Високопродуктивна підготовка зразків для мітохондріальної діагностики
Мітохондріальна діагностика в дослідженнях і клініках проводиться за допомогою різних методик, таких як секвенування, ПЛР і біохімічні аналізи. Ці методи використовуються для виявлення мутацій ДНК і вимірювання функції мітохондрій. Секвенування допомагає виявити генетичні мутації, а ПЛР може кількісно визначити специфічні послідовності ДНК. Біохімічні аналізи оцінюють функціональність мітохондріальних білків і ферментів.
Діагностика мітохондріальних захворювань особливо складна через виражену клінічну варіабельність цих захворювань, а також через складну взаємодію двох по-різному успадкованих геномів: мітохондріальної ДНК (мтДНК) і ядерного геному.
Екстракція та фрагментація ДНК за допомогою ультразвукового дослідження
Екстракція ДНК з м'язової тканини особливо корисна при підозрі на тканиноспецифічні зміни в мтДНК. Ці зміни можуть включати делеції мтДНК при хронічній прогресуючій зовнішній офтальмоплегії (ХПЕО), точкові мутації мтДНК при мітохондріальних міопатіях або виснаження мтДНК при синдромі Альперса. ДНК, витягнута з м'язової тканини, потім може бути використана для різних генетичних тестів, таких як південний блот і далекобійна ПЛР для видалення, ПЛР в реальному часі для виснаження або секвенування для точкових мутацій.
Ультразвукова діагностика з використанням інтенсивних ультразвукових хвиль застосовується для декількох застосувань в мітохондріальній діагностиці. Він використовується для лізу клітин для вилучення внутрішньоклітинного вмісту, такого як мітохондрії та ДНК, для зрізу ДНК, такої як мтДНК та нДНК, для секвенування, а також для гомогенізації зразків.
UIP400MTP Пластинчастий саунікатор для високопродуктивної підготовки зразків рівномірно ультразвукує зразки в багатолункових і 96-лункових пластинах
Як виділити мітохондрії з клітин і тканин
Ізоляція мітохондрій включає два основні етапи: порушення клітинам вивільнення свого вмісту та використання диференційного центрифугування для відділення та відновлення мітохондріальних фракцій.
ультразвукова хвороба,
Ультразвуки Hielscher сумісні зі стандартними лізисними буферами та наборами, що робить їх придатними для ізоляції мітохондрій. Ультразвукове дослідження служить двом основним цілям:
- Лізис клітин: Ультразвукові хвилі руйнують клітинні мембрани, вивільняючи внутрішньоклітинний вміст.
- Порушення мітохондрій: Ультразвук на наступному етапі може розірвати мітохондрії для вивільнення мітохондріальних білків або мітохондріальної ДНК.
- Фрагментація мтДНК: Ультразвукова діагностика є надійною технікою зрізу мітохондріальної ДНК для секвенування.
Багатолунковий пластинчастий ультразвуковий UIP400MTP дозволяє проводити високопродуктивну підготовку зразків мітохондрій. У поєднанні з диференціальним центрифугуванням ультразвукове дослідження підвищує ефективність ізоляції мітохондрій, забезпечуючи високі виходи інтактних мітохондрій, придатних для різних подальших застосувань.
Багатолунковий пластинчастий сонник Hielscher UIP400MTP Працює з будь-якою стандартною плитою
Багатолунковий пластинчастий UIP400MTP пропонує численні переваги для високопродуктивної підготовки зразків, наприклад, у мітохондріальній діагностиці.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator для високопродуктивної підготовки зразків у діагностиці біомаркерів.
Зразкова інструкція з ультразвукової фрагментації мтДНК
Приготування та екстракція:
- Миші C57BL/6 були вбиті вивихом шийки матки.
- Печінку швидко витягували і промивали в крижаному стерильному ПБС.
Виділення мітохондрій:
- Мітохондрії були виділені за допомогою шліфувальної машини Dounce об'ємом 2 мл і набору для виділення мітохондрій для тканин.
- Початкове центрифугування при 700× г і 3 000× г.
- Виконайте два додаткові етапи миття з буфером C.
Виділення ДНК:
- Гранула з першого центрифугування в кількості 700× г була використана для виділення ядерної ДНК (нДНК).
- ДНК була виділена за допомогою спінових колонок.
- Мітохондріальна ДНК (мтДНК) була виділена з ізольованих мітохондрій.
- Ядерна ДНК (нДНК) була виділена з грубих ядерних екстрактів, обох з тканин печінки мишей.
Фрагментація ДНК:
- Фрагментацію ДНК проводили на льоду за допомогою ультразвукового соніка UP50H з 0,5-мм сонотродом з мікрокінчиком на 14 мкм протягом 2 × 30 секунд.
Візуалізація та кількісна оцінка фрагментації:
- Фрагментацію після ультразвуку візуалізували на 1% агарозному гелі з безпечним ДНК-барвником SYBR.
- Відносну чисельність мтДНК і нДНК визначали за допомогою qPCR.
(пор. Мар'єро та ін., 2019)
Для високопродуктивної підготовки зразків багатолунковий пластинчастий UIP400MTP полегшує підготовку великих номерів зразків у стандартних 96-лункових, багатолункових та мікротитрових планшетах.
Дізнайтеся більше про переваги високопродуктивної підготовки зразків за допомогою UIP400MTP!
Поради щодо оптимального виділення мітохондрій за допомогою ультразвуку:
- Контроль температури: Всі етапи проводите при температурному діапазоні від 0°С до 4°С. Це має вирішальне значення для підтримки цілісності та функціональності мітохондрій.
- Ефективність та швидкість: Працюйте швидко та очищайте мітохондрії лише в обсязі, необхідному для вашого конкретного застосування. Надмірні маніпуляції можуть призвести до значних втрат вмісту мітохондрій.
- Розведення суспензій: Підтримуйте низькі концентрації суспензій клітин і органел протягом усього процесу виділення. Це допомагає мінімізувати ризики захоплення і аглютинації, тим самим покращуючи чистоту виділених мітохондрій.
- Обсяг вибірки: Вибирайте кілька невеликих препаратів, а не один великий. Такий підхід зазвичай призводить до кращої врожайності, оскільки збільшення масштабу не пропорційно збільшує кількість мітохондрій, що відновлюються. Багатолунковий пластинчастий UIP400MTP сприяє швидкому та надійному лізису клітини для ізоляції мітохондрій, а також вилученню білка з мітохондрій.
Ці рекомендації зроблять процес ізоляції за допомогою ультразвукового лізису та центрифугування більш ефективним, отримуючи високоякісні мітохондріальні препарати, придатні для подальшого застосування.
Звукорежисери Хільшера – Якість зроблено в Німеччині
Ультразвукові апарати Hielscher добре відомі своїми найвищими стандартами якості та дизайну. Надійність і простота експлуатації дозволяють плавно інтегрувати наші ультразвукові апарати в промислові об'єкти. З важкими умовами та вимогливими умовами легко справляються ультразвукові апарати Hielscher.
Hielscher Ultrasonics є сертифікованою компанією ISO і приділяє особливу увагу високопродуктивним ультразвуковим апаратам, які відрізняються найсучаснішими технологіями та зручністю для використання. Звичайно, ультразвукові апарати Hielscher відповідають вимогам CE та відповідають вимогам UL, CSA та RoHs.
96-лунковий пластинчастий сонікатор UIP400MTP для ультразвукування мікротитрових та багатолункових пластин
Література / Список літератури
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Часті питання про мітохондрії та мітохондріальну діагностику
Що таке мітохондрії?
