Framställning av liposomer med ultraljud

Liposomer som framställs med ultraljud uppvisar mycket hög inkapslingseffektivitet, hög kapacitet att bära aktiva substanser samt en enhetlig, liten och sfärisk form. Därigenom erbjuder ultraljudsframställda liposomer utmärkt biotillgänglighet. Hielscher Ultrasonics erbjuder ultraljudsapparater för tillförlitlig framställning av liposomer av farmaceutisk kvalitet i satsvis och kontinuerlig drift.

Fördelar med liposomframställning med ultraljud

Liposomal inkapsling med ultraljud är en teknik som används för att kapsla in läkemedel eller andra terapeutiska substanser i liposomer med hjälp av ultraljudsenergi. Jämfört med andra metoder för liposomal inkapsling har inkapsling med ultraljud flera fördelar som gör den till den överlägsna framställningstekniken.

• Hög halt av aktiva substanser, hög inkapslingseffektivitet: Liposomframställning med ultraljud är välkänd för att ge liposomer med hög halt av aktiva substanser, t.ex. C-vitamin, läkemedelsmolekyler osv. Samtidigt uppvisar ultraljudsbehandlingen hög inkapslingseffektivitet. Detta innebär att en hög andel av den aktiva substansen kapslas in genom ultraljudsbehandling. Sammantaget gör detta ultraljudsbehandling till en mycket effektiv metod för liposomframställning.
• Enhetligt små liposomer: En fördel med liposomal inkapsling med ultraljud är förmågan att framställa mycket enhetliga liposomer med en snäv storleksfördelning. Ultraljudsenergi kan användas för att bryta upp större liposomer eller lipidaggregat till mindre, mer enhetliga liposomer. Detta ger större enhetlighet i liposomernas storlek och form, vilket kan vara viktigt vid läkemedelstillförsel där partiklarnas storlek kan påverka deras farmakokinetik och effekt.
• Tillämplig på alla molekyler: En annan fördel med liposomal inkapsling med ultraljud är förmågan att kapsla in ett brett spektrum av läkemedel och andra terapeutiska substanser. Tekniken kan användas för att kapsla in både hydrofila och hydrofoba läkemedel, vilket kan vara svårt med andra metoder. Dessutom kan ultraljudsenergi användas för att kapsla in makromolekyler och nanopartiklar, som kan vara för stora för att kapslas in med andra metoder.
• Snabb och tillförlitlig: Liposomal inkapsling med ultraljud är också en relativt enkel och snabb process. Den kräver inte användning av aggressiva kemikalier eller höga temperaturer, som kan skada de terapeutiska substanser som kapslas in.
• Uppskalning: Dessutom kan tekniken enkelt skalas upp för storskalig produktion, vilket gör den till ett kostnadseffektivt alternativ för läkemedelstillförsel.

Sammanfattningsvis är liposomal inkapsling med ultraljud en överlägsen teknik för liposomal inkapsling tack vare dess förmåga att framställa enhetliga liposomer med snäv storleksfördelning och kapsla in ett brett spektrum av terapeutiska substanser, samt dess enkelhet och skalbarhet.

Efter att en lipidfilm har bildats och därefter återhydrerats används ultraljudsbehandling för att främja inkapslingen av aktiva substanser i liposomen. Dessutom ger ultraljudsbehandlingen den önskade liposomstorleken.

Framställning av liposomer med ultraljud för läkemedel och kosmetika

Liposomer (lipidbaserade vesiklar), transferosomer (ultradeformerbara liposomer), etosomer (ultradeformerbara vesiklar med hög alkoholhalt) och niosomer (syntetiska vesiklar) är mikroskopiska vesiklar som kan framställas artificiellt som klotformiga bärare i vilka aktiva molekyler kan kapslas in. Dessa vesiklar med diametrar mellan 25 och 5000 nm används ofta som läkemedelsbärare inom läkemedels- och kosmetikindustrin, exempelvis för oral eller topikal läkemedelstillförsel, genterapi och immunisering. Ultraljudsbehandling är en vetenskapligt beprövad metod för mycket effektiv liposomframställning. Hielschers ultraljudsapparater framställer liposomer med höga halter av aktiva substanser och överlägsen biotillgänglighet.

