تحضير عينات FFPE بمعدل معالجة مرتفع: استخلاص البروتينات وقص الأحماض النووية

الأسئلة الشائعة
نجيب فيما يلي عن الأسئلة الشائعة المتعلقة بتحضير أنسجة FFPE ومعالجة عينات FFPE بالموجات فوق الصوتية.

كيف تُحضّر أنسجة FFPE؟

خطوات تحضير أنسجة FFPE: يُعد التعامل الدقيق مع الأنسجة الطازجة ومعالجتها أمرًا حاسمًا لإنتاج عينات FFPE عالية الجودة. ويُعد ضمان الحفاظ على البنية المعمارية الخلوية والأحماض النووية والبروتينات ضروريًا لإجراء تحليل لاحق دقيق. وتتطلب كل خطوة – من الجمع إلى الطمر – الدقة للحفاظ على سلامة العينة لإجراء تحليلات متنوعة، بما فيها الفحص النسيجي والكيمياء النسيجية المناعية والدراسات الجزيئية. وعند تنفيذ عملية التثبيت والطمر هذه بصورة صحيحة، فإنها تضمن أن الأنسجة المحفوظة تعكس بدقة حالتها داخل الكائن الحي، مما يتيح نتائج تشخيصية وبحثية موثوقة.
نرشدك إلى الخطوات الرئيسية الـ 6 لعملية طمر عينات أنسجة FFPE.

• جمع الأنسجة
  تُعد الخزعات المأخوذة من الثدييات الحية ومزارع الأنسجة مصدرين صالحين للحصول على أنسجة طازجة لتحضير عينات FFPE.
  من المهم استخدام تقنية معقمة: استخدم أدوات وقفازات معقمة لتجنب التلوث. ويُفضّل جمع الأنسجة في بيئة معقمة، مثل غرفة عمليات أو حجرة تدفق صفائحي.
  نظرًا إلى أن العينة شديدة الهشاشة، فإن التعامل معها برفق أمر ضروري: قلل التأخير في المعالجة وابدأ معالجة الأنسجة اللاحقة فورًا بعد الاستئصال. وهذا أمر حاسم لمنع التحلل الذاتي والتدهور. احتفظ بالأنسجة في درجة حرارة الغرفة؛ وتجنب تجميدها، إذ قد يؤدي ذلك إلى تكوّن بلورات جليدية وتلف الأنسجة.
• تثبيت الأنسجة
  أولًا، تُعالج الأنسجة بمحلول مثبت: استخدم فورمالين بتركيز 10% مضبوطًا بمحلول منظم متعادل (NBF)، وهو ما يعادل فورمالدهيد بتركيز 4% في الماء، مضبوطًا عند pH متعادل.
  اغمر الأنسجة بالكامل في الفورمالين. واحرص على أن تكون نسبة حجم المثبت إلى حجم الأنسجة 10:1 على الأقل. وتتراوح مدة التثبيت عادةً من 6 إلى 24 ساعة، بحسب نوع الأنسجة وحجمها. ومن المهم أن يتمكن المثبت من اختراق الأنسجة بالكامل. ومع ذلك، قد يؤدي الإفراط في التثبيت إلى تكوين روابط متصالبة تُعقّد استرجاع المستضدات، بينما قد يؤدي التثبيت غير الكافي إلى ضعف حفظ الأنسجة.
• تشذيب الأنسجة
  ثانيًا، شذّب الأنسجة إلى سماكة تبلغ نحو 3–5 mm للسماح باختراق كافٍ للمثبت. واحرص على توجيه الأنسجة بصورة صحيحة لإظهار البنى النسيجية ذات الصلة. وهذا يُيسّر عملية الاستخلاص عند استخدام الأنسجة لاحقًا للتحليل.
• معالجة العينة المثبتة
  الآن، يجب نزع الماء من الأنسجة المثبتة: بعد التثبيت، يلزم نزع الماء من الأنسجة لضمان اختراق شمع البارافين لها بالكامل. مرّر الأنسجة عبر سلسلة متدرجة من الإيثانول (70%، 80%، 90%، و100%) لإزالة الماء.
  الترويق بالزيلين: لا يذوب شمع البارافين في الماء، لكنه يذوب في الزيلين. ولذلك، يجب استبدال الماء الموجود في الأنسجة بالزيلين. ومع ذلك، فإن الزيلين نفسه لا يذوب في الماء، لكنه يذوب في الكحول، مما يستلزم خطوة وسيطة يُستبدل فيها الماء أولًا بالكحول. اغمر الأنسجة في الزيلين أو بديل للزيلين لإزالة الإيثانول وتهيئة الأنسجة لتشريبها بالبارافين.
  التشريب باستخدام البارافين: اطمر الأنسجة في شمع البارافين المنصهر، مع ضمان التشريب الكامل. وتتضمن هذه الخطوة عادةً تبديل البارافين عدة مرات لضمان التشبع الكامل.
• طمر الأنسجة
  في هذه الخطوة، تُشكّل الأنسجة في كتلة نسيجية: ضع الأنسجة في قالب بالاتجاه المطلوب وصب البارافين المنصهر فوقها. واترك البارافين يتصلب بالتبريد في درجة حرارة الغرفة أو على صفيحة باردة.
• التقطيع والتثبيت على الشرائح
  التقطيع بالمشراح الدقيق: لتقطيع الأنسجة المطمورة، استخدم مشراحًا دقيقًا لقطع مقاطع رقيقة من كتلة البارافين (عادةً بسماكة 4–5 ميكرومترات). ثم تُثبّت العينة بوضع المقاطع على شرائح زجاجية للتلوين اللاحق والتحليل المجهري.
  وأخيرًا، تحقق من جودة التحضير النسيجي: قيّم المقاطع الأولى تحت المجهر لضمان التثبيت والمعالجة بصورة صحيحة. وعدّل البروتوكولات حسب الحاجة بناءً على نوع الأنسجة والجودة الملحوظة.

