بروتوكول زراعة وانفصال المكورات العنقودية الحيوية
الأساليب الموحدة ضرورية لنتائج البحث الموثوقة. هنا يمكنك العثور على بروتوكول زراعة وانفصال الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية. يركز هذا البروتوكول على تحضير العينة المبسطة عالية الإنتاجية باستخدام سونيكاتر الألواح UIP400MTP متعدد الآبار لفصل الأغشية الحيوية الفعال وعالي الإنتاجية في ألواح 96 بئرا. يحتوي البروتوكول أيضا على خطوات رئيسية لزراعة الأغشية الحيوية وغسلها وتصورها ، مع التركيز على تقليل التباين وضمان التكاثر.
المكورات العنقودية الأغشية الحيوية وأبحاث المضادات الحيوية
تلعب المكورات العنقودية الحيوية دورا مهما في الالتهابات المستمرة بسبب مقاومتها للمضادات الحيوية والاستجابات المناعية. يوفر تكوين الأغشية الحيوية بيئة وقائية للبكتيريا ، مما يجعل من الصعب علاج العدوى. غالبا ما يركز البحث في الأغشية الحيوية على فهم تكوينها وسلوكها وقابليتها للإصابة بمضادات الميكروبات ، مع التركيز على الأساليب عالية الإنتاجية لتبسيط سير العمل التجريبي.
يوفر جهاز الصوتنة متعدد الآبار UIP400MTP ميزة كبيرة في أبحاث الأغشية الحيوية من خلال تمكين الانفصال السريع والفعال للأغشية الحيوية من ألواح 96 بئرا. يوفر هذا الجهاز طاقة موجات فوق صوتية موحدة لجميع الآبار ، مما يضمن نتائج متسقة مع تقليل التباين.
بروتوكول زراعة المكورات العنقودية الأغشية الحيوية وانفصالها
أدناه ، نوجهك بتعليمات خطوة بخطوة خلال عملية زراعة وفصل غشاء حيوي للمكورات العنقودية. كخطوة تحليلية نموذجية ، نوضح لك كيفية تحديد الكتلة الحيوية المزروعة بشكل طيفي عن طريق تلطيخ البنفسج البلوري.
زراعة المكورات العنقودية الحيوية
المواد المطلوبة:
- ألواح ميكروتيتر معقمة ذات قاع مسطح 96 بئر من البوليسترين المعالجة بزراعة الأنسجة مع أغطية
- مرق الصويا التربتي (TSB) مع 0.25٪ جلوكوز
- خزانة السلامة البيولوجية
الخطوات:
- قم بإعداد بيئة عمل معقمة في خزانة السلامة البيولوجية لتقليل التلوث.
- أضف TSB الذي يحتوي على 0.25٪ جلوكوز إلى آبار صفيحة الميكروتيتر. لا يدعم TSB بدون الجلوكوز بشكل عام تكوين الأغشية الحيوية ويجب استخدامه فقط كعنصر تحكم إذا لزم الأمر.
- تلقيح الآبار بسلالات بكتيرية محضرة كما هو موضح أدناه:
- قم بإعداد المعلقات البكتيرية ، وضمان عدم وجود مجموعات خلايا موجودة مسبقا عن طريق تجانس المعلقات باستخدام صوتنة أو عن طريق تفكيك المجموعات بإبرة قياس 23 ودوامة قصيرة.
- أغلق اللوحة بغطاءها واحتضانها في ظل الظروف المثلى لتكوين الأغشية الحيوية (على سبيل المثال ، 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة).
- قم بإجراء التجربة ثلاث نسخ لكل سلالة بكتيرية (ثلاثة آبار لكل سلالة) لضمان الموثوقية.
- تخصيص ستة آبار لكل لوحة للضوابط السلبية. يمكن اختبار ما يصل إلى 30 سلالة لكل لوحة 96 بئرا.
تصور وغسيل الأغشية الحيوية
- بعد الحضانة ، تخلص من الوسط بعناية لتجنب إزعاج الأغشية الحيوية.
- اغسل كل بئر أربع مرات بمحلول ملحي فسيولوجي لإزالة البكتيريا العوالق.
- افحص قاع الآبار بحثا عن بقع بيضاء تدل على وجود الأغشية الحيوية.
انفصال الأغشية الحيوية باستخدام UIP400MTP الصوتي متعدد الآبار
إعداد الجهاز والمعلمات:
- UIP400MTP سونيكاتير لوحة متعددة الآبار
- إعدادات التشغيل: سعة 60٪ ، وضع الدورة مع تشغيل 60 ثانية / إيقاف تشغيل 30 ثانية
الخطوات:
- ضع لوحة الميكروتيتر المغسولة على منصة UIP400MTP.