Liposomer och liposomal formulering

Liposomer är unilamellära, oligolamellära eller multilamellära vesikulära system och består av samma material som ett cellmembran (lipiddubbelskikt). Utifrån sammansättning och storlek delas liposomer in enligt följande:

• multilamellära vesiklar (MLV, 0,1–10μm)
• små unilamellära vesiklar (SUV, <100 nm)
• stora unilamellära vesiklar (LUV, 100–500 nm)
• jättestora unilamellära vesiklar (GUV, ≥1 μm)

Liposomernas huvudstruktur består av fosfolipider. Fosfolipider har en hydrofil huvudgrupp och en hydrofob svansgrupp, som består av en lång kolvätekedja.
Liposommembranet har en sammansättning som är mycket lik hudbarriärens, vilket gör att liposomerna lätt kan integreras i människans hud. När liposomerna smälter samman med huden kan de frigöra de inneslutna ämnena direkt på målplatsen, där de aktiva ämnena kan utöva sina funktioner. Därigenom förbättrar liposomerna hudens genomtränglighet/permeabilitet för de inneslutna farmaceutiska och kosmetiska ämnena. Även liposomer utan inkapslade ämnen, de tomma vesiklarna, är potenta aktiva ämnen för huden, eftersom fosfatidylkolin innehåller två essentiella ämnen som människokroppen inte kan producera själv: linolsyra och kolin.
Liposomer används som biokompatibla bärare av läkemedel, peptider, proteiner, plasmiskt DNA, antisensoligonukleotider eller ribozymer för farmaceutiska, kosmetiska och biokemiska ändamål. Den enorma variationsrikedomen i partikelstorlek och lipidernas fysikaliska parametrar ger en attraktiv potential att konstruera skräddarsydda bärare för ett brett spektrum av tillämpningar. (Ulrich 2002)

Bildning av liposomer med ultraljud

Liposomer kan bildas med hjälp av ultraljud. Grundmaterialet för framställning av liposomer är amfifila molekyler som härrör från eller är baserade på biologiska membranlipider. För att bilda små unilamellära vesiklar (SUV) behandlas lipiddispersionen varsamt med ultraljud – exempelvis med den handhållna ultraljudsapparaten UP50H (50W, 30kHz), VialTweeter eller ultraljudsreaktorn CupHorn – i ett isbad. En sådan ultraljudsbehandling varar cirka 5 – 15 minuter. En annan metod för att framställa små unilamellära vesiklar är ultraljudsbehandling av multilamellära liposomvesiklar.
Dinu-Pirvu et al. (2010) rapporterar framställning av transferosomer genom ultraljudsbehandling av MLV vid rumstemperatur.
Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudsapparater, sonotroder och tillbehör och kan därmed tillhandahålla den lämpligaste ultraljudsutrustningen för högeffektiv liposominkapsling i alla skalor.

Inkapsling av aktiva substanser i liposomer med ultraljud

Liposomer fungerar som bärare för aktiva ingredienser såsom vitaminer, terapeutiska molekyler, peptider etc. Ultraljud är ett effektivt verktyg för att framställa och bilda liposomer för inneslutning av aktiva ämnen. Samtidigt underlättar ultraljudsbehandlingen inkapslings- och inneslutningsprocessen, så att liposomer med hög halt av aktiva ingredienser framställs. Före inkapslingen tenderar liposomerna att bilda kluster på grund av växelverkan mellan ytladdningarna hos fosfolipidernas polära huvuden (jfr Míckova et al. 2008), och de måste dessutom öppnas. Som exempel beskriver Zhu et al. (2003) inkapsling av biotinpulver i liposomer genom ultraljudsbehandling. När biotinpulvret hade tillsatts till lösningen med vesikelsuspensionen behandlades lösningen med ultraljud. Efter denna behandling var biotinet inneslutet i liposomerna.
Läs mer om inkapsling av GLP-1-peptider (t.ex. semaglutid) i liposomer med ultraljud!

Liposomala emulsioner med ultraljudsbehandling

För att förstärka den vårdande effekten hos fuktgivande krämer eller anti-aging-krämer, lotioner, geler och andra kosmeceutiska formuleringar tillsätts emulgeringsmedel till de liposomala dispersionerna för att stabilisera större mängder lipider. Undersökningar har dock visat att liposomernas kapacitet generellt är begränsad. Vid tillsats av emulgeringsmedel uppträder denna effekt tidigare, och de extra emulgeringsmedlen försvagar fosfatidylkolinets affinitet till hudbarriären. Nanopartiklar – som består av fosfatidylkolin och lipider – är lösningen på detta problem. Dessa nanopartiklar utgörs av en oljedroppe som är täckt av ett monolager av fosfatidylkolin. Användningen av nanopartiklar möjliggör formuleringar som kan ta upp mer lipider och förbli stabila, så att ytterligare emulgeringsmedel inte behövs.
Ultraljudsbehandling är en beprövad metod för framställning av nanoemulsioner och nanodispersioner. Högintensivt ultraljud tillför den effekt som behövs för att dispergera en vätskefas (dispergerad fas) i små droppar i en andra fas (kontinuerlig fas). I dispergeringszonen orsakar imploderande kavitationsbubblor intensiva stötvågor i den omgivande vätskan och ger upphov till vätskestrålar med hög hastighet. För att stabilisera de nybildade dropparna i den dispergerade fasen mot koalescens tillsätts emulgeringsmedel (ytaktiva ämnen, tensider) och stabilisatorer till emulsionen. Eftersom dropparnas koalescens efter sönderdelningen påverkar den slutliga droppstorleksfördelningen används effektivt stabiliserande emulgeringsmedel för att bibehålla den slutliga droppstorleksfördelningen på en nivå som motsvarar fördelningen omedelbart efter droppsönderdelningen i ultraljudets dispergeringszon.

Liposomala dispersioner med ultraljudsbehandling

Liposomala dispersioner som baseras på omättat fosfatidylklorin har bristande stabilitet mot oxidation. Dispersionen kan stabiliseras med antioxidanter, exempelvis med ett komplex av vitamin C och E.
 

Liposombildning genom omvänd fasindunstning med ultraljudsbehandling

 
Ortan et al. (2002) uppnådde goda resultat i sin studie om framställning av eterisk olja från Anethum graveolens i liposomer med ultraljud. Efter ultraljudsbehandlingen var liposomernas storlek mellan 70–150 nm och för MLV mellan 230–475 nm; dessa värden var ungefär konstanta även efter 2 månader, men ökade efter 12 månader, särskilt i SUV-dispersionen (se histogrammen nedan). Stabilitetsmätningen, som avsåg förlust av eterisk olja och storleksfördelning, visade också att de liposomala dispersionerna bibehöll innehållet av flyktig olja. Detta tyder på att inkapslingen av den eteriska oljan i liposomer ökade oljans stabilitet.

Ortan et al. (2009): Stabilitet hos MLV- och SUV-dispersioner efter 1 år. Liposomala formuleringar förvarades vid 4±1 ºC.

Hielschers ultraljudsprocessorer är idealiska apparater för tillämpningar inom kosmetika- och läkemedelsindustrin. System som består av flera ultraljudsprocessorer på upp till 16 000 watt vardera ger den kapacitet som behövs för att omvandla denna laboratorietillämpning till en effektiv produktionsmetod för att erhålla findispergerade emulsioner i kontinuerligt flöde eller satsvis – med resultat som är jämförbara med dem från dagens bästa tillgängliga högtryckshomogenisatorer, såsom strypventiler. Utöver denna höga effektivitet vid kontinuerlig emulgering kräver Hielschers ultraljudsapparater mycket lite underhåll och är mycket enkla att använda och rengöra. Ultraljudet bidrar faktiskt till rengöringen och sköljningen. Ultraljudseffekten är justerbar och kan anpassas till specifika produkter och emulgeringskrav. Särskilda flödescellsreaktorer som uppfyller de avancerade kraven för CIP (rengöring på plats) och SIP (sterilisering på plats) finns också tillgängliga.

Vanliga frågor om liposomer

Vilka typer av liposomer skiljer man mellan?

Liposomer klassificeras i olika typer utifrån sin storlek och antalet dubbelskikt de innehåller. Dessa kategorier omfattar:

• Små unilamellära vesiklar (SUV): Dessa är de minsta liposomerna och har ett enda lipiddubbelskikt.
• Stora unilamellära vesiklar (LUV): Dessa är större än SUV och har också ett enda dubbelskikt.
• Multilamellära vesiklar (MLV): Dessa innehåller flera koncentriska dubbelskikt.
• Multivesikulära vesiklar (MVV): Dessa består av flera mindre vesiklar inuti en större vesikel.

