إزالة البارافينات واستخراج البروتين من FFPE

تسهيل استخراج البروتين من أقسام أنسجة البارافين المدمجة بالفورمالين (FFPE) باستخدام مزيج محسن من إزالة البارافين والذوبان والصوتنة باستخدام الموجات فوق الصوتية متعددة الأنابيب VialTweeter. يدعم هذا البروتوكول البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي المصب وهو متوافق مع تنظيف SP3 وسير عمل الهضم الأنزيمي.

تم تصميم هذا الإجراء التشغيلي الموحد لموظفي المختبر المشاركين في التحليل البروتيني لعينات أنسجة FFPE باستخدام صوتنة عالية الأداء. تم تحسينه لما يصل إلى عشر عينات FFPE تتم معالجتها بالتوازي باستخدام VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

البروتوكول: استخراج البروتين من عينات FFPE باستخدام VialTweeter

المواد والكواشف

الكواشف

• الزيلين (درجة الأنسجة)
• الإيثانول (96 ٪ مطلقة)
• المخزن المؤقت للتحلل:

6 م هيدروكلوريد جوانيدين
50 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8.5
10 ملي مولار TCEP (تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين)
40 ملي CAA (2-كلوروأسيتاميد)

• مثبط البروتياز (اختياري ؛ على سبيل المثال ، cOmplete™ mini EDTA)

معدات

• VialTweeter متعدد الأنابيب بالموجات فوق الصوتية
• 1.5 مل أو 2.0 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الارتباط
• كتلة حرارية أو حاضنة (إعدادات 95 درجة مئوية و 80 درجة مئوية)
• أجهزة الطرد المركزي الدقيقة
• خلاط حراري (اختياري ولكن موصى به)

عينة الإدخال

• 1-2 قسم من أنسجة FFPE بسمك 10 ميكرومتر لكل عينة (أي لكل قارورة)

أو

• ما مجموعه ~ 100 ميكروغرام من الأنسجة لكل عينة (أي لكل قارورة)

ملاحظة: استخدم شفرات جديدة للاستئصال المجهري لتقليل التلوث بحطام البارافين.

إجراء

1. إزالة البارافين
   1. نقل أقسام FFPE إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الارتباط.
   2. أضف 1 مل من الزيلين ، دوامة لفترة وجيزة.
   3. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   4. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × غرام لمدة دقيقتين ؛ تجاهل المادة الطافية.
   5. كرر غسل الزيلين مرة أخرى (الخطوات 2-4).
   6. اغسل الحبيبات ب 1 مل من 96٪ إيثانول ، دوامة ، ثم جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة دقيقتين. تجاهل المادة الطافية.
   7. كرر غسل الإيثانول مرة أخرى (إجمالي 2 غسلة من الإيثانول).
   8. حبيبات جافة بالهواء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع أغطية مفتوحة لتبخير الإيثانول المتبقي.
2. استخراج البروتين وصوتنة
   1. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى كل بيليه جاف.
      ملاحظة: على الرغم من أن جهاز الصوتنة يستوعب ما يصل إلى 1 مل ، إلا أن 200 ميكرولتر هو الأمثل للمعالجة النهائية.

   2. امزج عن طريق الدوامة أو سحب العينة اللطيف.
3. الحضانة الحرارية الأولى
   1. احتضان الأنابيب عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مع التحريك عند 400 دورة في الدقيقة باستخدام خلاط حراري أو كتلة حرارية.
   2. دع العينات تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
4. أول صوتنة مع VialTweeter
   1. ضع الأنابيب في VialTweeter.
   2. اضبط VialTweeter UP200St على القيم أدناه وقم بالصوت.
إعدادات Sonicator
• اضبط السعة (A) على 100٪
• اضبط وضع النبض (C) على 100٪
• ساعة الفترة: تشغيل
• في الوقت المحدد: 60 ثانية
• وقت الإقبال: 30 ثانية
• القيمة المحددة: 15 دقيقة (تتوافق مع 10 دورات)
(ملاحظة الحساب: (تشغيل 60 ثانية + إيقاف تشغيل 30 ثانية) × 10 دورات = 900 ثانية = 15 دقيقة)
5. الحضانة الحرارية الثانية
   قم بإزالة الأنابيب واحتضانها مرة أخرى عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة و 400 دورة في الدقيقة.
6. الصوتنة الثانية
   كرر الصوتنة على VialTweeter باستخدام نفس الإعدادات (كما هو مذكور أعلاه) لمدة 10 دورات إضافية (إجمالي 15 دقيقة).
7. توضيح Lysate
   1. الطرد المركزي للعينات عند 13,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 23 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة).
   2. اجمع المادة الطافية بعناية في أنبوب Eppendorf جديد بقفل آمن سعة 2.0 مل. تجنب إزعاج الحبيبات.
8. المعالجة النهائية
   المحللة جاهزة الآن لتنظيف SP3 والهضم الأنزيمي.

الملاحظات وأفضل الممارسات

1. يتم التخفيف من مخاطر ارتفاع درجة الحرارة أثناء الصوتنة عن طريق تشغيل / إيقاف تشغيل مبرمج.
2. تجنب دوامة ما بعد الصوتنة لمنع تراكم البروتين.

التخلص من النفايات وسلامتها

يمنحك الجدول أدناه مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لأجهزة الموجات فوق الصوتية بحجم المختبر: