je direktno na 144-satnu kulturnu tečnost S. commune s micelijem radi olakšavanja daljnje obrade SPG-a.

Karakteristike ultrazvučno obrađenog šizofilana: Ultrazvučno obrađeni šizofilan (uSPG) istaložen je iz filtrata kulturne tečnosti alkoholom i okarakterisan. SEC-MALLS je procijenio da Mw uSPG-a iznosi oko 1 MDa. Prosječna molekulska masa šizofilana iz tečne fermentacije iznosi približno 5 MDa, dok u uzgoju u čvrstom stanju može dosegnuti do 10 MDa. Poređenjem molekulske mase ultrazvučno obrađenog šizofilana s molekulskim masama nativnog neobrađenog šizofilana može se uočiti 5- do 10-struko smanjenje molekulske mase uslijed ultrazvučne obrade.
Sonicirani polisaharid uSPG sadržavao je 0,7%w/w proteina i 1,0%w/w ostatka nakon žarenja. Hidrolizat uSPG-a sastojao se od glukoze s više od 99%. Analitički rezultati ukazuju na to da sonikacija nasumično cijepa okosnicu β-glukana, a bočne grane ostaju netaknute, čime se smanjuju veličina i molekulska masa šizofilana. Imunološke studije na uSPG-u koji je u suštini bez proteina i endotoksina pokazale su da ultrazvučno obrađeni šizofilan niske Mw ima izraženu imunomodulirajuću aktivnost.

 
Smanjeni viskozitet: Ultrazvučna obrada dovela je do značajnog smanjenja viskoziteta kulturne tečnosti. Tokom ultrazvučne obrade viskozitet kulturne tečnosti mijenjao se nelinearno: smanjenje viskoziteta bilo je brzo na početku ultrazvučne obrade, ali je kasnije usporilo. Specifični unos energije od 100 Ws/mL bio je dovoljan da se viskozitet kulturne tečnosti smanji gotovo 7 puta.

Poboljšana filtracija: Kulturna tečnost tretirana ultrazvukom tekla je kroz filter brže od netretirane kulturne tečnosti (specifični unos energije 0 Ws/mL) s visokomolekularnim SPG-om. Osim toga, ultrazvučna obrada značajno je smanjila gubitak proizvoda tokom filtracije. Filtrat netretirane kulturne tečnosti s visokomolekularnim SPG-om (specifični unos energije 0 Ws/mL) sadržavao je 0,3 ± 0,07 g/L SPG-a, dok je koncentracija SPG-a prije dubinske filtracije iznosila 2 g/L. Nasuprot tome, filtrat kulturne tečnosti ultrazvučno obrađene sa 100 Ws/mL sadržavao je SPG u koncentraciji 2,2 ± 0,2 g/L, što odgovara gotovo nultom gubitku proizvoda.

Zaključak: U svom zaključku istraživački tim sažima da je ultrazvučna obrada efikasna tehnologija za proizvodnju šizofilana niske molekulske mase, koji se potom može koristiti u kozmetici i medicini. Ultrazvučna obrada, kada se primijeni na cjelokupnu kulturnu tečnost s micelijem, donosi određene prednosti za proizvodnju šizofilana. Smanjuje gubitke proizvoda tokom daljnje obrade i omogućava proizvodnju visoko pročišćenog polisaharida zahvaljujući efikasnoj upotrebi ultrafiltracije.
Osim toga, istraživači su utvrdili da je ultrazvučna obrada šizofilana lako skalabilna. Jedna jedinica pilot-postrojenja, ultrazvučnog dezintegratora UIP2000hdT, obradila je 1 litar kulturne tečnosti za 110 s u protočnom načinu rada. Produktivnost sistema može se lako povećati serijskim povezivanjem dodatnih ultrazvučnih jedinica.

Pročitajte više o jednostavnom povećanju razmjera ekstrakcije iz gljiva!
 

Ultrazvučna oprema visokih performansi za obradu gljivičnih glukana

Fragmentacija polisaharida poput glukana, kao i drugih bioaktivnih spojeva poput hitina i hitozana, može se pouzdano obrađivati ultrazvučnom opremom visokih performansi kompanije Hielscher. Naši ultrazvučni uređaji mogu isporučiti visoke amplitude, nude preciznu kontrolu nad procesnim parametrima i mogu raditi 24/7 pod velikim opterećenjem i u zahtjevnim okruženjima. Asortiman opreme Hielscher Ultrasonics pouzdano ispunjava ove zahtjeve. Pored izvanrednih ultrazvučnih performansi, ultrazvučni uređaji Hielscher mogu se pohvaliti visokom energetskom efikasnošću, što je značajna ekonomska prednost – posebno kada se koriste u komercijalnoj proizvodnji velikih razmjera.
Ultrazvučni uređaji Hielscher sistemi su visokih performansi koji se mogu opremiti dodacima kao što su sonotrode, boosteri, reaktori ili protočne ćelije kako bi se optimalno prilagodili potrebama vašeg procesa. Uz digitalni kolor displej, mogućnost prethodnog podešavanja ciklusa sonikacije, automatsko bilježenje podataka na integriranu SD karticu, daljinsko upravljanje putem preglednika i mnoge druge funkcije osiguravaju se najviša kontrola procesa i jednostavnost korištenja. U kombinaciji s robusnošću i velikom nosivošću opterećenja, ultrazvučni sistemi Hielscher vaš su pouzdan radni konj u proizvodnji. Smanjenje molekulske mase β-glukana poput šizofilana zahtijeva snažan ultrazvuk kako bi se postiglo ciljano cijepanje i konačni proizvod šizofilana visoke kvalitete, koji se može koristiti u farmaceutskim primjenama.

Pronađite ovdje više informacija o ultrazvučnoj ekstrakciji beta-glukana iz gljiva, uključujući upute korak po korak!

Tabela u nastavku daje vam orijentaciju o približnom kapacitetu obrade naših ultrazvučnih uređaja: