بروتوكول استنبات الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية وفصلها

تُعدّ الطرق الموحّدة ضرورية للحصول على نتائج بحثية موثوقة. تجدون هنا بروتوكولًا لاستنبات الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية وفصلها. يركّز هذا البروتوكول على تبسيط تحضير العينات بمعدل معالجة مرتفع باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للألواح متعددة الآبار UIP400MTP، لفصل الأغشية الحيوية بكفاءة وبمعدل معالجة مرتفع في ألواح ذات 96 بئرًا. ويتضمن البروتوكول أيضًا خطوات أساسية لاستنبات الأغشية الحيوية وغسلها وإظهارها بصريًا، مع التركيز على تقليل التباين وضمان قابلية تكرار النتائج.

أبحاث الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية والمضادات الحيوية

تؤدي الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية دورًا محوريًا في العدوى المستمرة بسبب مقاومتها للمضادات الحيوية والاستجابات المناعية. ويوفّر تكوّن الأغشية الحيوية بيئة واقية للبكتيريا، مما يجعل علاج العدوى صعبًا. وغالبًا ما تركّز أبحاث الأغشية الحيوية على فهم تكوّنها وسلوكها وحساسيتها لمضادات الميكروبات، مع التأكيد على الطرق ذات معدل المعالجة المرتفع لتبسيط سير العمل التجريبي.
يوفّر جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للألواح متعددة الآبار UIP400MTP ميزة مهمة في أبحاث الأغشية الحيوية، إذ يتيح فصل الأغشية الحيوية بسرعة وكفاءة عن ألواح ذات 96 بئرًا. ويوصل هذا الجهاز طاقة فوق صوتية متجانسة إلى جميع الآبار، مما يضمن نتائج متسقة مع تقليل التباين.

بروتوكول استنبات الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية وفصلها

نرشدكم فيما يلي خطوة بخطوة خلال عملية استنبات غشاء حيوي للمكورات العنقودية وفصله. وكمثال على خطوة تحليلية، نوضّح كيفية تحديد كمية الكتلة الحيوية المستنبتة باستخدام القياس الطيفي الضوئي بعد صبغها بالبنفسجي البلوري.

استنبات الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية

المواد المطلوبة:

• ألواح معايرة دقيقة معقمة من البوليسترين ذات 96 بئرًا وقاع مسطّح، معالجة لزراعة الأنسجة ومزوّدة بأغطية
• مرق الصويا التربتيكي (TSB) مع غلوكوز بنسبة 0.25%
• خزانة سلامة حيوية

الخطوات:

1. جهّز بيئة عمل معقمة داخل خزانة سلامة حيوية لتقليل التلوث.
2. أضف TSB المحتوي على غلوكوز بنسبة 0.25% إلى آبار لوح المعايرة الدقيقة. لا يدعم TSB الخالي من الغلوكوز تكوّن الأغشية الحيوية عمومًا، ويجب استخدامه فقط كشاهد عند الحاجة.
3. لقّح الآبار بسلالات بكتيرية محضّرة كما هو موضّح أدناه:
4. حضّر المعلّقات البكتيرية، مع ضمان عدم وجود تجمعات خلوية مسبقة، وذلك بتجنيس المعلّقات باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية أو بتفكيك التجمعات بإبرة مقاس 23 مع الخلط الدوّامي لفترة وجيزة.
5. أحكم إغلاق اللوح بغطائه، واحتضنه في ظروف مثلى لتكوّن الأغشية الحيوية (مثلًا، عند 37°C لمدة 24 ساعة).
6. أجرِ التجربة بثلاثة مكررات لكل سلالة بكتيرية (ثلاث آبار لكل سلالة) لضمان الموثوقية.
7. خصّص ست آبار في كل لوح للشواهد السلبية. يمكن اختبار ما يصل إلى 30 سلالة في كل لوح ذي 96 بئرًا.

إظهار الأغشية الحيوية بصريًا وغسلها

1. بعد الاحتضان، تخلّص من الوسط بحذر لتجنّب الإخلال بالغشاء الحيوي.
2. اغسل كل بئر أربع مرات بمحلول ملحي فسيولوجي لإزالة البكتيريا العالقة.
3. افحص قاع الآبار بحثًا عن بقع بيضاء تدلّ على وجود غشاء حيوي.

فصل الأغشية الحيوية باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للألواح متعددة الآبار UIP400MTP

إعداد الجهاز والمعلمات:

• جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للألواح متعددة الآبار UIP400MTP
• إعدادات التشغيل: سعة اهتزاز بنسبة 60%، ونمط دورات يتضمن 60 ثانية تشغيل / 30 ثانية إيقاف

الخطوات:

1. ضع لوح المعايرة الدقيقة المغسول على منصة UIP400MTP.
2. عالج العينات بالموجات فوق الصوتية وفق الإعدادات الموصى بها (سعة اهتزاز بنسبة 60%، و60 ثانية تشغيل، و30 ثانية إيقاف). اضبط الإعدادات بما يتناسب مع السلالة البكتيرية.
3. ابدأ عملية المعالجة بالموجات فوق الصوتية لفصل الغشاء الحيوي. تعمل الموجات فوق الصوتية على تفكيك مصفوفة الغشاء الحيوي، مما يحرّر البكتيريا الملتصقة.
4. يضمن UIP400MTP تعرّضًا متجانسًا في جميع الآبار للحصول على نتائج فصل متسقة.

خطوة تحليلية: تحديد كمية الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية المفصولة للمكورات العنقودية باستخدام البنفسجي البلوري (CV)

المواد المطلوبة:

• محلول البنفسجي البلوري (CV) بتركيز 0.1%
• إيثانول بتركيز 95% أو حمض الأسيتيك بتركيز 30% (للإذابة)
• قارئ ألواح دقيقة قادر على القراءة عند 570 nm
• ألواح معايرة دقيقة معقمة للصبغ

الخطوات:

1. تحضير لوح الصبغ: انقل 100 µL من معلّق الغشاء الحيوي المفصول من كل بئر في اللوح المعالج بالموجات فوق الصوتية إلى الآبار المقابلة في لوح معايرة دقيقة نظيف ومعقم ذي 96 بئرًا. يضمن ذلك بيئة صافية ومتجانسة للصبغ.
2. صبغ الغشاء الحيوي المفصول: أضف 150 µL من محلول البنفسجي البلوري بتركيز 0.1% إلى كل بئر يحتوي على معلّق الغشاء الحيوي المفصول. امزج برفق باستخدام الماصة لضمان اختلاط معلّق الغشاء الحيوي والبنفسجي البلوري بالتساوي.
3. الاحتضان: اترك اللوح ليُحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لتمكين البنفسجي البلوري من صبغ الكتلة الحيوية بفعالية.
4. الغسل: بعد الاحتضان، تخلّص بحذر من محلول البنفسجي البلوري الموجود في الآبار دون الإخلال بالكتلة الحيوية. اغسل كل بئر ثلاث مرات بمحلول ملحي فسيولوجي معقم لإزالة الصبغة غير المرتبطة.
5. التجفيف: اترك اللوح ليجفّ في الهواء عند درجة حرارة الغرفة أو تحت غطاء ذي تدفق هواء معقم. تجنّب التسخين، إذ قد يؤدي إلى تغيير النتائج.
6. الإذابة: أضف 200 µL من الإيثانول بتركيز 95% (أو حمض الأسيتيك بتركيز 30%، حسب الممارسات المختبرية القياسية) إلى كل بئر لإذابة البنفسجي البلوري المرتبط. امزج برفق باستخدام الماصة أو برجّ اللوح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. القياس: قِس الكثافة الضوئية (OD) لمحلول البنفسجي البلوري المذاب عند 570 nm باستخدام قارئ ألواح دقيقة.
8. تحليل البيانات: اطرح متوسط قيمة OD570 للشواهد السلبية (الآبار التي تحتوي على TSB دون لقاح بكتيري) من قيم الآبار التجريبية لتصحيح أثر الصبغ الخلفي. سجّل البيانات وحلّلها.

ملاحظة: أجرِ التجربة بثلاثة مكررات لكل حالة لضمان قابلية تكرار النتائج. احرص على التعامل السليم مع البنفسجي البلوري والإيثانول، مع الالتزام ببروتوكولات السلامة والتخلص من النفايات.

أبرز مزايا UIP400MTP في لمحة:

• معالجة بمعدل مرتفع: مصمّم خصيصًا للألواح متعددة الآبار، مما يتيح لك معالجة عينات متعددة في وقت واحد.
• توزيع متجانس للموجات فوق الصوتية: يضمن شدة متساوية للموجات فوق الصوتية في الآبار، مما يوفّر نتائج متسقة لجميع العينات.
• استخدم أي لوح قياسي: يمكن لـ UIP400MTP معالجة أي ألواح قياسية متعددة الآبار، وأطباق بتري، وحوامل أنابيب. لا حاجة إلى ألواح خاصة مرتفعة التكلفة!
• واجهة سهلة الاستخدام: سهل الإعداد والتحكم، مما يجعله أداة ممتازة لزيادة إنتاجية المختبر. وتسهّل الإعدادات القابلة للبرمجة والأتمتة توحيد العمليات!