بروتوكول باستخدام Hielscher Multi-Sample Sonicators في الأغشية الحيوية والتحليل البروتيني
إن استخدام أجهزة الصوتنة متعددة العينات ، مثل VialTweeter Multi-Tube Sonicator و UIP400MTP Microplate Sonicator ، يبسط سير عمل المختبر للتطبيقات عالية الإنتاجية. يسمح كلا الجهازين بمعالجة دقيقة وموحدة بالموجات فوق الصوتية عبر عينات متعددة ، مما يقلل من التباين ويعزز قابلية التكاثر. هذا مفيد بشكل خاص في التجارب التي تتطلب تحلل عينة متسقا ، أو انفصال الأغشية الحيوية ، أو استخراج البروتين أو الهضم المحلل للبروتين ، حيث تكون الطرق اليدوية أو أحادية العينة أقل كفاءة وعرضة للتناقض.
تبسيط مهام سير العمل باستخدام أدوات الصوتيات متعددة العينات
يتيح UIP400MTP ، على سبيل المثال ، المعالجة المتزامنة بالموجات فوق الصوتية لآبار الصفيحة الدقيقة ، مما يضمن انفصالا موحدا للأغشية الحيوية أو المواد الخلوية. وفي الوقت نفسه ، يوفر VialTweeter تحللا دقيقا وتجانسا لعينات الأنابيب المتعددة دون تلوث متبادل. تقلل أجهزة الصوتنة هذه بشكل كبير من أوقات المعالجة ، وتحسن قابلية التكرار التجريبي ، وتحافظ على سلامة عالية للعينة ، مما يجعلها أدوات لا غنى عنها في علم الأحياء الدقيقة والبروتينات وأبحاث البيولوجيا الجزيئية.
يوجد أدناه بروتوكول مفصل يوضح استخدام نماذج الموجات الصوتية متعددة العينات Hielscher ، و VialTweeter Multi-Tube Sonicator و Microplate Sonicator UIP400MTP ، في دراسة تتضمن تكوين الإشريكية القولونية الحيوية والتحليل البروتيني اللاحق.
صوتنة لوحة متعددة الآبار UIP400MTP – تحضير عينة موثوق به بإنتاجية عالية
البروتوكول: تكوين الأغشية الحيوية ، وانفصال ، وتحليل البروتينات باستخدام Hielscher متعددة العينات
1. تحضير الثقافة البكتيرية
- زراعة بكتيريا الإشريكية القولونية (سلالة W3110) عند 30 درجة مئوية ، وهي درجة حرارة مواتية لتكوين الإشريكية القولونية الحيوية ، في وسط مرق التربتون (TB) الذي يحتوي على:
– 10 جم / لتر من التربتون
– 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم - مكمل مع المضادات الحيوية حسب الحاجة لضمان الاحتفاظ بالبلازميد.
- بالنسبة لدراسات الفحص المجهري ونشاط المروج ، استخدم W3110 بكتريا قولونية سلالة مع مراسل GFP المحسن الجينومي (eGFP) تحت سيطرة مروج rplL.
- استخدم بلازميدات مراسل GFP لمختلف المروجين (على سبيل المثال ، csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) لقياس أنشطة المروج.
2. زراعة الأغشية الحيوية وانفصال
- بذرة 1.5 مل من المزرعة البكتيرية المخففة لكل بئر في صفيحة من 12 بئرا (ألواح CellStar 12-well ، Greiner Bio-One).
- احتضان للسماح بتكوين الأغشية الحيوية.
- قم بإزالة الثقافة العوالق (غير الملتصقة) بعناية.
– اغسل كل بئر ب 500 ميكرولتر PBS.
– افصل الخلايا المرفقة عن طريق صوتنة لوحة 12 بئر في سونيكاتور الصوتنة UIP400MTP microplate. يضمن UIP400MTP انفصالا موحدا من خلال توفير طاقة بالموجات فوق الصوتية متسقة عبر جميع الآبار.
– إعدادات صوتنة: سعة 60٪ ، وضع الدورة: تشغيل 60 ثانية / إيقاف تشغيل 30 ثانية.
3. حصاد الخلايا وتحللها
- قام جهاز الطرد المركزي بفصل خلايا الأغشية الحيوية عند 4,500 جم لمدة 5 دقائق.
- اغسل الخلايا المحببة باستخدام PBS.
- أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 2٪ ساركوسينات لورويل الصوديوم (SLS) واحتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- Sonicate باستخدام VialTweeter Multi-Tube Sonicator لضمان التحلل الكامل للخلايا.
– إعدادات صوتنة: سعة 100٪ ، تشغيل 50 ثانية / إيقاف تشغيل 10 ثانية لمدة 10 دقائق من وقت التشغيل الإجمالي ؛ احتفظ بالعينات على الجليد.
4. الاختزال والألكلة
- أضف 5 ملي مولار تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP) لتقليل روابط ثاني كبريتيد واحتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- بروتينات الألكيلات مع 10 ملي مولار يودوأسيتاميد لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
5. القياس الكمي للبروتين والهضم
- أجهزة الطرد المركزي تحلل لإزالة الحطام.
- حدد إجمالي محتوى البروتين باستخدام مجموعة مقايسة البروتين Pierce BCA.
- هضم 50 ميكروغرام من البروتين الكلي مع 1 ميكروغرام من التربسين في محلول يحتوي على 2٪ SLS و 100 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم.
- احتضان تفاعل الهضم طوال الليل عند 30 درجة مئوية.
6. تنقية الببتيد
- قم بترسيب SLS بإضافة 1.5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) ، ثم جهاز الطرد المركزي.
- تنقية الببتيدات باستخدام أعمدة الدوران الصغير C18.
- الببتيدات المنقاة الجافة وإعادة تعليقها في 0.1٪ TFA.
7. الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS)
- قم بتحليل الببتيدات على مطياف الكتلة Q-Exactive Plus إلى جانب نظام النانو Ultimate 3000 RSLC.
- افصل الببتيدات باستخدام عمود HPLC عكسي الطور (75 ميكرومتر × 42 سم) معبأ براتنج C18 (2.4 ميكرومتر).
- ضع تدرجا من 2٪ إلى 35٪ مذيب B (أسيتونيتريل مع 0.15٪ حمض الفورميك) على مدار 140 دقيقة.
- احصل على البيانات باستخدام عمليات مسح MS عالية الدقة متبوعة بعمليات مسح MS / MS الترادفية لأكثر 10 أيونات كثافة.
8. تحليل البيانات
- معالجة بيانات LC-MS الأولية باستخدام برنامج Progenesis.
- تصدير ملفات .mgf وتحليلها باستخدام MASCOT.
- قم بإجراء القياس الكمي للببتيد باستخدام SafeQuant لمراقبة الجودة وتعديل الاكتشاف الخاطئ.
- قم بإجراء جميع التجارب في نسخ مكررة أو ثلاثية لضمان قابلية التكرار.
مكبرات صوتية متعددة العينات لإعداد عينة عالية الإنتاجية
تعمل نماذج الصوتنة متعددة العينات VialTweeter و UIP400MTP على تحسين دقة وكفاءة سير العمل التجريبي بشكل كبير ، خاصة في أبحاث الأغشية الحيوية والبروتينات. تضمن قدرتها على معالجة عينات متعددة بشكل موحد سعة إنتاجية عالية دون المساس بجودة البيانات. هذه الفوائد ، جنبا إلى جنب مع سير العمل المبسط الموضحة أعلاه ، تجعل أجهزة الصوتنة متعددة العينات من Hielscher أدوات أساسية للبحث البيولوجي الحديث.
- كفاءة عالية
- أحدث التقنيات
- موثوقيه & متانه
- تحكم دقيق وقابل للتعديل في العملية
- الدفعه & مضمنه
- لأي وحدة تخزين
- برنامج ذكي
- الميزات الذكية (على سبيل المثال ، قابلة للبرمجة ، وبروتوكول البيانات ، والتحكم عن بعد)
- سهل وآمن للعمل
- صيانة منخفضة
- التنظيف المكاني (التنظيف المكاني)
التصميم والتصنيع والاستشارات – جودة صنع في ألمانيا
Hielscher الموجات فوق الصوتية معروفة جيدا لأعلى معايير الجودة والتصميم. المتانة والتشغيل السهل تسمح بالتكامل السلس للموجات فوق الصوتية لدينا في المنشآت الصناعية. يتم التعامل بسهولة مع الظروف القاسية والبيئات الصعبة بواسطة الموجات فوق الصوتية Hielscher.
Hielscher Ultrasonics هي شركة حاصلة على شهادة الأيزو وتركز بشكل خاص على الموجات فوق الصوتية عالية الأداء التي تتميز بأحدث التقنيات وسهولة الاستخدام. بطبيعة الحال، الموجات فوق الصوتية Hielscher هي CE المتوافقة وتلبية متطلبات UL، وكالة الفضاء الكندية وبنفايات.
الأدب / المراجع / صحائف الوقائع
- Download PDF “Protocol using Hielscher Multi-Sample Sonicators in Biofilm and Proteomic Analysis” – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP400MTP – High-throughput Sonicator for Multiwell-Plates
- FactSheet VialTweeter – Simultaneous sonication of closed vials
- Shirley J.D., Nauta K.M., Carlson E.E. (2022): Live-Cell Profiling of Penicillin-Binding Protein Inhibitors in Escherichia coli MG1655. ACS Infectious Diseases Jul 8;8(7); 2022. 1241-1252.
- Teteneva N.A., Mart’yanov S.V., Esteban-López M., Kahnt J., Glatter T,. Netrusov A.I., Plakunov V.K., Sourjik V. (2020): Multiple drug-induced stress responses inhibit formation of Escherichia coli biofilms. Applied Environmental Microbiology 2020: 86:e01113-20.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
أسئلة مكررة
ما هو الفيلم الحيوي؟
الأغشية الحيوية عبارة عن مجتمع منظم من الكائنات الحية الدقيقة المضمنة في مصفوفة خارج الخلية ذاتية الإنتاج (ECM) ، تلتصق بالأسطح. يوفر الحماية ضد الضغوط البيئية والمضادات الحيوية وجهاز المناعة ، مما يساهم في الالتهابات المستمرة والقاشفات الحيوية.
ما هو انفصال الأغشية الحيوية؟
انفصال الأغشية الحيوية هو العملية التي تنفصل من خلالها الخلايا الميكروبية أو العناقيد عن بنية الأغشية الحيوية ، إما بشكل نشط (عن طريق التحلل الأنزيمي أو استشعار النصاب) أو بشكل سلبي (بسبب قوى القص أو استنفاد المغذيات أو الاضطراب الميكانيكي). هذا يسهل تشتت الأغشية الحيوية واستعمار الأسطح الجديدة.
ما هي البروتينات المرتبطة بالأغشية الحيوية؟
البروتينات المرتبطة بالأغشية الحيوية (BAPs) هي بروتينات سطحية ميكروبية أو مفرزة تلعب أدوارا رئيسية في تكوين الأغشية الحيوية واستقرارها والالتصاقها. وتشمل هذه المواد اللاصقة والإنزيمات خارج الخلية والبروتينات الهيكلية مثل ألياف الكيرلي في الإشريكية القولونية أو BapA في المكورات العنقودية الذهبية.
ما هو ECM في الأغشية الحيوية؟
المصفوفة خارج الخلية (ECM) في الأغشية الحيوية هي شبكة معقدة من السكريات والبروتينات والحمض النووي خارج الخلية (eDNA) والدهون التي تغلف الخلايا الميكروبية. يوفر السلامة الهيكلية ، ويتوسط الالتصاق ، ويحتفظ بالرطوبة ، ويعزز مقاومة الأغشية الحيوية لمضادات الميكروبات ودفاعات المضيف.
ما هي الوظيفة التي تفي بألياف التجعد؟
ألياف المجعد هي ألياف أميلويد خارج الخلية تنتجها الإشريكية القولونية والبكتيريا ذات الصلة ، وتلعب دورا مهما في تكوين الأغشية الحيوية ، والتصاق السطح ، واستعمار المضيف. إنها تساهم في سلامة الأغشية الحيوية ، وتعزز مقاومة الضغوط البيئية ، وتسهل التفاعلات مع الأنسجة المضيفة أثناء الإصابة. بالإضافة إلى ذلك ، تشارك ألياف الكيرلي في تعزيز تنشيط الجهاز المناعي وقد تورطت في استمرار البكتيريا وإمراضها.
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع الخالط بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء من المختبر ل الحجم الصناعي.