 
يمكن استخدام أنسجة FFPE لاسترجاع RNA وDNA والبروتينات، وكذلك اكتشاف علامات السرطان أو غيره من الأمراض. ويمكن تخزينها لسنوات، وهي جزء أساسي من استخدام الباحثين والأطباء لعينات الأنسجة في التشخيص والبحث.

ما المشكلات والتحديات الشائعة المتعلقة بأنسجة FFPE؟

تُستخدم عينات الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين (FFPE) على نطاق واسع في البحث والتشخيص، لكنها تنطوي على عدة تحديات ومشكلات شائعة:

• تحلل الجزيئات الحيوية: قد يؤدي التثبيت المطول إلى تحلل DNA وRNA والبروتينات، مما يصعّب استخلاص أحماض نووية أو بروتينات عالية الجودة للتطبيقات اللاحقة. ويُعد التثبيت الصحيح، مع تجنب التثبيت غير الكافي والإفراط في التثبيت، ضروريًا لحفظ الأنسجة.

تكوين الروابط المتصالبة: يؤدي التثبيت بالفورمالين إلى تكوين روابط متصالبة بين البروتينات والأحماض النووية، مما قد يعيق التحليل الجزيئي ويؤثر في دقة الكيمياء النسيجية المناعية والمقايسات الأخرى.

• حجب المستضدات: يمكن لعملية التثبيت أن تحجب المواقع المستضدية، مما يقلل فعالية ارتباط الأجسام المضادة في الكيمياء النسيجية المناعية والمقايسات المناعية الأخرى. وغالبًا ما يتطلب ذلك استرجاع المستضدات، وهو إجراء يُزال من خلاله حجب الحاتمة ويُستعاد ارتباط الحاتمة بالجسم المضاد. ومع ذلك، قد لا تُستعاد المستضدية بالكامل دائمًا.
• تفاوت جودة التثبيت: يمكن أن تؤدي الاختلافات في مدد التثبيت وظروفه إلى عدم اتساق جودة العينات، مما يؤثر في قابلية تكرار النتائج ومقارنتها. استخدم بروتوكولات تثبيت موثوقة وتجنب التثبيت غير الكافي والإفراط في التثبيت.
• تلف DNA وتجزؤه: يمكن أن يؤدي تثبيت عينات FFPE بالفورمالين إلى أنواع مختلفة من تلف DNA، بما فيها نزع الأمين من السيتوزين (طفرات من C إلى T)، والضرر التأكسدي (مثل 8-oxo-guanine الذي يؤدي إلى طفرات من G إلى T)، وكذلك أضرار بنيوية مثل القطوع أحادية السلسلة والفجوات والمواقع الخالية من القواعد، التي تعيق نشاط بوليميراز DNA. ويمكن أن تؤدي عملية التثبيت بالفورمالين إلى تجزؤ DNA، مما يُعقّد التحليلات الوراثية والجينومية، مثل PCR والتسلسل.
• جودة RNA: غالبًا ما يكون RNA المستخلص من أنسجة FFPE مجزّأً ومعدلًا كيميائيًا، مما يجعل إجراء تحليلات ترانسكريبتومية عالية الجودة أمرًا صعبًا.
• تعديلات البروتينات: يمكن للفورمالين أن يُحدث تعديلات كيميائية في البروتينات، مما يؤثر في بنيتها ووظيفتها وقد يتداخل مع التحليلات البروتيومية.
• الآثار الاصطناعية الناتجة عن معالجة العينات: أثناء عمليتي الطمر والتقطيع، قد يُحدث الإجهاد الميكانيكي والحرارة آثارًا اصطناعية ويسببان مزيدًا من الضرر للأنسجة.
• التباين بين الدفعات: يمكن أن تؤدي الاختلافات في بروتوكولات التثبيت والطمر بين الدفعات المختلفة إلى تباين كبير في النتائج، مما يُعقّد المقارنات بين الدراسات.
• مشكلات التخزين: قد يؤدي التخزين طويل الأمد لكتل FFPE إلى مزيد من التحلل وفقدان سلامة الأحماض النووية بمرور الوقت، مما يؤثر في صلاحية العينات المؤرشفة للدراسات الاستعادية.

