تفكيك تجمعات الخلايا في العينات البكتيرية بالموجات فوق الصوتية

نادرًا ما تكون العينات البكتيرية عند ورودها معلقات حقيقية من خلايا منفردة. تنمو المزارع في سلاسل وندف، وتشكل العزلات البيئية تجمعات تربطها مواد بوليمرية خارج خلوية، وكثيرًا ما تقاوم الرواسب الناتجة عن الطرد المركزي إعادة التعليق رغم المزج الدوامي الجيد. يفترض كل من تعداد الخلايا القابلة للحياة، والكثافة الضوئية، وقياس التدفق الخلوي، وتوصيف الميكروبيوم أن الجسيم الواحد يعادل خلية واحدة. ويحل تفكيك تجمعات الخلايا بالموجات فوق الصوتية هذا التعارض: إذ تفصل دفعات قصيرة ومضبوطة من المعالجة بالموجات فوق الصوتية التجمعات إلى خلايا منفردة دون تحليلها.

لماذا يخل تجمع الخلايا بنتائجك

التجمع سمة بيولوجية، وليس خطأ في تحضير العينات. تنمو Staphylococcus وStreptococcus وLactobacillus وActinomyces وكثير من الأنواع البيئية في سلاسل أو عناقيد أو شظايا أغشية حيوية، ويربط DNA خارج الخلوي وعديدات السكاريد الخلايا بعضها ببعض في الرواسب ومستخلصات المسحات. وتترتب على ذلك آثار منهجية في التحليل:

• يُقدَّر عدد المستعمرات بأقل من قيمته الفعلية، لأن كل كتلة تنتج مستعمرة واحدة بصرف النظر عن عدد الخلايا التي تحتويها.
• تعكس قياسات الكثافة الضوئية وعدادات الجسيمات التجمعات بدلًا من الخلايا، مما يسبب انحيازًا في منحنيات النمو.
• يؤدي قياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا إلى تعداد غير صحيح للأحداث التي تمثل كتلًا خلوية واستبعادها من التحليل.
• لا تمثل مستخلصات DNA والبروتين سوى الخلايا الموجودة على سطح التجمع، مما يسبب انحيازًا في بيانات الميكروبيوم وعلوم الأوميكس.

الحلول التقليدية بطيئة أو غير مكتملة أو تُحدث تغييرات كيميائية. فالشفط والدفع القويان بالماصة والمزج الدوامي يتركان تجمعات مجهرية. ويغير التشتيت باستخدام الإنزيمات أو العوامل المخلبية سطح الخلية الذي قد تنوي تحليله. أما التفكيك الميكانيكي للتجمعات بواسطة التجويف المضبوط فيعمل خلال ثوانٍ ولا يتطلب أي إضافات.

كيف تفكك المعالجة بالموجات فوق الصوتية تجمعات الخلايا دون تحليلها

يستفيد تفكيك تجمعات الخلايا بالموجات فوق الصوتية من اختلاف المتانة الميكانيكية. تتماسك التجمعات البكتيرية بواسطة روابط ضعيفة نسبيًا بين الخلايا ومصفوفة خارج خلوية، بينما يتحمل الغلاف الخلوي السليم قصًا أعلى بكثير. عندما تدخل الموجات فوق الصوتية المعايرة إلى المعلق، يولد التجويف الصوتي جريانًا مجهريًا ونبضات ضغط وقوى قص تؤثر أولًا في الأسطح البينية للتجمعات. وتُفصل الكتل والسلاسل وشظايا الأغشية الحيوية بفعل القص (تفكيك التكتلات) قبل بلوغ مستوى الطاقة الذي تتمزق عنده الأغشية (التحلل الخلوي).

تفكيك الكتل الخلوية البكتيرية بالموجات فوق الصوتية

تفكيك التجمعات أم التحلل الخلوي – كيف تؤثر معلمات المعالجة بالموجات فوق الصوتية

النتيجة العملية هي أن تفكيك التجمعات والتحلل الخلوي يُنجزان بالجهاز نفسه عند تشغيله بمعلمات مختلفة. عند استخدام سعة اهتزاز معتدلة ودورات نبضية قصيرة ودرجة حرارة مضبوطة، تحصل على معلق من خلايا منفردة قابلة للحياة. وتؤدي زيادة سعة الاهتزاز أو زمن التعرض أو درجة حرارة العينة إلى توجيه العملية نحو التفكيك الكامل للخلايا للوصول إلى الأهداف داخل الخلوية. تتيح لك مولدات Hielscher ضبط سعة الاهتزاز والقدرة والنبضات والطاقة المدخلة بدقة وحفظ الطريقة، بحيث تكون خطوة تفكيك التجمعات قابلة للتكرار عبر العينات والمشغلين ودورات التشغيل.

معالجة فعالة بالموجات فوق الصوتية دون تلامس

لا تستطيع المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الأحواض تحقيق هذا المستوى من التحكم. لا توفر أحواض وخزانات التنظيف بالموجات فوق الصوتية سوى طاقة فوق صوتية منخفضة، مما يؤدي إلى تحضير غير مكتمل، كما يحدث التجويف بصورة غير متجانسة، ولذلك يُعالج كل أنبوب وفقًا لموقعه في الحوض. ينقل VialTweeter قوى فوق صوتية شديدة ومركزة مباشرة عبر جدار الوعاء إلى ما يصل إلى 10 عينات محكمة الإغلاق في الوقت نفسه. وتُنجز المعالجات التي تتطلب تعرضًا طويلًا ومتفاوتًا في الحوض باستخدام نمط نبضات موحد.
تطبق أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية دون تلامس من Hielscher موجات فوق صوتية شديدة ومركزة عبر جدران القوارير المغلقة. يعالج VialTweeter ما يصل إلى 10 قوارير في الوقت نفسه بشدة متطابقة، دون إدخال مسبار في العينة، ودون تلوث متبادل أو انبعاث هباء جوي. وحيثما يتطلب معدل معالجة العينات ذلك، يوسع جهازا معالجة الصفائح الدقيقة بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP وUIP550MTP نطاق نقل الطاقة المضبوط نفسه ليشمل الصفائح متعددة الآبار.

مزايا تفكيك التجمعات بالموجات فوق الصوتية دون تلامس

• انعدام التلوث المتبادل: نظرًا إلى أن القوارير تظل مغلقة طوال الوقت ولا يُغمر أي مسبار في العينة، يُتجنب التلوث المتبادل وفقدان العينة تمامًا. ولا يوجد ما يحتاج إلى التعقيم بين العينات، ولا يمكن لدورة تشغيل أن تؤثر في الدورة التالية.
• الحماية من الهباء الجوي: تولد المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام مسبار في وعاء مفتوح هباءً جويًا معديًا وتلوث أسطح الأجهزة. وتحتوي المعالجة بالموجات فوق الصوتية في قوارير محكمة الإغلاق العينة داخل أنبوبها، وهو أمر مهم عند التعامل مع بكتيريا ممرضة مثل Mycobacterium tuberculosis وغيرها من العوامل المصنفة ضمن BSL-2 أو BSL-3.
• لا تآكل في طرف المسبار: قد تطلق مسابير التيتانيوم كمية صغيرة من الجسيمات المجهرية في العينة أثناء التشغيل. وتغير هذه الجسيمات الكثافة الضوئية وتعدادات الجسيمات في المراحل اللاحقة. وتزيل المعالجة غير المباشرة بالموجات فوق الصوتية عبر جدار الوعاء هذا المصدر للمواد الصلبة تمامًا.
• معدل معالجة عينات متجانس: يوفر VialTweeter شدة الموجات فوق الصوتية نفسها لكل قارورة من بين ما يصل إلى 10 قوارير، فتكون نتائج المعالجة بالموجات فوق الصوتية متجانسة وقابلة للتكرار. وتختفي تأثيرات الموقع التي تعاني منها الأحواض والمعالجة بالمسبار لعينة واحدة، وتظل قيم خط الأساس قابلة للمقارنة بين المكررات.
• سلامة العينة: تظل الأنابيب مغلقة طوال المعالجة، فلا يمكن أن تتلوث العينة أو تفسد أو تتطاير. ويمكن معالجة الأحجام الصغيرة دون تخفيف، بما في ذلك الرواسب السريرية الثمينة التي لا تتحمل خطوة نقل إضافية.
• التحكم في العملية: يمكن ضبط سعة الاهتزاز من 20 إلى 100%، ونمط النبضات من 0 إلى 100%، وتدعم الأنظمة مراقبة درجة الحرارة بحيث تبقى السلالات والبروتينات الحساسة للحرارة دون العتبات المسببة للتلف.

التطبيقات المعتادة

• تحليل الميكروبيوم ومحتويات الأمعاء: تشتيت Lactobacillus وBifidobacterium وعينات البراز قبل الزرع على الأطباق أو تحديد التسلسل، حتى لا تنخفض التعدادات بسبب الكتل.
• الأحياء الدقيقة في الأغذية والمياه: تفكيك الندف في المسحات وسوائل الشطف وأوساط الإغناء السائلة لتحديد المستعمرات وقابلية الحياة بدقة.
• أبحاث الأغشية الحيوية: استرجاع الخلايا من الحوامل والأسطح في صورة معلقات من خلايا منفردة، دون معالجة إنزيمية من شأنها إزالة البروتينات السطحية.
• التشخيص السريري: إعادة تعليق البلغم والقيح ومستخلصات المسحات في ظروف الاحتواء.
• زراعة الخلايا: فصل التجمعات المتكتلة لخلايا الثدييات والحشرات وخلايا CHO قبل التعداد وإعادة الزرع.
• التحضير لكامل سير العمل: ينفذ الجهاز نفسه الذي يفكك التجمعات عند سعة اهتزاز منخفضة تفكيكًا كاملًا للخلايا عند إعدادات أعلى، بحيث يتبع ذلك التحلل الخلوي واستخلاص البروتين وتجزئة DNA دون نقل محتويات الأنابيب.

المؤلفات / المراجع

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.