UIP400MTP Sonicator yordamida prionlarni yuqori o'tkazuvchanlikni aniqlash uchun PMCA

UIP400MTP ko'p quduqli plastinka sonikatori oqsil noto'g'ri qatlamli siklik kuchaytirishda (PMCA) yuqori o'tkazuvchanlik namunalarini tayyorlash uchun kuchli yechim taklif qiladi. Bir nechta quduqlar bo'ylab yagona energiya taqsimotini ta'minlash va aniq sonikatsiya parametrlarini saqlab turish orqali ushbu tizim juda ko'p namunalarni bir vaqtning o'zida qayta ishlashga imkon beradi. Ushbu qobiliyatlar test inhibitörleri natijalarni yashirishi mumkin bo'lgan so'lak kabi qiyin biologik namunalarda past konsentratsiyalarda prionlarni aniqlash uchun PMCA ni optimallashtirish uchun juda muhimdir.

Prion kasalliklari, masalan, serviksdagi surunkali yo'qotish kasalligi (CWD) va odamlarda Creutzfeldt-Jakob kasalligi (CJD) noto'g'ri katlanmış prion oqsillari (PrP) tufayli kelib chiqqan neyrodegenerativ kasalliklardir.^Sc). Ushbu kasalliklar ko'pincha tana suyuqliklarida, masalan, tupurik, qon va siydik kabi yuqumli prionlarning past darajasini o'z ichiga oladi, bu tashxis va tadqiqotlarni murakkablashtiradi. Atrof-muhit matritsalarida to'kilgan prionlar orqali CWDning gorizontal uzatilishi, ayniqsa, yovvoyi tabiatni boshqarish va ekologik salomatlik uchun muhim ahamiyatga ega. Xuddi shunday, Creutzfeldt-Jakob kasalligi kabi kasalliklarda, odam namunalaridan noto'g'ri katlanmış prion oqsillarini ishonchli kuchaytirish diagnostika va kasallikning rivojlanishini tushunish uchun juda muhimdir.

O'zgartirilgan PMCA protokolini qo'llash umumiy tahlil ingibitorlarini (masalan, tupurikdagi musinlar) chetlab o'tishga va real vaqtda zilzilaga bog'liq konversiya (RT-QuIC) kabi usullar yordamida aniqlanmaydigan yoki noaniq bo'ladigan prionlarni aniqlashda yuqori sezuvchanlikka erishish imkonini beradi. Ushbu yutuqlar turli kasalliklar uchun prionlarni aniqlashni kuchaytiradi va PMCA ni prion tadqiqoti va diagnostikasi uchun ajralmas vositaga aylantiradi. UIP400MTP ko'p quduqli plastinka sonikatori mikroplastinkalarda (masalan, 6-, 24- yoki 96-quduqli plitalar) yoki trubka rafidagi flakonlarda ko'p sonli namunalarni ultratovush qilish qobiliyatiga ega PMCA-ni osonlashtiradi.

Yuqori o'tkazuvchanlikdagi oqsillarni noto'g'ri qatlamli tsiklik kuchaytirish protokoli (PMCA)

Quyidagi protokol ishonchli tadqiqot natijalari uchun aynan bir xil sharoitlarda yuqori namunalar sonini samarali qayta ishlash imkonini beradi.

namuna tayyorlash

Boshlang'ich material:
Namunalarni tayyorlang:

• PMCA substratida sarkosil ekstraksiya pelletlarini qayta tiklash.
• To'g'ridan-to'g'ri spiking miya homogenatlari yoki prion urug'lari bilan qon namunalari.

Substrat:

• PrP ni haddan tashqari ifodalovchi transgen sichqonlardan tayyorlangan 10% (og'irlik / hajm) miya gomogenatidan foydalaning.^C (masalan, Tg sichqonlari).
• Miya to'qimasini homogenlashtiring:
  – 1 × PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Foydalanilgunga qadar substratni -80ºC da saqlang.