يساعد استخدام بروتوكولات محسّنة، والتعامل بعناية مع العينات، وتطبيق تقنيات متقدمة على تحسين جودة البيانات المستمدة من أنسجة FFPE وموثوقيتها.

ما الفرق بين أنسجة FFPE والأنسجة المجمدة؟

تُحفظ أنسجة FFPE (المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين) باستخدام الفورمالين لتثبيت الأنسجة، ثم تُطمر في شمع البارافين، مما يتيح تخزينها طويل الأمد في درجة حرارة الغرفة مع الحفاظ على شكل الأنسجة. وفي المقابل، تُحفظ الأنسجة المجمدة بسرعة عن طريق التجميد، الذي يحافظ بصورة أفضل على سلامة الأحماض النووية والبروتينات، لكنه يتطلب التخزين في درجات حرارة منخفضة جدًا.

ما المواد الكيميائية المستخدمة لطمر أنسجة FFPE؟

تشمل المواد الكيميائية المستخدمة عادةً لطمر أنسجة FFPE الفورمالين للتثبيت وشمع البارافين للطمر. ولطمر أنسجة FFPE، تُثبّت الأنسجة عادةً باستخدام إما فورمالين بتركيز 10% (v/v) مضبوط بمحلول منظم متعادل (FA)، أو محلول فورمالدهيد بتركيز 4% (w/v) مُحضّر حديثًا (PFA) من مسحوق البارافورمالدهيد. ويُضبط الفورمالين، وهو محلول من الفورمالدهيد في الماء، بمحلول منظم عند pH متعادل للحفاظ على شكل الأنسجة ومنع التكوين المفرط للروابط المتصالبة. كما يوفر المحلول القائم على البارافورمالدهيد تثبيتًا فعالًا من خلال تكوين روابط متصالبة بين البروتينات، مما يثبّت بنية الأنسجة لطمرها لاحقًا في شمع البارافين. وتُعد هذه المواد الكيميائية ضرورية للحفاظ على سلامة الأنسجة وشكلها أثناء عملية التثبيت والطمر.

كيف يُزال البارافين من عينات FFPE؟

لإزالة البارافين من عينات FFPE، تُعرّض المقاطع النسيجية عادةً لسلسلة من عمليات الغسل بالزيلين، تتبعها إعادة الترطيب عبر سلسلة متدرجة من الكحولات، ثم الماء في النهاية. ونظرًا إلى أن الزيلين شديد السمية ويشكّل مخاطر صحية مثل المشكلات التنفسية وتهيج الجلد والتأثيرات المحتملة طويلة الأمد مع التعرض المتكرر، فإن إزالة البارافين بالموجات فوق الصوتية تبرز بوصفها بديلًا واعدًا في العديد من المختبرات. وتستخدم هذه الطريقة موجات فوق صوتية شديدة لإزالة البارافين بكفاءة وأمان دون الحاجة إلى مذيبات سامة مثل الزيلين، مما يقلل المخاطر على العاملين في المختبر ويوفر بيئة عمل أكثر أمانًا.

ما المدة التي ينبغي أن أثبّت خلالها أنسجتي للحصول على عينات FFPE جيدة الجودة؟

تقترح التوصيات العامة لمدة التثبيت عادةً تثبيت عينات الأنسجة في الفورمالين لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة. وتكون هذه المدة كافية عمومًا للحفاظ على شكل الأنسجة والبنى الخلوية، مع الحد من الإفراط في التثبيت الذي قد يؤدي إلى تكوين مفرط للروابط المتصالبة وتحلل الأحماض النووية والبروتينات. ومع ذلك، يمكن أن تختلف مدة التثبيت المثلى بحسب حجم الأنسجة ونوعها، إذ تتطلب العينات الأصغر أو الأكثر رقة مدد تثبيت أقصر. ومن الضروري تحقيق التوازن بين التثبيت الكافي لمنع التحلل الذاتي للأنسجة وتدهورها، وتجنب التثبيت المطول الذي قد يُعقّد التحليلات الجزيئية اللاحقة.