 
Andra specialiserade typer omfattar:

• PEGylerade liposomer: Liposomer modifierade med polyetylenglykol (PEG) för att förbättra stabiliteten och förlänga cirkulationstiden.
• Nanoliposomer: Mycket små liposomer som vanligtvis används för riktad läkemedelstillförsel.

Vilka vesikelstrukturer kan liposomer uppvisa?

Liposomer delas dessutom in i sju huvudtyper utifrån sin vesikelstruktur:

• Stora multilamellära vesiklar (MLV): Innehåller flera dubbelskikt.
• Oligolamellära vesiklar (OLV): Har ett fåtal dubbelskikt.
• Små unilamellära vesiklar (SUV): De minsta, med ett enda dubbelskikt.
• Medelstora unilamellära vesiklar (MUV): Medelstora, med ett enda dubbelskikt.
• Stora unilamellära vesiklar (LUV): Större, med ett enda dubbelskikt.
• Jättelika unilamellära vesiklar (GUV): Mycket stora, med ett enda dubbelskikt.
• Multivesikulära vesiklar (MVV): Flera vesiklar inuti en enda stor vesikel.

Vilka är skillnaderna mellan liposomer och niosomer?

Liposomer och niosomer skiljer sig främst åt i sin sammansättning:
Liposomer: Tillverkas av fosfolipider med två kedjor, vilka kan vara antingen neutrala eller laddade.
Niosomer: Tillverkas av oladdade tensider med en kedja och kolesterol.
Båda strukturerna bildas genom ultraljudsbehandling, som främjar bildningen av vesiklar med dubbelskikt.

Vilken är den idealiska storleken på en liposom?

För terapeutisk tillförsel är den idealiska storleken på en liposom teoretiskt sett mellan 50 och 200 nanometer i diameter. Detta storleksintervall optimerar stabiliteten och biotillgängligheten. Ultraljudsbehandling används ofta för att minska vesikeln till önskad storlek.

Kan liposomer transportera hydrofila läkemedel?

Ja, liposomer kan transportera hydrofila läkemedel. De uppskattas inom biomedicinska tillämpningar för sin förmåga att kapsla in både hydrofoba och hydrofila ämnen. Dessutom har de hög biokompatibilitet och biologisk nedbrytbarhet, vilket gör dem till effektiva tillförselsystem.

Hur tillverkar man liposomer?

De vanligaste teknikerna för framställning av liposomer är tunnfilmsmetoden och metoden med omvänd fasavdunstning.
Tunnfilmshydratiseringsmetoden:

1. Lös upp lipider i ett organiskt lösningsmedel.
2. Avdunsta lösningsmedlet så att en tunn lipidfilm bildas.
3. Hydratisera filmen med en vattenlösning under ultraljudsbehandling för att bilda multilamellära vesiklar.

Metoden med omvänd fasavdunstning:

1. Lös upp lipider i vatten och etanol.
2. Ultraljudsbehandla lösningen vid 60°C i cirka 10 minuter för att skapa en lipidpasta.
3. Kyl lipidsuspensionen och tillsätt vatten eller buffert droppvis under omrörning.
4. Hydratisera suspensionen i 1 timme för att bilda multilamellära vesiklar.
5. Minska liposomstorleken genom ytterligare ultraljudsbehandling.

Vad är arkeosomer?

Arkeosomer är liposomer tillverkade av lipider från arkéer, vilka är kända för sin stabilitet och motståndskraft mot extrema förhållanden. Dessa egenskaper gör arkeosomer särskilt användbara för läkemedelstillförsel och vaccinutveckling i krävande miljöer.

Hur framställs arkeosomer?

Förfarande för ultraljudsbehandling enligt Pise (2022): Arkeosomer kan framställas från den polära lipidfraktionen ”PLF” från Sulfolobussolfataricus genom ultraljudsbehandling vid 60°C utan behov av extern tillförsel av lipider. Vid 0°C ultraljudsbehandlades polära lipider från Sulfolobusacidocaldarius effektivt för att bilda arkeosomer. BMD-laddade arkeosomer och konventionella liposomer, liksom arkeala lipider isolerade från arkéen H. salinarum och berikade med fosfatidylkolin, framställdes med hjälp av ultraljudstekniker. Ultraljudsbehandlade vesiklar skapades för topikal administrering genom att MLV-dispersioner ultraljudsbehandlades vid 80 procents amplitud i 4 minuter med en ultraljudsapparat av sondtyp, Hielscher UP50H (se bilden till vänster).

Litteratur/referenser

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.