UIP400MTP mikroplastinka sonikatori yordamida amiloid fibrillalar hosil qilish

Amiloid fibrillalar, kristallarga oʻxshab, yadrolanish va undan keyingi oʻsish jarayoni orqali hosil boʻladi. Biroq yadrolanishning erkin energiya toʻsigʻi yuqori boʻlgani sababli amiloid fibrillalarning oʻz-oʻzidan hosil boʻlishi faqat uzoq davom etadigan kechikish fazasidan keyin yuz beradi. Ultratovush bilan ishlov berish amiloid yadrolanishini qoʻzgʻatishning kuchli vositasi sifatida namoyon boʻldi va shu orqali fibrillalar hosil boʻlishini sezilarli darajada tezlashtiradi. Tioflavin T (ThT) fluoressensiyasidan foydalanadigan mikroplastinka oʻquvchi qurilma bilan birlashtirilganda, ultratovush bilan ishlov berish bir vaqtning oʻzida koʻplab namunalarda amiloid fibrillalarni yuqori unumdorlikda aniqlash imkonini beradi.

UIP400MTP mikroplastinka sonikatori bilan ultratovush taʼsirida amiloid fibrillalar hosil qilish

UIP400MTP koʻp chuqurchali plastinka sonikatori bilan tadqiqot maqsadlari uchun bir xil sifatdagi amiloid fibrillalarni katta miqdorda tez sintez qilish mumkin. Bu samarali yondashuv oqsillarning amiloid hosil qilish qobiliyatini oʻrganish imkonini beradi. Ushbu usul amiloid fibrillalarning tez va takrorlanuvchan hosil boʻlishini osonlashtiradi; bu dializ bilan bogʻliq amiloidozga aloqador amiloid hosil qiluvchi oqsil – β2-mikroglobulin (β2-m) misolida koʻrsatilgan.

Oddiy tajriba yondashuvi: ultratovush taʼsirida amiloid fibrillalar hosil qilish

Fibrillalar hosil boʻlishini qoʻzgʻatish uchun 96 chuqurchali mikroplastinka UIP400MTP koʻp chuqurchali plastinka sonikatorining markaziga joylashtirildi; bu barcha chuqurchalarda ultratovushning bir tekis taʼsirini taʼminlaydi. Tajriba sharoitlari quyidagicha edi:

Har bir chuqurchada 5 μM ThT qoʻshilgan 0,2 ml β2-mikroglobulin eritmasi (0,3 mg/ml, pH 2,5) mavjud edi.
Plastinkaga ultratovush bilan ishlov berish sikllari qoʻllanildi, masalan, 1 daqiqa ultratovush bilan ishlov berilgandan soʻng 9 daqiqa tanaffus qilindi.
Ultratovush bilan ishlov berilgandan keyin ThT fluoressensiyasi mikroplastinka oʻquvchi qurilma yordamida oʻlchandi.

(qarang: So et al., 2011)

Hielscher UIP400MTP ko‘p chuqurchali planshetlar, PCR planshetlari yoki namuna probirkalari uchun eng moslashuvchan sonikatordir. 400 vatt uzluksiz ultratovush quvvatiga ega ushbu qurilma hujayralarni lizis qilish, emulsiyalash, oqsillarni ekstraksiya qilish, DNA / RNA ni fragmentlash, aglomeratlarni parchalash, FFPE ekstraksiyasi, hujayralar va bioplyonkalarni sirtdan ajratish yoki emulsiyalash kabi vazifalar uchun mo‘ljallangan. UIP400MTP ultratovush vannasi emas. U yo‘naltirilgan ultratovush bilan ishlov berish uchun yuqori intensivlikdagi kosasimon sonotroddir. Ushbu kuchli kontaktsiz sonikator standart planshetning barcha chuqurchalariga bir xil ultratovush ta’sirini ta’minlaydi. Amplituda, quvvat va impuls rejimini aniq boshqarishingiz mumkin. O‘rnatilgan taymer va harorat zondi natijalarning takrorlanuvchanligini ta’minlaydi. UIP400MTP planshet sonikatori namunalarni suv vannasi yordamida sovitadi (tashqi sovitkich ixtiyoriy).

Anʼanaviy aralashtirish bilan taqqoslash

Anʼanaviy aralashtirish usullari bilan taqqoslaganda, ultratovush bilan ishlov berish fibrillalar hosil boʻlishining kechikish fazasini keskin qisqartirdi. Mikroplastinkani odatiy silkitish sharoitlarida 20 soatdan keyin 10 ta chuqurchadan faqat 1 tasida ThT fluoressensiyasining oshishi kuzatildi. Aksincha, siklli ultratovush bilan ishlov berish qoʻllanilganda (15 daqiqa ultratovush bilan ishlov berishdan soʻng 5 daqiqa tinch holatda saqlash), birinchi ultratovush bilan ishlov berishdan darhol keyin ThT fluoressensiyasining sezilarli oshishi aniqlandi.

Fibrillalar hosil boʻlish kinetikasining keskin tezlashishi

So et al. (2011) tomonidan olingan natijalar pH 2,5 da β2-mikroglobulin fibrillalarining oʻz-oʻzidan hosil boʻlishini ultratovush bilan ishlov berish orqali bir necha soatdan atigi 10–15 daqiqagacha tezlashtirish mumkinligini koʻrsatdi.
Atom-kuch mikroskopiyasi (AFM) tasvirlari har 15 daqiqada 10 daqiqa ultratovush bilan ishlov berish orqali hosil qilingan fibrillalarni har 10 daqiqada 1 daqiqa ultratovush bilan ishlov berish orqali hosil qilingan fibrillalardan morfologik jihatdan ajratib boʻlmasligini tasdiqladi. Bu ultratovush taʼsirida amiloid fibrillalar hosil boʻlishining takrorlanuvchanligi va barqarorligini koʻrsatadi.

UIP400MTP koʻp chuqurchali plastinka sonikatori ultratovush yordamida yadrolanish orqali amiloid fibrillalar hosil boʻlishini tezlashtiradi

Har 10 min da 1 min ultratovush bilan ishlov berish (i), har 15 min da 10 min ultratovush bilan ishlov berish (ii) va ultratovush bilan ishlov bermasdan urugʻlash reaksiyasi (iii) orqali hosil qilingan amiloid fibrillalarning AFM tasvirlari. Oq masshtab chizigʻi 1 μm ni bildiradi.
Tadqiqot va tasvirlar: ©So et al., 2011

Neytral pH sharoitida fibrillalar hosil boʻlishi

Hatto neytral pH sharoitida ham 1,5 soatlik kechikish vaqtidan keyin fibrillalar hosil boʻlishiga erishildi; bu ultratovush bilan ishlov berish yadrolanish va oʻsishning energetik toʻsigʻini sezilarli darajada pasaytirishini koʻrsatadi. Bu amiloid fibrillalar hosil boʻlishi asosan fizik reaksiya boʻlib, uni koʻp jihatdan yadrolanishning energiya toʻsigʻi cheklashi va ultratovush bilan ishlov berish bu toʻsiqni samarali kamaytirishi haqidagi gipotezani yanada qoʻllab-quvvatlaydi.

Amiloid bilan bogʻliq kasalliklar tadqiqotiga taʼsiri

UIP400MTP mikroplastinka sonikatori yordamida amiloid fibrillalarni oson va ishonchli hosil qilish Alsgeymer kasalligi (AD) hamda Parkinson kasalligi, II turdagi diabet va tizimli amiloidozlar kabi amiloid bilan bogʻliq boshqa kasalliklarni tadqiq etish uchun katta ahamiyatga ega. AD da amiloid-β (Aβ) agregatsiyasi asosiy patologik belgidir, biroq anʼanaviy usullardagi uzoq kechikish fazalari va oʻzgaruvchanlik tufayli uning fibrillalar hosil qilish kinetikasini oʻrganish qiyinligicha qolmoqda. Ultratovush taʼsirida fibrillalar hosil boʻlishi yadrolanishni tezlashtirib, yuqori takrorlanuvchanlik va kamroq oʻzgaruvchanlikni taʼminlaydi; bu potensial ingibitorlarni skrining qilish va amiloid hosil boʻlish mexanizmlarini tushunish uchun juda muhim. Bundan tashqari, UIP400MTP ning yuqori unumdorligi oqsillarning notoʻgʻri buklanishi va agregatsiyasini keng koʻlamda tadqiq qilish imkonini beradi, bu esa fibrillalar hosil boʻlishini oʻzgartira oladigan va neyrodegenerativ jarayonning rivojlanishini ehtimol susaytira oladigan davolash vositalarini kashf etishni osonlashtiradi.

Ushbu tadqiqot UIP400MTP koʻp chuqurchali plastinka sonikatori yordamida ultratovush bilan ishlov berishni amiloid fibrillalar hosil boʻlishini tezlashtirishning juda samarali usuli sifatida belgilaydi. Bu yondashuvning asosiy afzalliklari quyidagilardan iborat:

Fibrillalar hosil boʻlishining kechikish vaqtini keskin qisqartirish.
Barcha chuqurchalarda ultratovushning bir tekis taʼsiri, bu fibrillalarning takrorlanuvchan hosil boʻlishini taʼminlaydi.
Yuqori unumdorlikdagi skrining imkoniyati, bu uni oqsillarning amiloid hosil qilish qobiliyatini butun genom miqyosida izlash uchun mos qiladi.

Ultratovush bilan ishlov berishni ThT fluoressensiyasini aniqlash bilan birlashtirish orqali ushbu usul amiloid fibrillalar hosil boʻlishini oʻrganish uchun tezkor, koʻlamini kengaytirish mumkin boʻlgan va ishonchli platformani taqdim etadi. Samaradorligi va yuqori unumdorlik salohiyatini hisobga olganda, bu yondashuv biofizik va farmatsevtik tadqiqotlar uchun amiloid fibrillalarni oson sintez qilishga koʻmaklashishi mumkin hamda amiloid bilan bogʻliq tadqiqotlar va dori vositalari skriningi uchun istiqbolli vosita boʻlib xizmat qiladi.

Tegishli mavzular

Adabiyotlar / Manbalar

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Masatomo So, Hisashi Yagi, Kazumasa Sakurai, Hirotsugu Ogi, Hironobu Naiki, Yuji Goto (2011): Ultrasonication-Dependent Acceleration of Amyloid Fibril Formation. Journal of Molecular Biology, Volume 412, Issue 4, 2011. 568-577.
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.

Koʻp beriladigan savollar

Amiloidning birlamchi yadrolanishi nima?

Amiloidning birlamchi yadrolanishi amiloid fibrillalar hosil boʻlishining boshlangʻich, tezlikni cheklovchi bosqichi boʻlib, bunda monomer oqsillar konformatsion oʻzgarishlarga uchraydi va oʻz-oʻzidan birikib kritik yadro hosil qiladi. Bu yadro keyingi agregatsiya uchun qolip boʻlib xizmat qiladi.

Amiloidozda fibrilla qanday hosil boʻladi?

Amiloidozda notoʻgʻri buklangan oqsillar yadrolanishga bogʻliq polimerlanish orqali agregatsiyalanadi. Yadro hosil boʻlgach, monomerlar ikkilamchi yadrolanish va qolip asosida oʻsish orqali tezda uzayib, β-qatlamlarga boy fibrillalarga aylanadi va amiloid yotqiziqlarining hosil boʻlishiga olib keladi.

Amiloid fibrillalar polimorfizmi nima?

Amiloid fibrillalar polimorfizmi bir xil oqsildan hosil boʻlgan fibrillalardagi tuzilish farqlarini anglatadi. Fibrillalar morfologiyasi, protofilamentlarning joylashuvi va molekulyar joylashishdagi farqlar muhit sharoitlari, mutatsiyalar yoki turli agregatsiya yoʻllari tufayli yuzaga keladi.

Amiloid fibrillalar va pilakchalar oʻrtasidagi farq nima?

Amiloid fibrillalar chiziqsimon, β-qatlamlarga boy oqsil agregatlaridir, amiloid pilakchalar esa agregatsiyalangan fibrillalarning hujayradan tashqaridagi yotqiziqlari boʻlib, ular koʻpincha lipidlar, metallar va hujayra qoldiqlari bilan aralashgan boʻladi; bunday holat Alsgeymer kabi neyrodegenerativ kasalliklarda kuzatiladi.

Alfa-sinuklein va amiloid oʻrtasidagi farq nima?

Alfa-sinuklein sinaptik faoliyatda ishtirok etadigan neyron oqsilidir, biroq patologik sharoitlarda u notoʻgʻri buklanadi va amiloidga oʻxshash fibrillalar hosil qiladi. «Amiloid» notoʻgʻri buklangan, fibrillyar oqsil agregatlari uchun umumiy atama boʻlsa, alfa-sinuklein fibrillalari Parkinson kabi kasalliklarga xosdir.

Oqsil fibrillasi nima?

Oqsil fibrillasi notoʻgʻri buklangan yoki qisman yoyilgan oqsillardan hosil boʻladigan, yuqori darajada tartiblangan, β-qatlamlarga boy, ipsimon agregatdir. Bu fibrillalar odatda erimaydi va yadrolanishga bogʻliq polimerlanish orqali yuzaga keladi. Ular turli patologik holatlar, jumladan, amiloidozlar va neyrodegenerativ kasalliklar (masalan, Alsgeymer, Parkinson) bilan bogʻliq. Biroq biologik tizimlarda ayrim funksional oqsil fibrillalari ham mavjud, masalan, bakteriyalardagi curli tolalari va oʻrgimchaklardagi ipak fibrillalari.