Mikroplastinka yoki naychalarda namunani o'rnatish:
Quvurlar:

• 90 mkl miya gomogenati substratini qo'shing va 10 mkL namuna (masalan, qon, miya gomogenati yoki sarkosil pelleti) bilan urug'lang.
• Har bir 0,2 ml kolbaga 3 ta teflon boncuk (diametri 1,59 mm yoki 2,38 mm) qo'ying.
• Quvurlarni UIP400MTP sonikatoriga mos keladigan taglikka o'rnating.

6-quduqli mikroplastinka:

• 5 ml miya gomogenati substratini qo'shing va har bir quduqqa 500 mL namuna bilan urug' qo'shing.
• Har bir quduqqa 3 ta teflon boncuk qo'shing.

PMCA tartibi

Joylashtirish:
Ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq trubka tokchasini yoki 6 quduqli mikroplastinkani UIP400MTP sonikatoriga joylashtiring.

Velosiped dasturi:
144 PMCA tsiklini quyidagicha bajaring:

• Kuluçka: 37°C da 29 daqiqa 30 soniya.
• Sonikatsiya: 60% amplituda 30 soniya.
• Haroratni kuzatib boring: Namuna haroratini kuzatish va UIP400MTP ni maksimal darajaga dasturlash uchun ulanadigan harorat sensoridan foydalaning. harorat 48-50 ° S.

Keyingi turlar:
144 tsiklning birinchi bosqichini tugatgandan so'ng, kuchaytirilgan materialning bir qismini o'tkazing:

• Yangi transgenik sichqoncha miya gomogenat substratiga 10 barobar suyultiriladi.
• Bir xil sonikatsiya parametrlarini saqlab, keyingi turlar uchun 96 PMCA tsiklini bajaring.
• Kerakli turlar soniga (odatda 5 tagacha) davom eting.

PrP ni aniqlash^Sc

1. Proteinaz K hazm qilish:
   – Namunalarni Proteinaz K (50 mkg/ml) bilan 37°C da 1 soat davomida ishlang.
   – SDS-namuna buferini qo'shish va 10 daqiqa qaynatish orqali hazm qilishni to'xtating.
2. Western Blot tahlili:
   – Hazm qilingan namunalarni tahlil qiling:
   – 6H4 yoki PRC1 anti-PrP antikorlari.
   – SDS-PAGE ni bajaring va aniqlash uchun PVDF membranalariga o'tkazing.

 

 

Yana ishonchli natijalarga erishish uchun koʻproq namunalarni qayta ishlang

UIP400MTP ko'p quduqli plastinka sonikatori protseduraning an'anaviy ravishda ko'p vaqt talab qiladigan xususiyatini hisobga olgan holda, oqsilni noto'g'ri qatlamli tsiklik kuchaytirish (PMCA) samaradorligini va miqyosini sezilarli darajada oshiradi. 96 quduqli plastinkada 96 tagacha namunani bir vaqtning o'zida qayta ishlashga ruxsat berib, tizim barcha quduqlarda aniq va bir xil sonikatsiya sharoitlarini saqlab, PMCA ish oqimlarini soddalashtiradi. Ushbu yuqori o'tkazuvchanlik qobiliyati qo'lda ishlov berishni minimallashtiradi, ko'p mehnat talab qiladigan qadamlarni kamaytiradi va takrorlanuvchanlikni ta'minlaydi, bu uni prion tadqiqoti uchun ajralmas vositaga aylantiradi. Surunkali isrofgarchilik kasalligi yoki Creutzfeldt-Jakob kasalligini o'rganishdan qat'i nazar, UIP400MTP keng ko'lamli tadqiqotlarni yuqori samaradorlik bilan osonlashtiradi va tadqiqotchilarga zamonaviy diagnostika va ilmiy ilovalar talablarini qondirishga imkon beradi.

---

---

Adabiyot / Adabiyotlar

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.