- قم بتشغيل العينات في الإعدادات الموصى بها (سعة 60٪ ، تشغيل 60 ثانية ، إيقاف تشغيل 30 ثانية). اضبط الإعدادات على سلالة البكتيريا.
- بدء عملية صوتنة لفصل الأغشية الحيوية. تعطل الموجات فوق الصوتية مصفوفة الأغشية الحيوية ، وتطلق البكتيريا الملتصقة.
- يضمن UIP400MTP تعرضا موحدا عبر جميع الآبار للحصول على نتائج انفصال متسقة.
بكتيريا المكورات العنقودية
الخطوة التحليلية: القياس الكمي للكتلة الحيوية للغشاء الحيوي للمكورات العنقودية المنفصلة باستخدام البنفسج الكريستالي (CV)
المواد المطلوبة:
- 0.1٪ محلول بنفسجي بلوري (CV)
- 95٪ إيثانول أو 30٪ حمض الأسيتيك (للذوبان)
- قارئ Microplate قادر على القراءة عند 570 نانومتر
- لوحات ميكروتيتر معقمة للتلطيخ
الخطوات:
- تحضير لوحة التلوين: نقل 100 ميكرولتر من تعليق الأغشية الحيوية المنفصلة من كل بئر من اللوحة الصوتية إلى الآبار المقابلة للوحة ميكروتيتر نظيفة ومعقمة مكونة من 96 بئر. هذا يضمن بيئة واضحة وموحدة للتلطيخ.
- تلطيخ الأغشية الحيوية المنفصلة: أضف 150 ميكرولتر من محلول بنفسجي بلوري 0.1٪ إلى كل بئر يحتوي على تعليق الأغشية الحيوية المنفصل. ماصة برفق لضمان الخلط المتساوي لتعليق الأغشية الحيوية والبنفسجي الكريستالي.
- حضانة: اترك اللوحة تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لتمكين البنفسج البلوري من تلطيخ الكتلة الحيوية بشكل فعال.
- الغسيل: بعد الحضانة ، تخلص بعناية من محلول البنفسج البلوري من الآبار دون إزعاج الكتلة الحيوية. اغسل كل بئر ثلاث مرات بمحلول ملحي فسيولوجي معقم لإزالة البقعة غير المربوطة.
- التجفيف: اترك اللوحة تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة أو تحت غطاء تدفق هواء معقم. تجنب التسخين ، لأن هذا قد يغير النتائج.
- الذوبان: أضف 200 ميكرولتر من 95٪ من الإيثانول (أو 30٪ حمض الخليك ، اعتمادا على الممارسات المعملية القياسية) إلى كل بئر لإذابة البنفسج البلوري المرتبط. تخلط برفق عن طريق سحب العينات أو رج الطبق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- القياس: قم بقياس الكثافة الضوئية (OD) للمحلول البنفسجي البلوري المذاب عند 570 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
- تحليل البيانات: اطرح متوسط قيمة OD570 للضوابط السلبية (الآبار التي تحتوي على TSB ولكن لا يوجد لقاح بكتيري) من الآبار التجريبية لحساب تلطيخ الخلفية. تسجيل البيانات وتحليلها.
ملاحظة: قم بإجراء التجربة ثلاث نسخ لكل حالة لضمان قابلية التكرار. ضمان التعامل السليم مع البنفسج الكريستالي والإيثانول ، مع الالتزام ببروتوكولات السلامة والتخلص.
UIP400MTP ليس حمام بالموجات فوق الصوتية. إنه'A بوق كوب عالي الكثافة لصوتنة مركزة. هذا sonicator قوية عدم الاتصال يسلم صوتنة موحدة عبر جميع الآبار من لوحة البئر القياسية الخاصة بك. لديك تحكم دقيق في السعة والقوة والنبض. يضمن المؤقت المدمج ومسبار درجة الحرارة نتائج متسقة. يقوم جهاز صوتنة لوحة UIP400MTP بتبريد العينات بحمام مائي (مبرد خارجي اختياري).
لمحة عن الفوائد الرئيسية UIP400MTP:
- معالجة عالية الإنتاجية: مصمم خصيصا للألواح متعددة الآبار ، مما يسمح لك بمعالجة عينات متعددة في وقت واحد.
- توزيع الموحد بالموجات فوق الصوتية: يضمن كثافة الموجات فوق الصوتية المتساوية عبر الآبار ، مما يوفر نتائج متسقة عبر جميع العينات.
