Високопродуктивна підготовка зразків для мітохондріальної діагностики
Мітохондріальну діагностику в дослідженнях і клінічній практиці проводять за допомогою різних методів, зокрема секвенування, ПЛР і біохімічних аналізів. Ці методи використовують для виявлення мутацій ДНК та вимірювання функції мітохондрій. Секвенування допомагає виявляти генетичні мутації, тоді як ПЛР дає змогу кількісно визначати специфічні послідовності ДНК. Біохімічні аналізи оцінюють функціональність мітохондріальних білків і ферментів.
Діагностика мітохондріальних захворювань особливо складна через виражену клінічну мінливість цих захворювань, а також через складну взаємодію між двома геномами з різними типами успадкування: мітохондріальною ДНК (mtDNA) та ядерним геномом.
Екстракція та фрагментація ДНК за допомогою ультразвукової обробки
Екстракція ДНК із м’язової тканини особливо корисна за підозри на тканинноспецифічні зміни mtDNA. Ці зміни можуть включати делеції mtDNA при хронічній прогресуючій зовнішній офтальмоплегії (CPEO), точкові мутації mtDNA при мітохондріальних міопатіях або виснаження mtDNA при синдромі Альперса. ДНК, екстраговану з м’язової тканини, надалі можна використовувати для різних генетичних досліджень, зокрема Саузерн-блотингу та довгофрагментної ПЛР для виявлення делецій, ПЛР у реальному часі для виявлення виснаження або секвенування для виявлення точкових мутацій.
Ультразвукову обробку із застосуванням інтенсивних ультразвукових хвиль використовують для кількох завдань у мітохондріальній діагностиці. Її застосовують для лізису клітин із метою екстракції внутрішньоклітинного вмісту, зокрема мітохондрій і ДНК, для фрагментації ДНК, зокрема mtDNA та nDNA, під дією зсувних сил для секвенування, а також для гомогенізації зразків.
Ультразвуковий прилад UIP400MTP для високопродуктивної підготовки зразків у планшетах рівномірно обробляє ультразвуком зразки в багатолункових і 96-лункових планшетах
Як виділити мітохондрії з клітин і тканин
Виділення мітохондрій охоплює два основні етапи: руйнування клітин для вивільнення їхнього вмісту та застосування диференційного центрифугування для розділення й отримання мітохондріальних фракцій.
Ультразвукова обробка
Ультразвукові прилади Hielscher сумісні зі стандартними буферами та наборами для лізису, що робить їх придатними для виділення мітохондрій. Ультразвукова обробка слугує двом основним цілям:
- Лізис клітин: Ультразвукові хвилі руйнують клітинні мембрани, вивільняючи внутрішньоклітинний вміст.
- Руйнування мітохондрій: Ультразвукова обробка на наступному етапі може зруйнувати мітохондрії для вивільнення мітохондріальних білків або мітохондріальної ДНК.
- Фрагментація mtDNA: Ультразвукова обробка є надійним методом фрагментації мітохондріальної ДНК під дією зсувних сил для секвенування.
Ультразвуковий прилад UIP400MTP для багатолункових планшетів дає змогу виконувати високопродуктивну підготовку мітохондріальних зразків. У поєднанні з диференційним центрифугуванням ультразвукова обробка підвищує ефективність виділення мітохондрій, забезпечуючи високий вихід інтактних мітохондрій, придатних для різних подальших застосувань.
Ультразвуковий прилад Hielscher UIP400MTP для багатолункових планшетів працює з будь-яким стандартним планшетом
Ультразвуковий прилад UIP400MTP для багатолункових планшетів пропонує численні переваги для високопродуктивної підготовки зразків, наприклад у мітохондріальній діагностиці.
Ультразвуковий прилад UIP400MTP для багатолункових планшетів для високопродуктивної підготовки зразків у діагностиці за біомаркерами.
Приклад інструкції з ультразвукової фрагментації mtDNA
Підготовка та вилучення:
- Мишей C57BL/6 умертвляли шляхом дислокації шийних хребців.
- Печінки швидко вилучали та промивали крижаним стерильним фосфатно-сольовим буфером (PBS).
Виділення мітохондрій:
- Мітохондрії виділяли за допомогою тканинного гомогенізатора Даунса об’ємом 2 mL та набору для виділення мітохондрій із тканин.
- Початкове центрифугування за 700× g та 3 000× g.
- Виконайте два додаткові етапи промивання буфером C.
Виділення ДНК:
- Осад після першого центрифугування за 700× g використовували для виділення ядерної ДНК (nDNA).
- ДНК виділяли за допомогою центрифужних колонок.
- Мітохондріальну ДНК (mtDNA) екстрагували з виділених мітохондрій.
- Ядерну ДНК (nDNA) екстрагували з неочищених ядерних екстрактів; в обох випадках вихідним матеріалом була тканина печінки миші.
Фрагментація ДНК:
- ДНК фрагментували на льоду за допомогою ультразвукового приладу UP50H із частотою 30 kHz і потужністю 50 W, оснащеного сонотродом із мікронаконечником 0,5 mm, за 14 μm протягом 2 × 30 секунд.
Візуалізація та кількісна оцінка фрагментації:
- Фрагментацію після ультразвукової обробки візуалізували в 1% агарозному гелі з барвником для ДНК SYBR safe.
- Відносний вміст mtDNA та nDNA визначали методом qPCR.
(cf. Mariero et al., 2019)
Для високопродуктивної підготовки зразків ультразвуковий пристрій UIP400MTP для багатолункових планшетів полегшує підготовку великої кількості зразків у стандартних 96-лункових, багатолункових і мікротитрувальних планшетах.
Дізнайтеся більше про переваги високопродуктивної підготовки зразків за допомогою UIP400MTP!
Поради для оптимального виділення мітохондрій за допомогою ультразвукової обробки:
- Контроль температури: Виконуйте всі етапи за температури від 0°C до 4°C. Це критично важливо для збереження цілісності та функціональності мітохондрій.
- Ефективність і швидкість: Працюйте швидко й очищуйте мітохондрії лише до ступеня, необхідного для вашого конкретного застосування. Надмірні маніпуляції можуть призвести до значних втрат мітохондріального вмісту.
- Розведення суспензій: Підтримуйте низькі концентрації суспензій клітин та органел протягом усього процесу виділення. Це допомагає мінімізувати ризики захоплення й аглютинації, підвищуючи тим самим чистоту виділених мітохондрій.
- Об’єм зразка: Віддавайте перевагу кільком процедурам підготовки невеликих об’ємів замість однієї процедури з великим об’ємом. Такий підхід зазвичай забезпечує вищий вихід, оскільки збільшення масштабу не підвищує пропорційно кількість мітохондрій, які можна отримати. Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для багатолункових планшетів полегшує швидкий і надійний лізис клітин для виділення мітохондрій, а також екстракцію білків із мітохондрій.
Ці рекомендації підвищать ефективність процесу виділення за допомогою ультразвукового лізису та центрифугування, забезпечуючи отримання високоякісних мітохондріальних препаратів, придатних для подальших застосувань.
Ультразвукові пристрої Hielscher – якість, виготовлена в Німеччині
Ультразвукові пристрої Hielscher добре відомі найвищими стандартами якості та конструкції. Міцність і простота експлуатації забезпечують безперешкодну інтеграцію наших ультразвукових пристроїв у промислові об’єкти. Ультразвукові пристрої Hielscher легко справляються із суворими умовами та вимогливими середовищами.
Hielscher Ultrasonics – компанія, сертифікована за ISO, яка приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим пристроям із найсучаснішими технологіями та зручністю використання. Звісно, ультразвукові пристрої Hielscher відповідають вимогам CE та вимогам UL, CSA і RoHs.
Ультразвуковий пристрій UIP400MTP для 96-лункових планшетів для ультразвукової обробки мікротитрувальних і багатолункових планшетів
Література / Джерела
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Поширені запитання про мітохондрії та мітохондріальну діагностику
Що таке мітохондрії?
