UIP400MTP mikroplate Sonicator yordamida amiloid fibril shakllanishi

Amiloid fibrillalari xuddi kristallarga o'xshab, yadrolanish va keyingi o'sish jarayoni orqali hosil bo'ladi. Biroq, yadrolanishning yuqori erkin energiya to'sig'i tufayli, amiloid fibrilining o'z-o'zidan paydo bo'lishi faqat uzoq muddatli kechikish bosqichidan keyin sodir bo'ladi. Ultrasonikatsiya amiloid nukleatsiyasini qo'zg'atish uchun kuchli vosita sifatida paydo bo'ldi va shu bilan fibril shakllanishini sezilarli darajada tezlashtiradi. Tioflavin T (ThT) floresansidan foydalangan holda mikroplata o'quvchi bilan birlashtirilganda, ultratovush bir vaqtning o'zida bir nechta namunalarda amiloid fibrillalarini yuqori o'tkazuvchanlik bilan aniqlash imkonini beradi.

UIP400MTP mikroplate sonikatori bilan ultratovushli amiloid fibril shakllanishi

UIP400MTP ko'p quduqli plastinka sonikatori yordamida bir xil sifatdagi amiloid fibrillalari katta miqdorda tez sintezlanishi mumkin. Ushbu samarali yondashuv oqsilning amiloidogenligini o'rganish imkonini beradi. Ushbu usul tez va takrorlanadigan amiloid fibrilatsiyasini osonlashtiradi, bu dializ bilan bog'liq amiloidoz bilan bog'liq bo'lgan amiloidogen protein b2-mikroglobulin (b2-m) bilan ko'rsatilgan.

Oddiy eksperimental yondashuv: ultratovushli amiloid fibrilatsiyasi

Fibril hosil bo'lishini qo'zg'atish uchun UIP400MTP ko'p quduqli plastinka sonikatorining markaziga 96 quduqli mikroplastinka joylashtirildi, bu barcha quduqlar bo'ylab yagona ultratovush ta'sirini ta'minlaydi. Tajriba shartlari quyidagicha edi:

1. Har bir quduqda 5 mkM ThT bilan to'ldirilgan 0,2 ml b2-mikroglobulin eritmasi (0,3 mg/ml, pH 2,5) mavjud edi.
2. Plastinka 1 daqiqali ultratovush, keyin 9 daqiqalik pauza kabi ultratovush sikllariga duchor bo'ldi.
3. Post-sonikatsiya, ThT floresansi mikroplastinka o'quvchi yordamida o'lchandi.

(Qarang: So va boshqalar, 2011)

An'anaviy ajitatsiya bilan solishtirish

An'anaviy ajitatsiya usullari bilan solishtirganda, ultratovush fibril shakllanishining kechikish bosqichini keskin qisqartirdi. An'anaviy mikroplastinkalarni silkitish sharoitida 10 quduqdan faqat 1 tasida 20 soatdan keyin ThT floresansining ortishi kuzatildi. Bundan farqli o'laroq, tsiklli ultratovush yordamida (15 daqiqalik sonikatsiyadan so'ng 5 daqiqalik sukunat), birinchi sonikatsiya bilan davolashdan so'ng sezilarli ThT floresansi o'sishi aniqlandi.

Fibrilatsiya kinetikasining tez tezlashishi

So va boshqalardan olingan natijalar. (2011) pH 2,5 da b2-mikroglobulinning o'z-o'zidan fibril shakllanishi ultratovush yordamida bir necha soatdan atigi 10-15 daqiqagacha tezlashishi mumkinligini ko'rsatdi.
Atom kuch mikroskopiyasi (AFM) tasvirlari har 15 daqiqada 10 daqiqali ultratovush orqali hosil bo'lgan fibrillalar har 10 daqiqada 1 daqiqali ultratovush yordamida hosil bo'lgan fibrillalardan morfologik jihatdan farqlanmasligini tasdiqladi. Bu ultratovushli amiloid fibrilatsiyasining takrorlanishi va mustahkamligini ta'kidlaydi.

Har 10 daqiqada 1 daqiqali ultratovush (i), har 15 daqiqada 10 daqiqali sonikatsiya (ii) va ultratovushsiz ekish reaktsiyasi (iii) natijasida hosil bo'lgan amiloid fibrillalarining AFM tasvirlari. Oq shkala satri 1 mkmni bildiradi.
Tadqiqot va tasvirlar: ©So va boshqalar, 2011

Neytral pH sharoitida fibrilatsiya

Neytral pH sharoitida ham fibril hosil bo'lishiga 1,5 soatlik kechikish vaqtidan so'ng erishildi, bu ultrasonikatsiya yadrolanish va o'sish uchun energiya to'sig'ini sezilarli darajada kamaytirishini ko'rsatdi. Bu amiloid fibrilatsiyasi birinchi navbatda jismoniy reaktsiya bo'lib, asosan yadroviy energiya to'sig'i bilan chegaralangan bo'lib, ultrasonikatsiya samarali ravishda kamaytiradi degan gipotezani qo'llab-quvvatlaydi.

Amiloid bilan bog'liq kasalliklar tadqiqotiga ta'siri

UIP400MTP mikroplastinka sonikatoridan foydalangan holda amiloid fibrillalarining oson va ishonchli shakllanishi Altsgeymer kasalligi (AD) tadqiqotlari va Parkinson kasalligi, II turdagi diabet va tizimli amiloidozlar kabi boshqa amiloid bilan bog'liq kasalliklar uchun muhim ahamiyatga ega. ADda amiloid-b (Ab) agregatsiyasi asosiy patologik belgi hisoblanadi, ammo uning fibrilatsiya kinetikasini o'rganish uzoq kechikish fazalari va an'anaviy usullarning o'zgaruvchanligi tufayli qiyin bo'lib qolmoqda. Ultrasonikatsiyaga asoslangan fibril shakllanishi nukleatsiyani tezlashtiradi, yuqori takrorlanuvchanlikni va kamaytirilgan o'zgaruvchanlikni ta'minlaydi, bu potentsial inhibitorlarni tekshirish va amiloidogen mexanizmlarni tushunish uchun juda muhimdir. Bundan tashqari, UIP400MTP ning yuqori o'tkazuvchanlik qobiliyati oqsillarni noto'g'ri qatlamlash va yig'ish bo'yicha keng ko'lamli tadqiqotlarni o'tkazish imkonini beradi, bu fibril shakllanishini modulyatsiya qilish va neyrodegenerativ progressiyani yumshata oladigan terapevtik vositalarni topishga yordam beradi.

Ushbu tadqiqot amiloid fibril shakllanishini tezlashtirish uchun yuqori samarali usul sifatida UIP400MTP ko'p quduqli plastinka sonikatoridan foydalangan holda ultratovushni o'rnatadi. Ushbu yondashuvning asosiy afzalliklari quyidagilardan iborat:

• Fibrilatsiya uchun kechikish vaqtini keskin qisqartirish.
• Barcha quduqlar bo'ylab yagona ultratovush ta'siri, takrorlanadigan fibril shakllanishiga imkon beradi.
• Yuqori o'tkazuvchanlik skrining qobiliyati, bu protein amiloidogenligini genom bo'ylab izlash uchun mos keladi.

Ultrasonikatsiyani ThT floresansini aniqlash bilan birlashtirib, bu usul amiloid fibrilatsiyasini o'rganish uchun tez, kengaytiriladigan va ishonchli platformani ta'minlaydi. Samaradorlik va yuqori o'tkazuvchanlik potentsialini hisobga olgan holda, ushbu yondashuv biofizikaviy va farmatsevtik tadqiqotlar uchun amiloid fibrillalarining oson sintezini osonlashtirishi mumkin, bu esa amiloid bilan bog'liq tadqiqotlar va dori skriningi uchun istiqbolli vositani taklif qiladi.