إزالة البارافين واستخلاص البروتين من FFPE

يسّر استخلاص البروتين من مقاطع الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمّنة في البارافين (FFPE) باستخدام توليفة محسّنة من إزالة البارافين والإذابة والمعالجة بالموجات فوق الصوتية بواسطة جهاز VialTweeter متعدد الأنابيب للمعالجة بالموجات فوق الصوتية. يدعم هذا البروتوكول التحليل البروتيومي اللاحق القائم على مطيافية الكتلة، ويتوافق مع مسارات عمل التنقية بتقنية SP3 والهضم الإنزيمي.

إجراء التشغيل القياسي هذا موجّه إلى العاملين في المختبرات الذين يجرون التحليل البروتيومي لعينات أنسجة FFPE باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء. وقد جرى تحسينه لمعالجة ما يصل إلى عشر عينات FFPE بالتوازي باستخدام جهاز VialTweeter متعدد الأنابيب للمعالجة بالموجات فوق الصوتية.

البروتوكول: استخلاص البروتين من عينات FFPE باستخدام VialTweeter

المواد والكواشف

الكواشف

• الزيلين (بدرجة نقاء مناسبة لعلم الأنسجة)
• الإيثانول (مطلق 96%)
• المحلول المنظّم للتحلل:

6 M Guanidine hydrochloride
50 mM Tris-HCl, pH 8.5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine)
40 mM CAA (2-Chloroacetamide)

• مثبط البروتياز (اختياري؛ مثل cOmplete™ mini الخالي من EDTA)

المعدات

• جهاز VialTweeter متعدد الأنابيب للمعالجة بالموجات فوق الصوتية
• أنابيب طرد مركزي دقيق منخفضة الارتباط بسعة 1.5 mL أو 2.0 mL
• كتلة تسخين أو حاضنة (بإعدادَي 95°C و80°C)
• جهاز طرد مركزي دقيق
• جهاز خلط حراري (اختياري ولكن يُوصى به)

كمية العينة المدخلة

• 1–2 مقطع من أنسجة FFPE بسماكة 10 µm لكل عينة (أي لكل قارورة)

أو

• ما مجموعه ~100 µg من الأنسجة لكل عينة (أي لكل قارورة)

ملاحظة: استخدم شفرات جديدة للتقطيع بالمشراح الدقيق للحد من التلوث بفتات البارافين.

الإجراء

1. إزالة البارافين
   1. انقل مقاطع FFPE إلى أنابيب طرد مركزي دقيق منخفضة الارتباط.
   2. أضف 1 mL من الزيلين، ثم امزج لفترة وجيزة باستخدام الخلاط الدوامي.
   3. احضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   4. أجرِ الطرد المركزي عند 14,000 × g لمدة 2 دقيقة؛ وتخلّص من السائل الفوقاني.
   5. كرّر الغسل بالزيلين مرة أخرى (الخطوات 2–4).
   6. اغسل الراسب بـ 1 mL من الإيثانول بتركيز 96%، وامزج باستخدام الخلاط الدوامي، ثم أجرِ الطرد المركزي عند 14,000 × g لمدة 2 دقيقة. تخلّص من السائل الفوقاني.
   7. كرّر الغسل بالإيثانول مرة أخرى (بإجمالي 2 غسلة بالإيثانول).
   8. جفّف الراسب بالهواء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع إبقاء الأغطية مفتوحة لتبخير الإيثانول المتبقي.
2. استخلاص البروتين والمعالجة بالموجات فوق الصوتية
   1. أضف 200 µL من المحلول المنظّم للتحلل إلى كل راسب جاف.

      ملاحظة: على الرغم من أن جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية يستوعب ما يصل إلى 1 mL، فإن 200 µL هو الحجم الأمثل للمعالجة اللاحقة.

   2. امزج باستخدام الخلاط الدوامي أو بالسحب والدفع برفق باستخدام الماصة.
3. الحضانة الحرارية الأولى
   1. احضن الأنابيب عند 95 °C لمدة 30 min، مع الرجّ عند 400 rpm باستخدام جهاز خلط حراري أو كتلة تسخين.
   2. دع العينات تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 min.
4. المعالجة الأولى بالموجات فوق الصوتية باستخدام VialTweeter
   1. ضع الأنابيب في VialTweeter.
   2. اضبط VialTweeter UP200St على القيم أدناه وأجرِ المعالجة بالموجات فوق الصوتية.
إعدادات جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية
• اضبط السعة (A) على 100%
• اضبط نمط النبض (C) على 100%
• مؤقّت الدورة: مفعّل
• زمن التشغيل: 60s
• زمن الإيقاف: 30s
• القيمة الحدية: 15 min (تقابل 10 دورات)
(ملاحظة حسابية: (60 s تشغيل + 30 s إيقاف) × 10 دورات = 900 s = 15 min)
5. الحضانة الحرارية الثانية
   أخرج الأنابيب واحضنها مرة أخرى عند 95 °C لمدة 15 min، وعند 400 rpm.
6. المعالجة الثانية بالموجات فوق الصوتية
   كرّر المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام VialTweeter بالإعدادات نفسها (كما ورد أعلاه) لمدة 10 دورات إضافية (بإجمالي 15 min).
7. ترويق محلول التحلل
   1. أجرِ الطرد المركزي للعينات عند 13,000 × g لمدة 10 min عند 23°C (درجة حرارة الغرفة).
   2. اجمع السائل الفوقاني بعناية في أنبوب Eppendorf Safe-lock جديد بسعة 2.0 mL. تجنّب تحريك الراسب.
8. المعالجة اللاحقة
   أصبح محلول التحلل الآن جاهزًا للتنقية بتقنية SP3 والهضم الإنزيمي.

ملاحظات وأفضل الممارسات

1. تُخفَّف مخاطر فرط التسخين أثناء المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام دورات تشغيل/إيقاف مبرمجة.
2. تجنّب المزج باستخدام الخلاط الدوامي بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية لمنع تجمّع البروتينات.

التخلّص من النفايات والسلامة

يوضح الجدول أدناه القدرة التقريبية على المعالجة لأجهزتنا المختبرية للمعالجة بالموجات فوق الصوتية: