Genetisk transformation i växtceller med hjälp av ultraljud

Ultraljudsbehandling-assisterad Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) är en effektiv metod för att infektera växtceller med främmande gener med hjälp av Agrobacterium som transportör. Ultraljudskavitation orsakar sonoporation, vilket kan beskrivas som riktad mikroskada av växtvävnad. Via dessa ultraljudsskapade mikrosår kan DNA och DNA-vektorer effektivt transporteras in i cellmatrisen.

Sonoporation – Ultraljudsförbättrad cellomvandling

När lågfrekvent ultraljud (ca 20 kHz) appliceras på cellsuspensioner, orsakar effekterna av akustisk kavitation en transient membranpermeabilisering på cellvävnader. Denna ultraljudseffekt är känd som sonoporation och används för genöverföring till celler eller vävnader.
Fördelarna med ultraljud är baserade på dess icke-termiska mekaniska arbetsprincip, vilket gör ultraljudsbehandling ofta mer mångsidig och mindre beroende av celltyper. Den mångsidiga tillämpningen av sonoporation öppnar möjligheten för användning av transgena växter, som har betydande potential i bioproduktionen av komplexa humanterapeutiska proteiner. Sådana växtbaserade bioreaktorer kan lätt manipuleras genetiskt, förhindra potentiell kontaminering med mänskliga patogener, skadar inte omvandlingsmedierande bakterier (t.ex. Agrobacterium) och är en billig och effektiv metod för biosyntes.

Ultraljudsassisterad cellomvandling

Ultraljudsbehandling är en teknik som tillämpar lågfrekventa ultraljudsvågor för att röra om partiklar i lösning, för att blanda lösningar, vilket ökar massöverföringshastigheten och upplösningshastigheten. Samtidigt kan ultraljudsbehandling ta bort upplösta gaser från vätskor. I växt-transformation, ultraljudsbehandling kommer att orsaka bildandet av mikrosår på växtvävnad och förbättra leveransen av naket DNA in i växtprotoplasten.

För genetisk omvandling, Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) är den föredragna metoden och har en betydligt högre effektivitet än ultraljudsbehandling som används för att överföra naket DNA och DNA-vektorer direkt in i protoplasten. Många studier har visat att ultraljudsbehandling assisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) kan användas för att inducera mekanisk störning och bildning av sår på växtceller genom ultraljudsvågor och den resulterande akustiska kavitationen. En kort ultraljudsbehandling skapar mikrosår på ytan av explantor. Eftersom de skadade cellerna kommer att tillåta penetration av Agrobacterium i den djupare delen av växtvävnader, vilket ökar sannolikheten för att växtceller infekteras. Dessutom förbättrar de utsöndrade fenolföreningarna omvandlingen. De ultraljudsgenererade mikrosåren gör det också mer möjligt för bakterier att tränga igenom. SAAT användes framgångsrikt för genetisk transformation hos växtarter som särskilt ansågs vara resistenta mot Agrobacterium.
Eftersom det är en mycket enkel och billig metod, liksom den betydande förbättringen av Agrobacterium-medierad genöverföring är de stora fördelarna med SAAT. Förutom framgångsrik tillämpning av SAAT i omvandlingen av Chenopodium rubrum L. och Beta vulgaris L., har detta tillvägagångssätt också tillämpats vid produktion av rekombinanta Escherichia coli värmelabila holotoxin av vildtyp och Escherichia coli-mutanta LT-vaccinadjuvans i Nicotiana tabacum, där de högsta systemiska LT-B-specifika IgG-titrar detekterades hos fåglar.
(jfr Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka och R. Baranski, 2014)

Allmän procedur för genöverföring via sonoporation i växtceller

1. Beredning av genetiskt material: Börja med att förbereda det genetiska material som du vill föra in i växtcellerna. Detta kan vara plasmid-DNA, RNA eller andra nukleinsyror.
2. Isolering av växtceller: Isolera de växtceller du vill rikta in dig på. Beroende på ditt experiment kan dessa celler isoleras från växtvävnader eller kulturer.
3. Cellsuspension: Häng upp växtcellerna i ett lämpligt medium eller buffert. Detta är viktigt för att säkerställa att cellerna är friska och i ett tillstånd som främjar genupptag.
4. Ställ in din Sonicator: Förbered din sond-typ sond typ sond sond förinställda parametrar såsom amplitud, tid, energi och temperatur. Sänk ner ultraljudssonden i cellsuspensionen.
5. Ultraljudsbehandling: Starta ultraljudsbehandlingen. Den snabba svängningen av sondspetsen genererar kavitationsbubblor i vätskan. Dessa bubblor expanderar och kollapsar på grund av ultraljudsvågorna, vilket skapar mekaniska krafter och mikroströmning i suspensionen.
6. Sonoporation: De mekaniska krafterna och mikroströmningen som genereras av kavitation skapar tillfälligt porer och hål i växtcellernas membran. Det genetiska materialet som finns i suspensionen kan komma in i växtcellerna genom dessa porer.
7. Inkubation: Efter sonoporationsbehandlingen, inkubera växtcellerna så att de kan återhämta sig och stabilisera sina membran. Detta är ett avgörande steg för att säkerställa cellöverlevnad och framgångsrik genöverföring.

Genöverföring via agrobacterium eller liposomer

Det finns två vanliga former av transfekt av växtceller. De använder antingen agrobacterium, ett släkte av gramnegativa bakterier, eller liposomer som bärare av det genetiska materialet.

• Agrobacterium-medierad sonoporation: Agrobacterium tumefaciens är en bakterie som ofta används inom växtgenteknik. I denna metod förs plasmid-DNA som innehåller den önskade genen in i Agrobacterium, som sedan blandas med växtceller. Cellsuspensionen utsätts för sonoporation med hjälp av en sond-typ sonikator. Ultraljudsenergin förbättrar överföringen av det genetiska materialet från Agrobacterium till växtcellerna. Denna metod används i stor utsträckning för genetisk modifiering av växter.
• Liposommedierad sonoporation: Liposomer är lipidbaserade vesiklar som kan bära genetiskt material. I denna metod blandas liposomer laddade med plasmid-DNA eller andra nukleinsyror med växtceller. Sonoporation med hjälp av en sond-typ sonikator används för att underlätta upptaget av liposomer av växtceller. Ultraljudet stör lipiddubbelskikten i liposomerna och släpper ut det genetiska materialet i växtcellerna. Detta tillvägagångssätt är användbart för studier av transienta genuttryck i växtceller.

Vetenskapligt bevisade fördelar med ultraljudsbehandling-assisterad agrobacterium-medierad transformation (SAAT)

Ultraljudsbehandling-assisterad agrobacterium-medierad transformation (SAAT) har tillämpats på många växtarter. En kort och relativt mild ultraljudsbehandling av växtcellkulturer orsakar sonoporation, vilket därefter möjliggör en djup penetration av Agrobacterium som gentransportör. Nedan kan du läsa exemplifierande studier som visar de positiva effekterna av SAAT.

Ultraljudsassisterad omvandling av Ashwagandha

För att förbättra omvandlingseffektiviteten hos W. somnifera (känd som ashwagandha eller vinterkörsbär) undersökte Dehdashti och kollegor (2016) användningen av acetosyringon (AS) och ultraljudsbehandling.
Acetosyringon (AS) tillsattes i tre steg: Agrobacterium liquid culture, Agrobacterium infection och samodling av explantat med Agrobacterium. Tillsats av 75 μM AS till Agrobacterium liquid culture visade sig vara optimalt för induktion av virgener.
Den ytterligare tillämpningen av ultraljudsbehandling (SAAT) resulterade i högsta genuttryck. GusA-genuttrycket i håriga rötter visade sig vara bäst när bladen och skottspetsarna sonikerades för 10 respektive 20-talet. Omvandlingseffektiviteten för det förbättrade protokollet registrerades 66,5 och 59,5 % för blad- respektive skottspetsexplantering. Jämfört med andra protokoll visade det sig att omvandlingseffektiviteten för detta förbättrade protokoll var 2,5 gånger högre för löv och 3,7 gånger högre för skottspetsar. Southern blot-analyser bekräftade 1–2 kopior av gusA-transgenen i linjerna W1-W4, medan 1–4 transgenkopior detekterades i linjen W5 som genererades av det förbättrade protokollet.

Effekten av varaktigheten av ultraljudsbehandlingsassisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) på transformationsfrekvensen av W. somnifera blad (a) och skottspets (b) explantat
(studie och grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Ultraljudsassisterad omvandling av bomull

Hussain et al. (2007) visa de positiva effekterna av ultraljudsbehandling-assisterad bomullsomvandling. Akustisk kavitation orsakad av lågfrekvent ultraljud skapar mikrosår på och under ytan av växtvävnad (sonoporation) och gör det möjligt för Agrobacterium att färdas djupare och fullständigt genom växtvävnaden. Detta sårande sätt ökar sannolikheten för att infektera växtceller som ligger djupare i vävnaden. För att utvärdera transformationseffektiviteten av SAAT mättes GUS-genuttrycket. GUS-rapportörssystemet är ett rapportörgensystem, särskilt användbart inom växtmolekylärbiologi och mikrobiologi. Genom att justera olika SAAT-parametrar förbättrades GUS transienta uttryck i bomull med hjälp av mogna embryon som explantat signifikant. GUS upptäcktes först 24 timmar efter inkubation av explantaten och vid 48 timmar var GUS-uttrycket mycket intensivt, vilket fungerade som en användbar indikator på framgångsrik omvandling av bomullsplantan efter ultraljudsbehandling assisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT). Jämförelsen av olika transformationstekniker (nämligen biolistisk, Agro, BAAT, SAAT), ultraljudsassisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) visade de överlägset bästa resultaten av transformation.

Val av transformationsprocedur på grundval av transient uttryck av GUS. Ultraljudsbehandling assisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) visar en betydligt högre transient uttryck.
(studie och grafik: © Hussain et al., 2007)

Högpresterande ultraljudslösningar för sonoporation och SAAT

Hielscher Ultrasonics har lång erfarenhet av utveckling och tillverkning av högpresterande ultraljudsapparater för laboratorier, forskningsanläggningar samt industriell produktion med mycket höga genomströmningar. För mikrobiologi och biovetenskap erbjuder Hielscher olika lösningar för att tillgodose olika krav som är nödvändiga för specifika vävnader och deras behandlingar. För samtidig ultraljud av många prover Hielscher erbjuder UIP400MTP för multibrunn plattor, VialTweeter för ultraljudsbehandling av upp till 10 ampuller (t.ex. Eppendorf rör) eller ultraljud CupHorn. Ultraljudsapparater av sondtyp finns tillgängliga från 50 till 400 watt som laboratoriehomogenisatorer, medan industriella system täcker effektområdet från 500 watt till 16 kW.
Vänligen kontakta oss och låt oss veta om dina applikations- och processkrav. Vår välerfarna personal rekommenderar gärna den mest lämpliga ultraljudsapparaten för din biologiska process.
Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater: