بروتوكول فحص الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC)
يعد اختبار الحد الأدنى للتركيز المثبط القائم على الأغشية الحيوية (MIC) طريقة أساسية لتقييم فعالية العوامل المضادة للميكروبات ضد الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بالغشاء الحيوي ، والتي تظهر مقاومة متزايدة بسبب مصفوفة الحماية خارج الخلية. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا الاختبار في تعطيل هياكل الأغشية الحيوية لإطلاق الخلايا المدمجة لتقييم دقيق للبقاء. يسهل جهاز الصوتنة متعدد الآبار UIP400MTP هذه العملية من خلال استخدام الموجات فوق الصوتية المركزة لتوليد التجويف المتحكم فيه ، وفصل خلايا الأغشية الحيوية بكفاءة وتشتيتها في تعليق موحد. يعزز هذا الاضطراب الدقيق والقابل للتكرار في الأغشية الحيوية موثوقية وإنتاجية فحوصات التصوير بالميكروفونات ، مما يجعل UIP400MTP أداة أساسية في تطوير أبحاث الأغشية الحيوية.
صوتنة لانفصال الأغشية الحيوية
يقيس اختبار MIC المستند إلى Biofilm عادة صلاحية البكتيريا أو تثبيط النمو باستخدام طرق مثل الطلاء أو عد المستعمرات أو قياسات الكثافة البصرية. يعد الصوتنة خطوة حاسمة في فحوصات MIC القائمة على الأغشية الحيوية عند تقييم قابلية الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بالغشاء الحيوي بمضادات الميكروبات. وتتمثل وظيفتها الأساسية في فصل وتشتيت الخلايا المضمنة في مصفوفة الأغشية الحيوية في تعليق موحد لتحليل دقيق.
تعتبر الأغشية الحيوية أكثر مقاومة للعوامل المضادة للميكروبات مقارنة بالخلايا العوالق ، مما يجعل الانفصال المناسب أمرا بالغ الأهمية للتحليل الدقيق. خلال هذه العملية ، تولد الموجات فوق الصوتية تجويفا خاضعا للرمح فيه ، مما يؤدي إلى تفكيك مصفوفة الأغشية الحيوية وإطلاق الخلايا المدمجة في تعليق موحد داخل وسط الاسترداد. تتيح هذه الخطوة إجراء تقييمات دقيقة للبقاء للخلايا المشتتة بالغشاء الحيوي من خلال طرق مثل الطلاء والتخفيف وعد المستعمرات. يمنع اضطراب الأغشية الحيوية السليم عن طريق الصوتنة مكونات المصفوفة المتبقية من حماية الخلايا ، مما قد يؤدي إلى التقليل من شأن النشاط المضاد للميكروبات. إن UIP400MTP صوتي الألواح متعدد الآبار مناسب بشكل خاص لهذا الغرض ، حيث يوفر ظروفا صوتنة دقيقة وقابلة للتكرار لضمان إعداد موثوق وعالي الإنتاجية لألواح الفحص.
UIP400MTP ميكروبليت سونيكاتير لانفصال الأغشية الحيوية التي يمكن التحكم فيها بدقة في فحوصات MIC و MBEC.
لماذا يعد الصوتنة ضروريا في فحوصات الحد الأدنى من تركيز التثبيط المستندة إلى Biofilm
لقياسات الجدوى وعد الخلايا ، يلزم انفصال وتشتت الخلايا المفردة بشكل كامل وموثوق. يعزز UIP400MTP انفصال الأغشية الحيوية المنتظم وغير الضار وتشتت الخلايا للحصول على نتائج فحص قوية.
- تعقيد الأغشية الحيوية: الأغشية الحيوية عبارة عن مجتمعات ميكروبية منظمة مغلفة بمصفوفة مادة بوليمرية خارج الخلية (EPS) ، والتي تحمي الكائنات الحية الدقيقة وتجعلها أكثر مقاومة للعوامل المضادة للميكروبات.
- تشتت موحد: لقياس صلاحية الخلايا المضمنة في الأغشية الحيوية بدقة أو قابليتها للإصابة بمضادات الميكروبات ، يجب أولا إزاحة الأغشية الحيوية وتقسيمها إلى معلق متجانس.
بروتوكول فحص الحد الأدنى للتركيز المثبط القائم على الأغشية الحيوية
يحدد اختبار الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) أدنى تركيز لعامل مضاد للميكروبات مطلوب لمنع النمو المرئي للكائنات الحية الدقيقة. تم تصميم هذا البروتوكول للكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بالغشاء الحيوي ، باستخدام UIP400MTP الصوتي متعدد الآبار لتعطيل الأغشية الحيوية.
الخطوة 1: تحضير اللقاح البكتيري
- تحضير المعلق البكتيري:
تنمو البكتيريا في الوسائط المناسبة إلى منتصف المرحلة اللوغاريتمية.
قم بتخفيف المزرعة لتحقيق كثافة خلية موحدة (على سبيل المثال ، معيار 0.5 McFarland أو OD600 ~ 0.1). - تحضير المحاليل المضادة للميكروبات:
قم بتخفيف العامل المضاد للميكروبات في وسط مناسب لإنشاء مجموعة من التركيزات (على سبيل المثال ، التخفيفات التسلسلية المزدوجة). - استغني عن لوحة 96well:
أضف المحاليل المضادة للميكروبات إلى آبار صفيحة قياسية مكونة من 96 بئرا ، بحجم بئر نهائي ~ 150-200 ميكرولتر.
تشمل ضوابط النمو (بدون مضادات الميكروبات) وضوابط العقم (بدون لقاح بكتيري).
الخطوة 2: تكوين الأغشية الحيوية على غطاء الوتد
- نعلق غطاء الوتد:
ضع غطاء الوتد المتخصص على الآبار الملقحة ، مع التأكد من غمر الأوتاد بالكامل في التعليق البكتيري. - احتضان اللوحة:
احتضان عند درجة الحرارة المناسبة (على سبيل المثال ، 37 درجة مئوية) لمدة محددة (على سبيل المثال ، 24 ساعة) في ظل ظروف ثابتة للسماح بتكوين الأغشية الحيوية على الأوتاد. - شطف الأوتاد:
قم بإزالة غطاء الوتد من المعلق البكتيري واشطفه برفق في محلول ملحي معقم أو PBS لإزالة الخلايا العوالق المرتبطة بشكل فضفاض. - التعرض لمضادات الميكروبات:
انقل غطاء الوتد إلى صفيحة 96 بئر جديدة تحتوي على التخفيفات المضادة للميكروبات المعدة مسبقا.
احتضان لفترة محددة (على سبيل المثال ، 24 ساعة) في ظل ظروف ثابتة للسماح للعامل المضاد للميكروبات بالعمل على الأغشية الحيوية.
الخطوة 3: التعرض لمضادات الميكروبات
صوتنة لوحة متعددة الآبار UIP400MTP لإعداد عينة عالية الإنتاجية
الخطوة 4: صوتنة مع Microplate Sonicator UIP400MTP
تعد خطوة الصوتنة أمرا بالغ الأهمية لفصل الأغشية الحيوية عن أغطية الوتد لتقييم الجدوى. اتبع هذه الخطوات لجهاز الصوتنة UIP400MTP:
- قم بإعداد الإعداد:
املأ طبقا جديدا من 96 بئرا بوسط استرداد (على سبيل المثال ، مرق معادلة أو وسط نمو معقم) في كل بئر. - انقل غطاء الوتد:
قم بإزالة غطاء الوتد من لوحة المعالجة المضادة للميكروبات.
اشطف غطاء الوتد بمحلول ملحي معقم أو PBS لإزالة العوامل المضادة للميكروبات المتبقية. - ضع اللوحة في الصوت:
قم بتوصيل غطاء الوتد بلوحة وسيطة الاسترداد.
ضع لوحة متوسط الاسترداد في جهاز الصوتنة UIP400MTP ، مع التأكد من أن اللوحة تجلس في المنتصف ومستقرة كما هو موضح في الدليل الموصوف. - ضبط معلمات الصوتنة:
تعيين معلمات صوتنة في UIP400MTP (يمكن ضبط الإعدادات على الأغشية الحيوية):
السعة: 70-100٪.
وقت صوتنة: 1-3 دقائق (ضبط بناء على بنية الأغشية الحيوية) في وضع الدورة. - سونيكيت:
ابدأ عملية الصوتنة. ستؤدي الموجات فوق الصوتية إلى تعطيل مصفوفة الأغشية الحيوية وإزاحة الخلايا في وسط الاسترداد. - مراقبة العملية:
استخدم مستشعر درجة الحرارة القابل للتوصيل لمراقبة درجة حرارة العينة في الآبار. يمكن توصيل UIP400MTP بمبرد المختبر للتبريد. - معالجة ما بعد الصوت:
انقل وسط الاسترداد الذي يحتوي على أغشية حيوية منفصلة على الفور إلى صفيحة معقمة جديدة لتحليلها لاحقا.
(أ) صفيحة تحتوي على TSB مع 2٪ جلوكوز تستخدم لتكوين الأغشية الحيوية واستعادة الخلايا وتحديد MIC و MBEC ؛ (ب) غطاء مع دبابيس لتكوين الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية.
تم إزاحة خلايا الأغشية الحيوية المتكونة على المسامير عن طريق الصوتنة (تقنية الموجات فوق الصوتية Hielscher) لمدة 5 دقائق في 96 لوحة بئر تحتوي على وسط ثقافة طازج لاستعادة الخلايا.
(صورة ودراسة: ©دي أوليفيرا وآخرون ، 2016)
الخطوة 4: تقييم الجدوى
الأغشية الحيوية المنفصلة عن اللوحة والثقافة:
- قم بإجراء عمليات تخفيف تسلسلية لوسط الاسترداد واللوحة على أجار لتعداد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU).
- تقييم MIC:
حدد MIC باعتباره أقل تركيز مضاد للميكروبات يمنع تماما نمو الميكروبات المرئي في وسط الاسترداد.
الحد الأدنى من التركيز المثبط للميكروفوني: مثال على لوحة الميكروتيتر وتفسير نتائج التخفيف الدقيق.
(الدراسة والصورة: ©Jaskiewicz et al. 2019)
التصميم والتصنيع والاستشارات – جودة صنع في ألمانيا
تشتهر أجهزة الموجات فوق الصوتية Hielscher بأعلى معايير الجودة والتصميم. تسمح المتانة والتشغيل السهل بالتكامل السلس لأجهزة الموجات فوق الصوتية الخاصة بنا في المنشآت الصناعية. يتم التعامل مع الظروف القاسية والبيئات الصعبة بسهولة بواسطة أجهزة الصوتنة Hielscher.
Hielscher Ultrasonics هي شركة حاصلة على شهادة الأيزو وتركز بشكل خاص على الموجات فوق الصوتية عالية الأداء التي تتميز بأحدث التقنيات وسهولة الاستخدام. بطبيعة الحال، الموجات فوق الصوتية Hielscher هي CE المتوافقة وتلبية متطلبات UL، وكالة الفضاء الكندية وبنفايات.
تبسيط تحضير العينة في ألواح 96 بئرا وألواح فحص باستخدام UIP400MTP الصوتي متعدد الآبار
الأدب / المراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
أسئلة مكررة
ما هو اختبار الميكروفوني؟
اختبار الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) هو اختبار موحد يستخدم لتحديد أدنى تركيز لعامل مضاد للميكروبات مطلوب لتثبيط النمو المرئي للكائن الحي الدقيق. يتم إجراؤه بشكل شائع باستخدام طرق التخفيف الدقيق للمرق أو تخفيف أجار ، حيث تتعرض الكائنات الحية الدقيقة للتخفيفات التسلسلية للعامل المضاد للميكروبات. تعد فحوصات MIC ضرورية لتقييم فعالية مضادات الميكروبات ، وتوجيه العلاج السريري ، وتقييم مستويات المقاومة في كل من الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بالعوالق والأغشية الحيوية.
ما هو الفرق بين مقايسة الحد الأدنى للتركيز المثبط المستند إلى الأغشية الحيوية ومقايسة MBIC؟
يرتبط مقايسة الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) المستند إلى الأغشية الحيوية ومقايسة الحد الأدنى للتركيز المثبط للأغشية الحيوية (MBIC) ولكنهما متميزان في الغرض والمنهجية.
يقيم اختبار MIC القائم على الأغشية الحيوية أقل تركيز لعامل مضاد للميكروبات اللازم لتثبيط نمو الأغشية الحيوية المرئية أو قابليتها للبقاء ، مع التركيز على الخلايا المرتبطة بالغشاء الحيوي بدلا من البكتيريا العوالق. في المقابل ، يقيس اختبار MBIC على وجه التحديد قدرة عامل مضاد للميكروبات على منع تكوين الأغشية الحيوية ، بدلا من معالجة الأغشية الحيوية مسبقة التكوين. بينما يتعامل كلا المقايسين مع البكتيريا المرتبطة بالغشاء الحيوي ، فإن اختبار MIC القائم على الأغشية الحيوية يعالج العلاج ، ويؤكد اختبار MBIC على الوقاية ، مما يجعلهما أدوات تكميلية لدراسة فعالية مضادات الميكروبات ضد الأغشية الحيوية.
ما هي الأغشية الحيوية المستخدمة في فحوصات الميكروفوني؟
تستخدم كل من الأغشية الحيوية الميكروبية والخلايا العوالق في فحوصات الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) لدراسة فعالية مضادات الميكروبات في ظل ظروف مختلفة.
- الخلايا العوالق:
الخلايا العوالق هي خلايا ميكروبية مفردة عائمة بحرية تعمل كنموذج قياسي لمقايسات MIC التقليدية. تشمل الكائنات الحية الدقيقة الشائعة الإشريكية القولونية ، والزائفة الزنجارية ، والمكورات العنقودية الذهبية ، والمبيضات البيض. تحدد هذه المقايسات MIC المطلوب لتثبيط نمو الخلايا الحية الحرة وهي ضرورية للفحص الأولي لمضادات الميكروبات. - الخلايا المرتبطة بالأغشية الحيوية:
خلايا الأغشية الحيوية هي كائنات دقيقة مدمجة في مصفوفة خارج الخلية ، مما يزيد بشكل كبير من مقاومتها لمضادات الميكروبات. غالبا ما تتضمن فحوصات Biofilm MIC ما يلي:- البكتيريا سالبة الجرام: الإشريكية القولونية ، الزائفة الزنجارية ، و Klebsiella pneumoniae ، المعروفة بتكوين الأغشية الحيوية في الالتهابات والبيئات الصناعية.
- البكتيريا إيجابية الجرام: المكورات العنقودية الذهبية (بما في ذلك MRSA) ، والمكورات العنقودية البشروية ، والمكورات المعوية البرازية ، والتي تتورط عادة في الالتهابات المرتبطة بالجهاز.
- الفطريات: المبيضات البيضاء والأنواع ذات الصلة ، وهي مهمة في الالتهابات الفطرية المرتبطة بالأغشية الحيوية.
- الأغشية الحيوية ذات الأنواع المختلطة: تستخدم أحيانا لتكرار الأغشية الحيوية الطبيعية متعددة الميكروبات ، مثل تلك الموجودة في الجروح المزمنة أو الحشف الحيوي الصناعي.
من خلال مقارنة قيم الميكروفون للخلايا العوالق والخلايا المرتبطة بالغشاء الحيوي ، يمكن للباحثين تقييم المقاومة المعززة للأغشية الحيوية وتحديد العوامل الفعالة ضد هذه المجتمعات الميكروبية الأكثر مرونة.
ما هو الفرق بين MIC و MBEC؟
الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) هو أدنى تركيز لعامل مضاد للميكروبات مطلوب لمنع تكوين الأغشية الحيوية ، في حين أن الحد الأدنى لتركيز استئصال الأغشية الحيوية (MBEC) هو أدنى تركيز مطلوب للقضاء على الأغشية الحيوية الراسخة. يركز MIC على الوقاية من الأغشية الحيوية ، بينما يقوم MBEC بتقييم فعالية العلاج ضد الأغشية الحيوية الناضجة.
ما هي اللوحات التي يشيع استخدامها في فحوصات MBEC؟
عادة ما تكون ألواح الميكروتيتر المستخدمة بشكل شائع في فحوصات MBEC عبارة عن ألواح مكونة من 96 بئرا مصنوعة من البوليسترين أو البولي بروبيلين. توفر هذه المواد سطحا مناسبا لتكوين الأغشية الحيوية وهي مقاومة كيميائيا للعوامل المضادة للميكروبات التي تم اختبارها أثناء الفحص. تفضل ألواح البوليسترين على نطاق واسع بسبب وضوحها البصري ، وهو أمر مفيد للتحليلات النهائية مثل القياسات الطيفية الضوئية أو القياسات القائمة على الفلورة. يشتمل تصميم هذه الألواح على أغطية ربط قابلة للفصل ، وهي ضرورية للفحص حيث تتشكل الأغشية الحيوية على الأوتاد المغمورة في الآبار التي تحتوي على وسائط النمو. تم تصميم اللوحات القياسية ، مثل تلك المتوافقة مع بروتوكول فحص MBEC ، خصيصا لضمان قابلية التكرار والتوافق مع مكبر الصوت UIP400MTP أو معدات المعالجة الأخرى.
ما هي لوحات غطاء PEG؟
ألواح غطاء PEG هي أنظمة ألواح متخصصة متعددة الآبار حيث يتم تجهيز الغطاء بأوتاد أو دبابيس صغيرة من البولي إيثيلين جلايكول (PEG) تمتد إلى كل بئر. توفر هذه الأوتاد سطحا لتكوين الأغشية الحيوية الميكروبية في ظل ظروف خاضعة للرقابة ، مما يحاكي نمو الأغشية الحيوية في العالم الحقيقي. يسمح التصميم للأغشية الحيوية بالتطور على الأوتاد بينما تحتوي الآبار على وسائط نمو أو عوامل مضادة للميكروبات ، مما يتيح اختبار عالي الإنتاجية لقابلية الأغشية الحيوية للعلاجات ، كما هو الحال في فحوصات MBEC و MBIC و MIC.
ما هي ميزة إزاحة الأغشية الحيوية بالموجات فوق الصوتية مقارنة بكشط الخلية؟
يوفر إزاحة الأغشية الحيوية بالموجات فوق الصوتية ميزة كبيرة على كشط الخلايا من خلال توفير طريقة غير جراحية وموحدة وعالية الكفاءة لإزالة الأغشية الحيوية من الأسطح. على عكس الكشط ، الذي يمكن أن يكون غير متسق ويتلف السطح أو الخلايا الأساسية ، تخترق الموجات فوق الصوتية مصفوفة الأغشية الحيوية ، وتتفككها دون المساس بسلامة الهياكل المجاورة. تضمن هذه الطريقة قابلية التكاثر ، وتقلل من مخاطر التلوث ، وهي فعالة بشكل خاص للتطبيقات التي تتطلب إزالة دقيقة للأغشية الحيوية ، كما هو الحال في الدراسات الميكروبيولوجية أو اختبار الأجهزة الطبية. اقرأ المزيد كيف يتفوق UIP400MTP Sonicator على كشط الخلايا!
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع الخالط بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء من المختبر ل الحجم الصناعي.