- استخدم أي لوحة قياسية: يمكن UIP400MTP التعامل مع أي ألواح قياسية متعددة الآبار وأطباق بتري ورفوف أنبوبية. لا توجد لوحات ملكية باهظة الثمن مطلوبة!
- واجهة سهلة الاستخدام: سهل الإعداد والتحكم ، مما يجعله أداة ممتازة لزيادة إنتاجية المختبر. تسهل الإعدادات القابلة للبرمجة والأتمتة توحيد العملية!
انفصال الأغشية الحيوية عالي الإنتاجية مع لوحة سونيكاتور 96 بئر UIP400MTP
الأدب / المراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
أسئلة مكررة
ما هي المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS)؟
المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) عبارة عن مزيج معقد من البوليمرات الحيوية ، يتكون بشكل أساسي من السكريات والبروتينات والأحماض النووية والدهون ، التي تفرزها الكائنات الحية الدقيقة في الأغشية الحيوية. يشكل EPS مصفوفة واقية تغلف المجتمع الميكروبي ، وتوفر السلامة الهيكلية ، وتتوسط الالتصاق بالأسطح ، وتحمي الخلايا من الضغوط البيئية ، بما في ذلك المضادات الحيوية والاستجابات المناعية.
ما المقصود بالبكتيريا العوالق؟
بكتيريا العوالق هي كائنات دقيقة أحادية الخلية تطفو بحرية وموجودة في حالة تعليق ، كما هو الحال في الثقافة السائلة أو سوائل الجسم ، بدلا من أن تكون مرتبطة بالأسطح أو تشكل مجتمعات منظمة مثل الأغشية الحيوية.
ما هو الفرق بين الأغشية الحيوية والبكتيريا العوالق؟
يكمن الاختلاف الرئيسي بين الأغشية الحيوية والبكتيريا العوالق في تنظيمها. الأغشية الحيوية عبارة عن مجتمعات منظمة ومتصلة بالسطح من البكتيريا المضمنة في مصفوفة مادة بوليمرية خارج الخلية (EPS) ، في حين أن بكتيريا العوالق تطفو بحرية وتفتقر إلى مثل هذا التنظيم الهيكلي.
هل يصعب علاج البكتيريا الموجودة في الأغشية الحيوية بالمضادات الحيوية من بكتيريا العوالق؟
يصعب علاج البكتيريا الموجودة في الأغشية الحيوية بالمضادات الحيوية مقارنة بالبكتيريا العوالق. تعمل مصفوفة الأغشية الحيوية كحاجز مادي ، وتظهر البكتيريا الموجودة بداخلها حالات أيضية متغيرة ومقاومة معززة للإجهاد ، مما يساهم في تقليل فعالية المضادات الحيوية.
هل يمكن قتل الأغشية الحيوية بالمضادات الحيوية؟
يمكن في بعض الأحيان القضاء على الأغشية الحيوية عن طريق المضادات الحيوية ، لكن هذا يمثل تحديا. غالبا ما يتطلب العلاج الفعال تركيزات عالية من المضادات الحيوية أو تركيبات محددة أو علاجات مساعدة ، حيث تحمي مصفوفة EPS وآليات المقاومة البكتيرية الأغشية الحيوية.
هل المكورات العنقودية بكتيريا ملتصقة؟
تشتهر بكتيريا المكورات العنقودية بقدراتها على الالتصاق. تلتصق بسهولة بالأسطح ، وتشكل أغشية حيوية ، خاصة على الأجهزة الطبية أو الأنسجة المضيفة ، مما يجعلها مساهما رئيسيا في الالتهابات المستمرة.
ما هي أنواع بكتيريا المكورات العنقودية الموجودة؟
تشمل بكتيريا المكورات العنقودية عدة أنواع ، أبرزها المكورات العنقودية الذهبية والمكورات العنقودية البشروية. المكورات العنقودية الذهبية مسببة للأمراض ويمكن أن تسبب التهابات شديدة ، بينما ترتبط المكورات العنقودية البشرانية عادة بعدوى الجهاز المرتبطة بالأغشية الحيوية.
ما هو كريستال البنفسجي؟
البنفسجي الكريستالي هو صبغة أساسية شائعة الاستخدام لتلوين المواد البيولوجية. في علم الأحياء الدقيقة ، يتم استخدامه لتقييم تكوين الأغشية الحيوية عن طريق تلطيخ الكتلة الحيوية ، والتي يمكن بعد ذلك قياسها كميا بشكل طيفي.
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع الخالط بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء من المختبر ل الحجم الصناعي.