بروتوكول اختبار MBEC باستخدام جهاز معالجة الصفائح ذات 96 بئرًا بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP

يُستخدم اختبار MBEC لتحديد تركيز العوامل المضادة للميكروبات اللازم للقضاء على الأغشية الحيوية المتشكلة على الأغطية المزودة بأوتاد. ولتقييم حيوية الأغشية الحيوية، يجب أولًا فصلها عن الأغطية المزودة بأوتاد لصفائح ذات 96 بئرًا. وتُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية الطريقة الأكثر موثوقية وكفاءة لتحقيق هذا الفصل. وقد صُمم جهاز معالجة الصفائح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP خصيصًا لمعالجة صفائح الاختبار بأقصى قدر من الكفاءة وسهولة الاستخدام، مما يبسّط اختبارات MBEC ذات المعدل المرتفع لمعالجة العينات ويسرّعها.

المعالجة بالموجات فوق الصوتية لفصل الأغشية الحيوية

تُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية خطوة أساسية في اختبارات التركيز الأدنى للقضاء على الأغشية الحيوية (MBEC)، إذ تتيح فصل خلايا الأغشية الحيوية بفاعلية عن الأسطح التي تلتصق بها. والأغشية الحيوية بطبيعتها تجمعات منظمة من الكائنات الحية الدقيقة محاطة بمصفوفة خارج خلوية، مما يجعلها أكثر مقاومة بكثير للعوامل المضادة للميكروبات مقارنةً بالخلايا العالقة. وخلال اختبارات MBEC، تستخدم المعالجة بالموجات فوق الصوتية موجات فوق صوتية لتوليد تجويف مضبوط، مما يفكك مصفوفة الغشاء الحيوي ويحرر الخلايا المحتجزة فيها إلى مُعلَّق. وتضمن هذه الخطوة توزيع خلايا الغشاء الحيوي بالتساوي في وسط استعادة الخلايا، مما يسهّل إجراء تقييمات دقيقة للحيوية باستخدام الزرع على الصفائح أو التخفيف أو طرق القياس الطيفي الضوئي. ومن دون فصل الأغشية الحيوية بصورة سليمة، قد تحمي مكونات المصفوفة المتبقية الخلايا، مما يؤدي إلى تقدير فاعلية مضادات الميكروبات بأقل من قيمتها الفعلية. ولذلك، تُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية ضرورية للحصول على قيم MBEC موثوقة وقابلة للتكرار، تعكس القدرة الحقيقية للعوامل المختبرة على القضاء على الأغشية الحيوية. ويتيح جهاز معالجة الصفائح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP تحضير العينات بسهولة وبمعدل معالجة مرتفع في صفائح الاختبار.

بروتوكول اختبار التركيز الأدنى للقضاء على الأغشية الحيوية (MBEC)

الخطوة 1: تكوين الأغشية الحيوية

1. تحضير المُعلَّق البكتيري:
   نمِّ البكتيريا في أوساط مناسبة حتى تصل إلى طور النمو اللوغاريتمي.
   خفّف المزرعة البكتيرية إلى كثافة ضوئية محددة (مثلًا، OD600 ~0.1).
2. تلقيح الصفيحة ذات 96 بئرًا:
   أضف المُعلَّق البكتيري (مثلًا، 150–200 µL) إلى كل بئر من صفيحة معايرة دقيقة قياسية ذات 96 بئرًا.
3. تركيب الغطاء المزود بأوتاد:
   ضع الغطاء المزود بأوتاد على الصفيحة الملقحة للسماح بتكوين الأغشية الحيوية على أسطح الأوتاد.
4. تحضين الصفيحة:
   حضّن المجموعة عند درجة حرارة مناسبة (مثلًا، 37°C) لمدة 24–48 ساعة من دون رجّ لتعزيز نمو الأغشية الحيوية.

الخطوة 2: المعالجة بالعوامل المضادة للميكروبات

• تحضير محاليل مضادات الميكروبات:
  حضّر مجموعة من تراكيز مضادات الميكروبات في أوساط جديدة.
  تعريض الأغشية الحيوية للعوامل المضادة للميكروبات:
  أزل الغطاء المزود بأوتاد من المزرعة البكتيرية واشطفه بمحلول ملحي معقم أو PBS لإزالة الخلايا العالقة.
  ضع الغطاء المزود بأوتاد في صفيحة جديدة ذات 96 بئرًا تحتوي على محاليل مضادات الميكروبات.
• تحضين الصفيحة:
  حضّن لمدة محددة (مثلًا، 24 ساعة) للسماح بالتعرض لمضادات الميكروبات.

الخطوة 3: المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز معالجة الصفائح ذات 96 بئرًا بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP

تُعد خطوة المعالجة بالموجات فوق الصوتية حاسمة لفصل الأغشية الحيوية عن الأغطية المزودة بأوتاد لتقييم حيويتها. اتبع الخطوات التالية عند استخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP:

1. تحضير المجموعة:
   املأ كل بئر في صفيحة جديدة ذات 96 بئرًا بوسط استعادة الخلايا (مثلًا، مرق مُعادِل أو وسط نمو جديد).
2. نقل الغطاء المزود بأوتاد:
   أزل الغطاء المزود بأوتاد من صفيحة المعالجة بمضادات الميكروبات.
   اشطف الغطاء المزود بأوتاد بمحلول ملحي معقم أو PBS لإزالة بقايا العوامل المضادة للميكروبات.
3. وضع الصفيحة وجهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية:
   ركّب الغطاء المزود بأوتاد على صفيحة وسط استعادة الخلايا.
   ضع صفيحة وسط استعادة الخلايا على منصة جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP، مع التأكد من تمركز الصفيحة وثباتها.
4. ضبط معلمات المعالجة بالموجات فوق الصوتية:
   اضبط معلمات المعالجة بالموجات فوق الصوتية على جهاز UIP400MTP (يمكن تعديل الإعدادات بما يلائم الغشاء الحيوي):
   السعة: 70–100%.
   مدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية: 1–3 دقائق (تُعدَّل وفقًا لمتانة الغشاء الحيوي) في وضع الدورات.
5. المعالجة بالموجات فوق الصوتية:
   ابدأ عملية المعالجة بالموجات فوق الصوتية. ستفصل الاهتزازات فوق الصوتية الأغشية الحيوية عن أسطح الأوتاد وتنقلها إلى وسط استعادة الخلايا.
6. مراقبة العملية:
   استخدم مستشعر درجة الحرارة القابل للتوصيل لمراقبة درجة حرارة العينات في الآبار. ويمكن توصيل جهاز UIP400MTP بمبرّد مختبري للتبريد.
7. التعامل بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية:
   انقل فورًا وسط استعادة الخلايا (الذي يحتوي الآن على الأغشية الحيوية المفصولة) إلى صفيحة جديدة معقمة لإجراء التحليلات اللاحقة.

(A) صفيحة تحتوي على TSB مع 2% من الغلوكوز، تُستخدم لتكوين الأغشية الحيوية واستعادة الخلايا و
تحديد MIC وMBCB؛ (B) غطاء مزود بدبابيس لتكوين أغشية حيوية للمكورات العنقودية. تحديد MIC وMBCB؛ (B) غطاء مزود بدبابيس لتكوين أغشية حيوية للمكورات العنقودية.
فُصلت خلايا الأغشية الحيوية المتشكلة على الدبابيس بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية (تقنية الموجات فوق الصوتية من Hielscher) لمدة 5 min في صفائح ذات 96 بئرًا تحتوي على وسط زرع جديد لاستعادة الخلايا.
(الصورة والدراسة: ©de Oliveira et al., 2016)

الخطوة 4: تقييم الحيوية

زرع الأغشية الحيوية المفصولة على الصفائح وتنميتها:

1. أجرِ تخفيفات متسلسلة لوسط استعادة الخلايا وازرعها على الآغار لتعداد الوحدات المكوِّنة للمستعمرات (CFU).
   وبدلًا من ذلك، استخدم اختبارًا للحيوية يعتمد على القياس اللوني أو التألق.
2. تسجيل النتائج:
   حدّد MBEC بوصفه أدنى تركيز من مضاد الميكروبات قضى على حيوية الغشاء الحيوي القابلة للكشف.

التصميم والتصنيع والاستشارات – جودة صُنعت في ألمانيا

تشتهر أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher بأعلى معايير الجودة والتصميم. وتتيح المتانة وسهولة التشغيل دمج أجهزتنا للمعالجة بالموجات فوق الصوتية بسلاسة في المنشآت الصناعية. وتتعامل أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher بسهولة مع الظروف القاسية والبيئات الصعبة.

Hielscher Ultrasonics شركة حاصلة على شهادة ISO، وتولي اهتمامًا خاصًا بأجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء التي تتميز بأحدث التقنيات وسهولة الاستخدام. وبالطبع، تتوافق أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher مع CE وتلبي متطلبات UL وCSA وRoHs.

اقرأ هنا كيف يُستخدم UIP400MTP لفصل الأغشية الحيوية بوصفه خطوة لتحضير العينات ضمن بروتوكول ASTM E2799 لاختبار فاعلية المطهرات ضد الغشاء الحيوي لبكتيريا Pseudomonas aeruginosa باستخدام اختبار MBEC.