Мітохондрії — це мембранозв'язані органели, що містяться в клітинах більшості еукаріотичних організмів. Вони відомі як електростанції клітини, оскільки виробляють енергію у формі аденозинтрифосфату (АТФ) у процесі клітинного дихання. Крім того, мітохондрії мають власну ДНК і відіграють ключову роль в інших клітинних процесах, включаючи регуляцію клітинного циклу та загибель клітин.
Чим відрізняється мтДНК від геномної ДНК?
Мітохондріальна ДНК (мтДНК) відрізняється від геномної ДНК (гДНК) за кількома ключовими ознаками. МтДНК розташована в мітохондріях, має кільцеву форму і успадковується по материнській лінії, тоді як гДНК розташована в ядрі клітини, є лінійною і успадковується від обох батьків. МтДНК набагато менше, кодує всього 37 генів, в той час як гДНК містить близько 20 000-25 000 генів. МтДНК присутня в декількох копіях на клітину, має більш високу частоту мутацій і в першу чергу кодує білки, що беруть участь у функції мітохондрій. На противагу цьому, гДНК зазвичай диплоїдна, має нижчу частоту мутацій і кодує широкий спектр генів, необхідних для розвитку та функціонування організму. Крім того, транскрипція та трансляція мтДНК відбувається в мітохондріях, тоді як транскрипція гДНК відбувається в ядрі, а трансляція відбувається в цитоплазмі. Ці відмінності відображають їх різну роль та еволюційне походження.
Що таке безклітинний екстракт?
Безклітинний екстракт — це розчин, що містить вміст лізованих клітин, включаючи білки, нуклеїнові кислоти та інші клітинні компоненти, але без інтактних клітинних мембран. Цей екстракт використовується в біохімічних і молекулярно-біологічних дослідженнях для вивчення клітинних процесів in vitro, що дозволяє дослідникам аналізувати реакції та механізми за межами живих клітин.
Яку роль відіграють ПЛР-тести в мітохондріальній діагностиці?
ПЛР-тести відіграють важливу роль у мітохондріальній діагностиці, дозволяючи виявляти мутації, делеції або варіації кількості копій у мітохондріальній ДНК (мтДНК). Вони дозволяють ампліфікувати специфічні ділянки мтДНК для виявлення патогенних варіантів, пов'язаних з мітохондріальними порушеннями. Методи на основі ПЛР, такі як кількісна ПЛР (qPCR) і ПЛР на великій відстані, також використовуються для оцінки цілісності мтДНК, рівня гетероплазми та виснаження мтДНК, надаючи важливу інформацію про функцію мітохондрій та захворювання.
Дізнайтеся, як UIP400MTP Microplate Sonicator полегшує проведення ПЛР-тестів та аналізів!
Що таке диференціальне центрифугування?
Диференціальне центрифугування є широко використовуваним методом фракціонування клітин і виділення мітохондрій. Цей метод розділяє клітинні структури на основі їх коефіцієнта седиментації, який залежить як від щільності, так і від форми. Процес передбачає застосування різних рівнів відцентрової сили до зразків у буферизованих розчинах солей із певною щільністю. Структури з аналогічними коефіцієнтами седиментації будуть одночасно осідати на дні збірної трубки, що дозволить забезпечити їх відновлення.
Як диференціальне центрифугування використовується для виділення мітохондрій?
Диференціальне центрифугування дозволяє дослідникам ефективно відокремлювати мітохондріальні фракції від інших клітинних компонентів. Виділення мітохондрій включає кілька етапів центрифугування і подальше відновлення ізоляту.
Початкове центрифугування: Прикладіть низьку відцентрову силу до осадження великих клітинних залишків і ядер.
Подальші центрифугування: Поступово збільшуйте відцентрову силу до фракцій гранул, збагачених мітохондріями. На кожному етапі центрифугування видаляються структури з поступово вищими коефіцієнтами седиментації.
Відновлення фракції: Після кожного центрифугування гранули збираються, а супернатант піддається більш високим силам g, щоб виділити наступну фракцію. Так повторюється до тих пір, поки не буде досягнута бажана чистота мітохондрій.