بروتوكول فحص MBEC باستخدام UIP400MTP Plate Sonicator المكون من 96 بئرا

يستخدم اختبار MBEC لتحديد تركيز العوامل المضادة للميكروبات اللازمة للتخلص من الأغشية الحيوية المتكونة على أغطية الوتد. لتقييم صلاحية الأغشية الحيوية ، يجب أولا فصل الأغشية الحيوية عن أغطية الوتد للوحة 96 بئرا. صوتنة هي الطريقة الأكثر موثوقية وفعالية لهذا الانفصال. تم تصميم UIP400MTP الصوتنة متعدد الآبار خصيصا لمعالجة لوحات الفحص بأقصى قدر من الكفاءة والراحة ، وتبسيط وتسريع فحوصات MBEC عالية الإنتاجية.

صوتنة لانفصال الأغشية الحيوية

يعد الصوتنة خطوة حاسمة في فحوصات الحد الأدنى من تركيز استئصال الأغشية الحيوية (MBEC) ، مما يتيح الإزاحة الفعالة لخلايا الأغشية الحيوية من ارتباطها السطحي. الأغشية الحيوية هي مجتمعات منظمة بطبيعتها من الكائنات الحية الدقيقة المغلفة في مصفوفة خارج الخلية ، مما يجعلها أكثر مقاومة للعوامل المضادة للميكروبات مقارنة بالخلايا العوالق. خلال فحوصات MBEC ، تستخدم الصوتنة الموجات فوق الصوتية لتوليد التجويف المتحكم فيه ، مما يؤدي إلى تعطيل مصفوفة الأغشية الحيوية وإطلاق الخلايا المدمجة في نظام تعليق. تضمن هذه الخطوة أن خلايا الأغشية الحيوية مشتتة بالتساوي في وسط الاسترداد ، مما يسهل تقييمات دقيقة للجدوى من خلال طرق الطلاء أو التخفيف أو القياس الطيفي. بدون انفصال الأغشية الحيوية المناسب ، يمكن لمكونات المصفوفة المتبقية أن تحمي الخلايا ، مما يؤدي إلى التقليل من فعالية مضادات الميكروبات. لذلك ، فإن الصوتنة لا غنى عنها للحصول على قيم MBEC موثوقة وقابلة للتكرار ، مما يعكس إمكانات الاستئصال الحقيقية للعوامل المختبرة. يسمح UIP400MTP الصوتي متعدد الآبار بإعداد عينة سهلة عالية الإنتاجية في لوحات الفحص.

بروتوكول فحص الحد الأدنى لتركيز استئصال الأغشية الحيوية (MBEC)

الخطوة 1: تكوين الأغشية الحيوية

1. تحضير المعلق البكتيري:
   تنمو البكتيريا في الوسائط المناسبة لتسجيل النمو.
   تمييع الثقافة البكتيرية إلى كثافة بصرية محددة (على سبيل المثال ، OD600 ~ 0.1).
2. تلقيح اللوحة المكونة من 96 بئرا:
   أضف المعلق البكتيري (على سبيل المثال ، 150-200 ميكرولتر) في كل بئر من صفيحة ميكروتيتر قياسية مكونة من 96 بئرا.
3. نعلق غطاء الوتد:
   ضع غطاء الوتد على اللوحة الملقحة للسماح بتكوين الأغشية الحيوية على أسطح الوتد.
4. احتضان اللوحة:
   احتضان الإعداد عند درجة حرارة مناسبة (على سبيل المثال ، 37 درجة مئوية) لمدة 24-48 ساعة دون اهتزاز لتعزيز نمو الأغشية الحيوية.

الخطوة 2: العلاج بالعوامل المضادة للميكروبات

• تحضير المحاليل المضادة للميكروبات:
  تحضير مجموعة من تركيزات مضادات الميكروبات في وسائط جديدة.
  تعريض الأغشية الحيوية للعوامل المضادة للميكروبات:
  قم بإزالة غطاء الوتد من المزرعة البكتيرية واشطفه بمحلول ملحي معقم أو PBS لإزالة الخلايا العوالق.
  ضع غطاء الوتد في صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا تحتوي على المحاليل المضادة للميكروبات.
• احتضان اللوحة:
  احتضان لفترة محددة (على سبيل المثال ، 24 ساعة) للسماح بالتعرض لمضادات الميكروبات.

الخطوة 3: صوتنة مع 96 بئر لوحة سونيكاتور UIP400MTP

تعد خطوة الصوتنة أمرا بالغ الأهمية لفصل الأغشية الحيوية عن أغطية الوتد لتقييم الجدوى. اتبع هذه الخطوات لجهاز الصوتنة UIP400MTP:

1. قم بإعداد الإعداد:
   املأ طبقا جديدا من 96 بئرا بوسط استرداد (على سبيل المثال ، مرق تحييد أو وسط نمو طازج) في كل بئر.
2. انقل غطاء الوتد:
   قم بإزالة غطاء الوتد من لوحة المعالجة المضادة للميكروبات.
   اشطف غطاء الوتد بمحلول ملحي معقم أو PBS لإزالة العوامل المضادة للميكروبات المتبقية.
3. ضع اللوحة والصوت:
   قم بتوصيل غطاء الوتد بلوحة وسيطة الاسترداد.
   ضع لوحة وسط الاسترداد على منصة الصوتنة UIP400MTP ، مما يضمن أن اللوحة في المنتصف ومستقرة.
4. ضبط معلمات الصوتنة:
   قم بتعيين معلمات الصوتنة في UIP400MTP (يمكن ضبط الإعدادات على الأغشية الحيوية):
   السعة: 70-100٪.
   وقت الصوت: 1-3 دقائق (اضبط بناء على متانة الأغشية الحيوية) في وضع الدورة.
5. سونيكيت:
   ابدأ عملية الصوتنة. سيؤدي الاهتزاز بالموجات فوق الصوتية إلى إزاحة الأغشية الحيوية من أسطح الوتد إلى وسط الاسترداد.
6. مراقبة العملية:
   استخدم مستشعر درجة الحرارة القابل للتوصيل لمراقبة درجة حرارة العينة في الآبار. يمكن توصيل UIP400MTP بمبرد المختبر للتبريد.
7. معالجة ما بعد الصوت:
   انقل وسط الاسترداد على الفور (الذي يحتوي الآن على أغشية حيوية منفصلة) إلى صفيحة معقمة جديدة لتحليلها في اتجاه المصب.

(أ) صفيحة تحتوي على TSB مع 2٪ جلوكوز يستخدم لتكوين الأغشية الحيوية ، واستعادة الخلايا ، و
تحديد MIC و MBCB ؛ (ب) غطاء مع دبابيس لتكوين الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية. تحديد MIC و MBCB ؛ (ب) غطاء مع دبابيس لتكوين الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية.
تم إزاحة خلايا الأغشية الحيوية المتكونة على المسامير عن طريق الصوتنة (تقنية الموجات فوق الصوتية Hielscher) لمدة 5 دقائق في 96 لوحة بئر تحتوي على وسط ثقافة طازج لاستعادة الخلايا.
(صورة ودراسة: ©دي أوليفيرا وآخرون ، 2016)

الخطوة 4: تقييم الجدوى

الأغشية الحيوية المنفصلة عن اللوحة والثقافة:

1. قم بإجراء عمليات تخفيف تسلسلية لوسط الاسترداد واللوحة على أجار لتعداد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU).
   بدلا من ذلك ، استخدم مقايسة الجدوى اللونية أو القائمة على الفلورة.
2. سجل النتائج:
   تحديد MBEC باعتباره أقل تركيز لمضادات الميكروبات التي قضت على قابلية الأغشية الحيوية التي يمكن اكتشافها.

التصميم والتصنيع والاستشارات – جودة صنع في ألمانيا

تشتهر أجهزة الموجات فوق الصوتية Hielscher بأعلى معايير الجودة والتصميم. تسمح المتانة والتشغيل السهل بالتكامل السلس لأجهزة الموجات فوق الصوتية الخاصة بنا في المنشآت الصناعية. يتم التعامل مع الظروف القاسية والبيئات الصعبة بسهولة بواسطة أجهزة الصوتنة Hielscher.

Hielscher Ultrasonics هي شركة حاصلة على شهادة الأيزو وتركز بشكل خاص على الموجات فوق الصوتية عالية الأداء التي تتميز بأحدث التقنيات وسهولة الاستخدام. بطبيعة الحال، الموجات فوق الصوتية Hielscher هي CE المتوافقة وتلبية متطلبات UL، وكالة الفضاء الكندية وبنفايات.

اقرأ هنا كيف يتم استخدام UIP400MTP لفصل الأغشية الحيوية كخطوة لتحضير العينة خلال بروتوكول ASTM E2799 لاختبار فعالية المطهر ضد الأغشية الحيوية الزائفة الزنجارية باستخدام مقايسة MBEC.