بروتوكول استخدام أجهزة Hielscher لمعالجة عينات متعددة بالموجات فوق الصوتية في تحليل الأغشية الحيوية والتحليل البروتيومي

يسهم استخدام أجهزة معالجة عينات متعددة بالموجات فوق الصوتية، مثل جهاز VialTweeter لمعالجة أنابيب متعددة بالموجات فوق الصوتية وجهاز UIP400MTP لمعالجة الصفائح الدقيقة بالموجات فوق الصوتية، في تبسيط سير العمل المخبري للتطبيقات ذات معدل معالجة العينات المرتفع. يتيح كلا الجهازين معالجة دقيقة ومتجانسة بالموجات فوق الصوتية لعينات متعددة، مما يقلل التباين ويعزز قابلية تكرار النتائج. ويُعد ذلك مفيدًا بوجه خاص في التجارب التي تتطلب تحللًا متسقًا للعينات، أو فصل الأغشية الحيوية، أو استخلاص البروتينات، أو الهضم المحلل للبروتينات، حيث تكون الطرق اليدوية أو طرق معالجة عينة واحدة أقل كفاءة وأكثر عرضة لعدم الاتساق.

تبسيط سير العمل باستخدام أجهزة معالجة عينات متعددة بالموجات فوق الصوتية

يتيح جهاز UIP400MTP، على سبيل المثال، معالجة آبار الصفائح الدقيقة بالموجات فوق الصوتية بالتزامن، مما يضمن فصلًا متجانسًا للأغشية الحيوية أو المواد الخلوية. وفي الوقت نفسه، يوفر جهاز VialTweeter تحللًا وتجانسًا دقيقين لعينات متعددة في الأنابيب دون تلوث متبادل. تقلل هذه الأجهزة أزمنة المعالجة بدرجة كبيرة، وتحسن قابلية تكرار النتائج التجريبية، وتحافظ على سلامة العينات بدرجة عالية، مما يجعلها أدوات لا غنى عنها في أبحاث علم الأحياء الدقيقة والبروتيوميات وعلم الأحياء الجزيئي.
فيما يلي بروتوكول مفصل يوضح استخدام طرازي أجهزة Hielscher لمعالجة عينات متعددة بالموجات فوق الصوتية، وهما جهاز VialTweeter لمعالجة أنابيب متعددة بالموجات فوق الصوتية وجهاز UIP400MTP لمعالجة الصفائح الدقيقة بالموجات فوق الصوتية، في دراسة تتناول تكوّن الأغشية الحيوية لبكتيريا E. coli والتحليل البروتيومي اللاحق.

البروتوكول: تكوّن الأغشية الحيوية وفصلها والتحليل البروتيومي باستخدام أجهزة Hielscher لمعالجة عينات متعددة بالموجات فوق الصوتية

1. تحضير المزرعة البكتيرية

• استزرع بكتيريا E. coli (السلالة W3110) عند 30°C، وهي درجة حرارة ملائمة لتكوّن الأغشية الحيوية لبكتيريا E. coli، في وسط مرق التريبتون (TB) الذي يحتوي على:
  – 10 g/L من التريبتون
  – 5 g/L من NaCl
• أضف المضادات الحيوية حسب الحاجة لضمان الاحتفاظ بالبلازميد.
• لدراسات الفحص المجهري ونشاط المحفزات، استخدم السلالة W3110 من بكتيريا E. coli التي تحتوي على مراسل جينومي للبروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP) تحت تحكم المحفز rplL.
• استخدم بلازميدات مراسل GFP لمحفزات مختلفة (مثل، csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) لقياس أنشطة المحفزات.

2. استنبات الأغشية الحيوية وفصلها

• لقّح صفيحة ذات 12 بئرًا بـ 1.5 mL من المزرعة البكتيرية المخففة لكل بئر (صفائح CellStar ذات 12 بئرًا، Greiner Bio-One).
• احضن للسماح بتكوّن الأغشية الحيوية.
• أزل المزرعة العالقة (غير الملتصقة) بعناية.

– اغسل كل بئر باستخدام 500 µL من PBS.
– افصل الخلايا الملتصقة بمعالجة الصفيحة ذات 12 بئرًا بالموجات فوق الصوتية في جهاز UIP400MTP لمعالجة الصفائح الدقيقة بالموجات فوق الصوتية. يضمن جهاز UIP400MTP فصلًا متجانسًا بإيصال طاقة فوق صوتية متسقة إلى جميع الآبار.
– إعدادات المعالجة بالموجات فوق الصوتية: سعة 60%، نمط الدورات: تشغيل لمدة 60 sec / إيقاف لمدة 30 sec.

3. جمع الخلايا وتحللها

• أخضع خلايا الغشاء الحيوي المفصولة للطرد المركزي عند 4,500 g لمدة 5 دقائق.
• اغسل الخلايا المترسبة باستخدام PBS.
• أعد تعليق الخلايا في 100 µL من محلول ساركوسينات لورويل الصوديوم (SLS) بتركيز 2% واحضن عند 95°C لمدة 15 دقيقة.
• عالج بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز VialTweeter لمعالجة أنابيب متعددة بالموجات فوق الصوتية لضمان التحلل الكامل للخلايا.
  – إعدادات المعالجة بالموجات فوق الصوتية: سعة 100%، تشغيل لمدة 50 s / إيقاف لمدة 10 s، لمدة تشغيل إجمالية قدرها 10 min؛ أبقِ العينات على الثلج.

4. الاختزال والألكلة

• أضف 5 mM من Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) لاختزال روابط ثنائي الكبريتيد واحضن عند 95°C لمدة 15 دقيقة.
• أجرِ ألكلة البروتينات باستخدام 10 mM من اليودوأسيتاميد لمدة 30 دقيقة عند 25°C.

5. التقدير الكمي للبروتينات وهضمها

• أخضع نواتج التحلل للطرد المركزي لإزالة الحطام.
• حدّد المحتوى الكلي للبروتين كميًا باستخدام Pierce BCA Protein Assay Kit.
• اهضم 50 µg من البروتين الكلي باستخدام 1 µg من التربسين في محلول يحتوي على 2% من SLS و100 mM من بيكربونات الأمونيوم.
• احضن تفاعل الهضم طوال الليل عند 30°C.

6. تنقية الببتيدات

• رسّب SLS بإضافة حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك (TFA) بتركيز 1.5%، ثم أجرِ الطرد المركزي.
• نقِّ الببتيدات باستخدام أعمدة C18 صغيرة للطرد المركزي.
• جفف الببتيدات المنقاة وأعد تعليقها في TFA بتركيز 0.1%.

7. الاستشراب السائل–مطيافية الكتلة (LC-MS/MS)

• حلّل الببتيدات باستخدام مطياف الكتلة Q-Exactive Plus المقترن بنظام Ultimate 3000 RSLC nano.
• افصل الببتيدات باستخدام عمود HPLC ذي طور معكوس (75 µm × 42 cm) معبأ براتنج C18 (2.4 µm).
• طبّق تدرجًا من 2% إلى 35% من المذيب B (الأسيتونتريل مع حمض الفورميك بتركيز 0.15%) على مدى 140 دقيقة.
• اجمع البيانات باستخدام مسوحات MS عالية الدقة، تتبعها مسوحات MS/MS ترادفية للأيونات الـ 10 الأعلى شدة.

8. تحليل البيانات

• عالج بيانات LC-MS الخام باستخدام برنامج Progenesis.
• صدّر ملفات .mgf وحلّلها باستخدام MASCOT.
• أجرِ التقدير الكمي للببتيدات باستخدام SafeQuant لضبط الجودة وتعديل الاكتشافات الكاذبة.
• أجرِ جميع التجارب بتكرارين أو بثلاثة تكرارات لضمان قابلية تكرار النتائج.

أجهزة معالجة عينات متعددة بالموجات فوق الصوتية لتحضير العينات بمعدل معالجة عينات مرتفع

يعزز طرازا أجهزة معالجة عينات متعددة بالموجات فوق الصوتية VialTweeter وUIP400MTP دقة سير العمل التجريبي وكفاءته بدرجة كبيرة، ولا سيما في أبحاث الأغشية الحيوية والبروتيوميات. وتضمن قدرتهما على معالجة عينات متعددة بصورة متجانسة معدل معالجة عينات مرتفعًا دون المساس بجودة البيانات. وتجعل هذه الفوائد، إلى جانب سير العمل المبسط الموضح أعلاه، أجهزة Hielscher لمعالجة عينات متعددة بالموجات فوق الصوتية أدوات أساسية للأبحاث البيولوجية الحديثة.

التصميم والتصنيع والاستشارات – جودة صُنعت في ألمانيا

تشتهر أجهزة Hielscher للمعالجة بالموجات فوق الصوتية بأعلى معايير الجودة والتصميم. تتيح المتانة وسهولة التشغيل دمج أجهزتنا للمعالجة بالموجات فوق الصوتية بسلاسة في المنشآت الصناعية. وتتعامل أجهزة Hielscher للمعالجة بالموجات فوق الصوتية بسهولة مع الظروف القاسية والبيئات ذات المتطلبات العالية.

Hielscher Ultrasonics شركة حاصلة على شهادة ISO، وتولي اهتمامًا خاصًا لأجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء التي تتميز بتقنية متطورة وسهولة الاستخدام. وبالطبع، تتوافق أجهزة Hielscher للمعالجة بالموجات فوق الصوتية مع CE وتلبي متطلبات UL وCSA وRoHs.