Ultraljudsbehandling-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) är en effektiv metod för att infektera växtceller med främmande gener med Agrobacterium som transportör. Ultraljud kavitation orsakar sonoporation, som kan beskrivas som riktade mikrosår av växtvävnad. Via dessa ultraljud skapar mikrosår, DNA och DNA vektorer kan effektivt transporteras in i cellmatrisen.

sonoporation – Ultraljud förbättrad celltransformation

När lågfrekvent ultraljud (ca 20 kHz) appliceras på cellsuspensioner orsakar effekterna av akustisk kavitation en övergående membrangenomträngning på cellvävnader. Denna ultraljudseffekt är känd som sonoporation och används för genöverföring till celler eller vävnader.
Fördelarna med ultraljud är baserade på dess icke-termiska mekaniska arbetsprincip, vilket gör ultraljudsbehandling ofta mer mångsidig och mindre beroende av celltyper. Den mångsidiga tillämpningen av sonoporation öppnar möjligheten att utnyttja transgena växter, som har betydande potential i bioproduktionen av komplexa humana terapeutiska proteiner. Sådana växtbaserade bioreaktorer kan lätt manipuleras genetiskt, förhindra potentiell kontaminering med mänskliga patogener, skadar inte transformationsförmedlande bakterier (t.ex. Agrobacterium) och är en billig, effektiv metod för biosyntes.

Ultraljudsassisterad celltransformation

Ultraljudsbehandling är en teknik som tillämpar lågfrekventa ultraljudsvågor för att agitera partiklar i lösning, för att blanda lösningar, vilket ökar hastigheten för massöverföring och upplösning. Samtidigt kan ultraljudsbehandling ta bort upplösta gaser från vätskor. I växttransformation, ultraljudsbehandling kommer att orsaka bildandet av mikrowounds på växtvävnad och förbättra leveransen av naken DNA i växten protoplast.

För genetisk transformation är ultraljudsbehandling-Assisted Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) den föredragna metoden och har en betydligt högre effektivitet än ultraljudsbehandling som används för att överföra nakna DNA- och DNA-vektorer direkt in i protoplasten. Många studier har visat att ultraljudsbehandling assisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) kan användas för att inducera mekanisk störning och bildning av sår på växtceller av ultraljudsvågor och den resulterande akustiska kavitationen. En kort ultraljudsbehandling skapar mikrosår på ytan av explants. Eftersom de sårade cellerna kommer att tillåta penetrering av Agrobacterium i den djupare delen av växtvävnader, vilket ökar sannolikheten för att växtceller infekteras. Dessutom förbättrar de utsöndrade fenolföreningarna transformationen. De ultraljudsgenererade mikrosåren gör explantpenetration av bakterier också mer genomförbart. SAAT användes framgångsrikt för genetisk omvandling hos växtarter som särskilt anses vara resistenta mot Agrobacterium.
Att vara en mycket enkel och billig metod, liksom den betydande förbättringen av Agrobacterium-medierad genöverföring är de stora fördelarna med SAAT. Förutom framgångsrik tillämpning av SAAT vid omvandling av Chenopodium rubrum L. och Beta vulgaris L., har detta tillvägagångssätt också tillämpats vid framställning av rekombinanta Escherichia coli vildtyp värmelabila holotoxin och Escherichia coli mutanta LT-vaccinadjuvanser i Nicotiana tabacum, där de högsta systemiska LT-B-specifika IgG-titrarna detekterades hos fåglar.
(jfr Laere m.fl., 2016; M. Klimek-Chodacka och R. Baranski, 2014)

Allmän procedur för genöverföring via sonoporation i växtceller

1. Beredning av genetiskt material: Börja med att förbereda det genetiska materialet du vill införa i växtcellerna. Detta kan vara plasmid-DNA, RNA eller andra nukleinsyror.
2. Isolering av växtceller: Isolera de växtceller du vill rikta in dig på. Beroende på ditt experiment kan dessa celler isoleras från växtvävnader eller kulturer.
3. Cellsuspension: Suspendera växtcellerna i ett lämpligt medium eller buffert. Detta är viktigt för att säkerställa att cellerna är friska och i ett tillstånd som främjar genupptag.
4. Ställ in din Sonicator: Förbered din sond-typ sonicator genom ultraljudsbehandling förinställning parametrar såsom amplitud, tid, energi, och temperatur. Fördjupa ultraljudssonden i cellsuspensionen.
5. Ultraljudsbehandling Starta ultraljudsbehandling förfarandet. Den snabba svängningen av sondspetsen genererar kavitationsbubblor i vätskan. Dessa bubblor expanderar och kollapsar på grund av ultraljudsvågorna, vilket skapar mekaniska krafter och mikrostreaming i suspensionen.
6. Sonoporation: De mekaniska krafterna och mikroströmningen som genereras av kavitation skapar tillfälligt porer och hål i växtcellernas membran. Det genetiska materialet som finns i suspensionen kan komma in i växtcellerna genom dessa porer.
7. Inkubation: Efter sonoporation behandling, inkubera växtcellerna så att de kan återhämta sig och stabilisera sina membran. Detta är ett avgörande steg för att säkerställa cellöverlevnad och framgångsrik genöverföring.

Genöverföring via Agrobacterium eller liposomer

Det finns två vanliga former för att transfektera växtceller. De använder antingen agrobacterium, ett släkte av gramnegativa bakterier, eller liposomer som bärare av det genetiska materialet.

• Agrobacterium-medierad Sonoporation: Agrobacterium tumefaciens är en bakterie som vanligtvis används inom växtgenteknik. I denna metod införs plasmid-DNA innehållande den önskade genen i Agrobacterium, som sedan blandas med växtceller. Cellsuspensionen utsätts för sonoporation med hjälp av en sond-typ sonicator. Ultraljud energi förbättrar överföringen av det genetiska materialet från Agrobacterium till växtcellerna. Denna metod används ofta för genetisk modifiering av växter.
• Liposom-medierad Sonoporation: Liposomer är lipidbaserade vesiklar som kan bära genetiskt material. I denna metod blandas liposomer laddade med plasmid-DNA eller andra nukleinsyror med växtceller. Sonoporation med hjälp av en sond-typ sonicator används för att underlätta upptaget av liposomer av växtceller. Ultraljudet stör liposomernas lipidlager och frigör det genetiska materialet i växtcellerna. Detta tillvägagångssätt är användbart för övergående genuttrycksstudier i växtceller.

Vetenskapligt bevisade fördelar med ultraljudsbehandling-assisted Agrobacterium-medierad transformation (SAAT)

Ultraljudsbehandling-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) har tillämpats på många växtarter. En kort och relativt mild ultraljudsbehandling av växtcellkulturer orsakar sonoporation, vilket därefter möjliggör en djup penetration av Agrobacterium som gentransportör. Nedan kan du läsa exemplifierande studier som visar de positiva effekterna av SAAT.

Ultraljud-assisterad transformation av Ashwagandha

För att förbättra transformationseffektiviteten i W. somnifera (känd som ashwagandha eller vinterkörsbär) undersökte Dehdashti och kollegor (2016) användningen av acetosyringon (AS) och ultraljudsbehandling.
Acetosyringon (AS) tillsattes i tre steg: Agrobacterium liquid culture, Agrobacterium infection och co-culture of explants with Agrobacterium. Tillsatsen av 75 μM AS till Agrobacterium flytande odling visade sig vara optimal för induktion av virgener.
Den ytterligare tillämpningen av ultraljudsbehandling (SAAT) resulterade i högsta genuttryck. GusA-genuttrycket i håriga rötter visade sig vara bäst när bladen och skottspetsarna sonikerades i 10 respektive 20-talet. Transformationseffektiviteten för det förbättrade protokollet registrerades 66,5 respektive 59,5% för blad- respektive skottspetsutplanteringar. Jämfört med andra protokoll visade sig transformationseffektiviteten för detta förbättrade protokoll vara 2,5 gånger högre för löv och 3,7 gånger mer för skottspetsar. Southern blot-analyser bekräftade 1–2 kopior av gusA-transgenen i linjerna W1-W4, medan 1–4 transgenkopior detekterades i linjen W5 som genererades av det förbättrade protokollet.

Effekten av varaktigheten av ultraljudsbehandling-assisterad Agrobacterium- medierad transformation (SAAT) på transformationsfrekvensen av W. somnifera blad (a) och skottspets (b) explants
(studie och grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Ultraljud-assisterad transformation av bomull

(2007) visa de positiva effekterna av ultraljudsbehandling-assisterad bomullstransformation. Akustisk kavitation orsakad av lågfrekvent ultraljud skapar mikrosår på och under ytan av växtvävnad (sonoporation) och gör att Agrobacterium kan resa djupare och helt genom växtvävnaden. Detta sårande sätt ökar sannolikheten för att infektera växtceller som ligger djupare i vävnad. För att utvärdera transformationseffektiviteten hos SAAT mättes GUS-genuttryck. GUS reportersystem är ett reportergensystem, särskilt användbart inom växtmolekylärbiologi och mikrobiologi. Justering av olika SAAT-parametrar förbättrades GUS-transientuttryck i bomull med mogna embryon som explantat avsevärt. GUS detekterades först 24 timmar efter inkubation av explantaten och vid 48h var GUS-uttrycket mycket intensivt vilket fungerade som en användbar indikator på framgångsrik omvandling av bomullsexplantet efter ultraljudsbehandling assisterad Agrobacterium medierad transformation (SAAT). Jämförelsen av olika transformationstekniker (nämligen biolistisk, Agro, BAAT, SAAT), ultraljudsbehandling-assisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) visade överlägset de bästa resultaten av transformation.

Val av omvandlingsförfarande på grundval av transient uttryck av GUS. Ultraljudsbehandling-assisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) visar en betydligt högre transient uttryck.
(studie och grafik: © Hussain et al., 2007)

Högpresterande ultraljudslösningar för sonoporation och SAAT

Hielscher Ultrasonics har lång erfarenhet av utveckling och tillverkning av högpresterande ultrasonicators för laboratorier, forskningsanläggningar samt industriell produktion med mycket höga genomströmningar. För mikrobiologi och life science erbjuder Hielscher olika lösningar för att tillgodose olika krav som är nödvändiga för specifika vävnader och deras behandlingar. För samtidig ultraljud av många prover Hielscher erbjuder UIP400MTP för multiwell plattor, VialTweeter för ultraljudsbehandling av upp till 10 injektionsflaskor (t.ex. Eppendorf rör) eller ultraljud CupHorn. Probe-typ ultrasonicators är tillgängliga från 50 till 400 watt som lab homogenisatorer, medan industriella system täcker effektområdet från 500 watt till 16kW.
Vänligen kontakta oss och låt oss veta om dina ansöknings- och processkrav. Vår väl erfarna personal kommer gärna att rekommendera den mest lämpliga ultrasonicator för din biologiska process.
Nedanstående tabell ger dig en indikation på hur mycket våra ultraljudsapparater kan hantera: