UIP400MTP ultratovush qurilmasi yordamida koʻp sonli namunalarda prionlarni aniqlash uchun PMCA

Koʻp chuqurchali plastinkalar uchun UIP400MTP ultratovush qurilmasi oqsillarning notoʻgʻri buklanishini siklik amplifikatsiya qilishda (PMCA) koʻp sonli namunalarni tayyorlash uchun kuchli yechim taklif etadi. Bir nechta chuqurcha boʻylab energiyani bir tekis taqsimlash va ultratovush bilan ishlov berish parametrlarini aniq saqlash orqali ushbu tizim koʻplab namunalarga bir vaqtda, natijalarning nihoyatda yuqori takrorlanuvchanligi bilan ishlov berish imkonini beradi. Bu imkoniyatlar tahlil ingibitorlari natijalarni yashirishi mumkin boʻlgan soʻlak kabi murakkab biologik namunalarda past konsentratsiyadagi prionlarni aniqlash uchun PMCA usulini optimallashtirishda hal qiluvchi ahamiyatga ega.

Prion kasalliklari, masalan, bugʻusimonlardagi surunkali ozib ketish kasalligi (CWD) va odamlardagi Creutzfeldt-Jakob kasalligi (CJD), notoʻgʻri buklangan prion oqsillari (PrP^Sc) sabab boʻladigan neyrodegenerativ kasalliklardir. Bu kasalliklarda soʻlak, qon va siydik kabi tana suyuqliklarida yuqumli prionlar koʻpincha kam miqdorda boʻladi, bu esa tashxis qoʻyish va tadqiqotlarni murakkablashtiradi. Atrof-muhit matritsalariga ajralib chiqadigan prionlar orqali CWD kasalligining gorizontal yuqishi yovvoyi hayvonlar populyatsiyalarini boshqarish va ekologik salomatlik uchun ayniqsa muhim oqibatlarga ega. Xuddi shuningdek, Creutzfeldt-Jakob kasalligi kabi kasalliklarda inson namunalaridagi notoʻgʻri buklangan prion oqsillarini ishonchli amplifikatsiya qilish diagnostikani rivojlantirish va kasallikning rivojlanishini tushunish uchun hal qiluvchi ahamiyatga ega.

Oʻzgartirilgan PMCA protokolini qoʻllash keng tarqalgan tahlil ingibitorlari (masalan, soʻlakdagi mutsinlar) taʼsirini chetlab oʻtish va aks holda real vaqt rejimida tebranish orqali induksiyalangan konversiya (RT-QuIC) kabi usullar bilan aniqlab boʻlmaydigan yoki aniqlash natijalari noaniq boʻladigan prionlarni yuqori sezgirlik bilan aniqlash imkonini beradi. Ushbu yutuqlar turli kasalliklarda prionlarni aniqlashni yaxshilab, PMCA usulini prion tadqiqotlari va diagnostikasi uchun ajralmas vositaga aylantiradi. Koʻp chuqurchali plastinkalar uchun UIP400MTP ultratovush qurilmasi mikroplastinkalardagi (masalan, 6, 24 yoki 96 chuqurchali plastinkalarda) yoki probirka shtatividagi flakonlardagi koʻplab namunalarga ultratovush bilan ishlov berib, koʻp sonli namunalarda PMCA oʻtkazishni osonlashtiradi.

Koʻp sonli namunalarda oqsillarning notoʻgʻri buklanishini siklik amplifikatsiya qilish (PMCA) protokoli

Quyidagi protokol ishonchli tadqiqot natijalarini olish uchun koʻp sonli namunalarga mutlaqo bir xil sharoitlarda samarali ishlov berish imkonini beradi.

Namunalarni tayyorlash

Boshlangʻich material:
Prepare samples by:

• Resuspending sarkosyl extraction pellets in PMCA substrate.
• To’g’ridan-to’g’ri spiking miya homogenatlari yoki prion urug’lari bilan qon namunalari.

Substrat:

• PrP ni haddan tashqari ifodalovchi transgen sichqonlardan tayyorlangan 10% (og’irlik / hajm) miya gomogenatidan foydalaning.^C (e.g., Tg mice).
• Homogenize the brain tissue in:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Store the substrate at -80ºC until use.

Namunalarni mikroplastinka yoki probirkalarga joylashtirish:
Probirkalar:

• 90 mkl miya gomogenati substratini qo’shing va 10 mkL namuna (masalan, qon, miya gomogenati yoki sarkosil pelleti) bilan urug’lang.
• Place 3 Teflon beads (1,59-mm or 2,38-mm diameter) in each 0,2 mL tube.
• Quvurlarni UIP400MTP sonikatoriga mos keladigan taglikka o’rnating.

6 chuqurchali mikroplastinka:

• 5 ml miya gomogenati substratini qo’shing va har bir quduqqa 500 mL namuna bilan urug’ qo’shing.
• Add 3 Teflon beads to each well.

PMCA jarayoni

Joylashtirish:
Ishlab chiqaruvchining ko’rsatmalariga muvofiq trubka tokchasini yoki 6 quduqli mikroplastinkani UIP400MTP sonikatoriga joylashtiring.

Sikllar dasturi:
Perform 144 PMCA cycles as follows:

• Kuluçka: 37°C da 29 daqiqa 30 soniya.
• Sonication: 30 seconds at 60% amplitude.
• Haroratni kuzatib boring: Namuna haroratini kuzatish va UIP400MTP ni maksimal darajaga dasturlash uchun ulanadigan harorat sensoridan foydalaning. harorat 48-50 ° S.

Keyingi bosqichlar:
144 tsiklning birinchi bosqichini tugatgandan so’ng, kuchaytirilgan materialning bir qismini o’tkazing:

• Yangi transgenik sichqoncha miya gomogenat substratiga 10 barobar suyultiriladi.
• Bir xil sonikatsiya parametrlarini saqlab, keyingi turlar uchun 96 PMCA tsiklini bajaring.
• Kerakli turlar soniga (odatda 5 tagacha) davom eting.

Aniqlash: PrP^Sc

1. Proteinaza K bilan parchalash:
   – Namunalarga 37°C da 1 soat davomida Proteinaza K (50 μg/mL) bilan ishlov bering.
   – SDS namuna buferini qo‘shib, 10 daqiqa qaynatish orqali proteolizni to‘xtating.
2. Western blot tahlili:
   – Analyze digested samples using:
   – 6H4 or PRC1 anti-PrP antibodies.
   – SDS-PAGE ni bajaring va aniqlash uchun PVDF membranalariga ko‘chiring.

 

Hielscher UIP400MTP ko‘p chuqurchali planshetlar, PCR planshetlari yoki namuna probirkalari uchun eng moslashuvchan sonikatordir. 400 vatt uzluksiz ultratovush quvvatiga ega ushbu qurilma hujayralarni lizis qilish, emulsiyalash, oqsillarni ekstraksiya qilish, DNA / RNA ni fragmentlash, aglomeratlarni parchalash, FFPE ekstraksiyasi, hujayralar va bioplyonkalarni sirtdan ajratish yoki emulsiyalash kabi vazifalar uchun mo‘ljallangan. UIP400MTP ultratovush vannasi emas. U yo‘naltirilgan ultratovush bilan ishlov berish uchun yuqori intensivlikdagi kosasimon sonotroddir. Ushbu kuchli kontaktsiz sonikator standart planshetning barcha chuqurchalariga bir xil ultratovush ta’sirini ta’minlaydi. Amplituda, quvvat va impuls rejimini aniq boshqarishingiz mumkin. O‘rnatilgan taymer va harorat zondi natijalarning takrorlanuvchanligini ta’minlaydi. UIP400MTP planshet sonikatori namunalarni suv vannasi yordamida sovitadi (tashqi sovitkich ixtiyoriy).

 

Yanada ishonchli natijalar uchun koʻproq namunalarga ishlov bering

Koʻp chuqurchali plastinkalar uchun UIP400MTP ultratovush qurilmasi oqsillarning notoʻgʻri buklanishini siklik amplifikatsiya qilish (PMCA) samaradorligini va koʻlamini kengaytirish imkoniyatini sezilarli darajada oshirib, ushbu jarayonning odatda koʻp vaqt talab qilish muammosini hal etadi. Tizim 96 chuqurchali plastinkada bir vaqtning oʻzida 96 tagacha namunaga ishlov berish imkonini yaratib, barcha chuqurchalarda ultratovush bilan ishlov berishning aniq va bir xil sharoitlarini saqlagan holda PMCA ish jarayonlarini soddalashtiradi. Koʻp sonli namunalarga ishlov berish imkoniyati qoʻlda bajariladigan amallarni kamaytiradi, koʻp mehnat talab qiladigan bosqichlarni qisqartiradi va natijalarning takrorlanuvchanligini taʼminlaydi, shu sababli qurilma prion tadqiqotlari uchun ajralmas vositaga aylanadi. Surunkali ozib ketish kasalligi yoki Creutzfeldt-Jakob kasalligi oʻrganilishidan qatʼi nazar, UIP400MTP keng koʻlamli tadqiqotlarni yanada samarali oʻtkazishni osonlashtirib, tadqiqotchilarga zamonaviy diagnostika va ilmiy qoʻllanmalarning talablarini bajarish imkonini beradi.

---

---

Adabiyotlar / Manbalar

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.