Мітохондрії – це оточені мембранами органели, що містяться в клітинах більшості еукаріотичних організмів. Вони відомі як енергетичні станції клітини, оскільки виробляють енергію у формі аденозинтрифосфату (АТФ) у процесі клітинного дихання. Крім того, мітохондрії мають власну ДНК і відіграють ключову роль в інших клітинних процесах, зокрема в регуляції клітинного циклу та загибелі клітин.
Чим mtDNA відрізняється від геномної ДНК?
Мітохондріальна ДНК (mtDNA) відрізняється від геномної ДНК (gDNA) за кількома ключовими ознаками. mtDNA міститься в мітохондріях, має кільцеву форму й успадковується по материнській лінії, тоді як gDNA міститься в ядрі клітини, має лінійну форму й успадковується від обох батьків. mtDNA значно менша й кодує лише 37 генів, тоді як gDNA містить приблизно 20 000–25 000 генів. mtDNA наявна в кількох копіях на клітину, має вищу частоту мутацій і переважно кодує білки, що беруть участь у функціонуванні мітохондрій. Натомість gDNA зазвичай є диплоїдною, має нижчу частоту мутацій і кодує широкий спектр генів, необхідних для розвитку та функціонування організму. Крім того, транскрипція та трансляція mtDNA відбуваються всередині мітохондрій, тоді як транскрипція gDNA відбувається в ядрі, а трансляція – у цитоплазмі. Ці відмінності відображають їхні різні ролі та еволюційне походження.
Що таке безклітинний екстракт?
Безклітинний екстракт – це розчин, що містить вміст лізованих клітин, зокрема білки, нуклеїнові кислоти та інші клітинні компоненти, але не містить інтактних клітинних мембран. Цей екстракт використовують у біохімічних і молекулярно-біологічних дослідженнях для вивчення клітинних процесів in vitro, що дає дослідникам змогу аналізувати реакції та механізми поза живими клітинами.
Яку роль відіграють ПЛР-тести в мітохондріальній діагностиці?
ПЛР-тести відіграють ключову роль у мітохондріальній діагностиці, даючи змогу виявляти мутації, делеції або варіації кількості копій мітохондріальної ДНК (mtDNA). Вони забезпечують ампліфікацію певних ділянок mtDNA для виявлення патогенних варіантів, пов’язаних із мітохондріальними захворюваннями. Методи на основі ПЛР, як-от кількісна ПЛР (qPCR) і довгофрагментна ПЛР, також використовують для оцінювання цілісності mtDNA, рівнів гетероплазмії та виснаження mtDNA, отримуючи важливу інформацію про функцію мітохондрій і захворювання.
Дізнайтеся, як ультразвуковий пристрій UIP400MTP для мікропланшетів полегшує проведення ПЛР-тестів і аналізів!
Що таке диференційне центрифугування?
Диференційне центрифугування – це широко застосовуваний метод фракціонування клітин і виділення мітохондрій. Цей метод розділяє клітинні структури за їхнім коефіцієнтом седиментації, який залежить як від густини, так і від форми. Процес передбачає дію відцентрової сили різної величини на зразки в буферних сольових розчинах із певною густиною. Структури з подібними коефіцієнтами седиментації одночасно осідають на дно збірної пробірки, що дає змогу їх отримати.
Як диференційне центрифугування використовують для виділення мітохондрій?
Диференційне центрифугування дає дослідникам змогу ефективно відокремлювати мітохондріальні фракції від інших клітинних компонентів. Виділення мітохондрій передбачає кілька етапів центрифугування з подальшим отриманням ізоляту.
Початкове центрифугування: Застосовуйте невелику відцентрову силу для осадження великих клітинних уламків і ядер.
Подальші центрифугування: Поетапно збільшуйте відцентрову силу для осадження фракцій, збагачених мітохондріями. На кожному етапі центрифугування видаляються структури з дедалі вищими коефіцієнтами седиментації.
Отримання фракцій: Після кожного центрифугування збирають осад, а супернатант піддають дії більших відцентрових прискорень g для виділення наступної фракції. Це повторюють до досягнення бажаної чистоти мітохондрій.