Genetisk transformation i växtceller med ultraljud

Ultraljudsassisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) är en effektiv metod för att infektera växtceller med främmande gener med Agrobacterium som transportör. Ultraljudskavitation orsakar sonoporation, vilket kan beskrivas som riktad bildning av mikrosår i växtvävnad. Genom dessa mikrosår som skapas med ultraljud kan DNA och DNA-vektorer effektivt transporteras in i cellmatrisen.

Sonoporation – ultraljudsförstärkt celltransformation

När lågfrekvent ultraljud (cirka 20kHz) appliceras på cellsuspensioner orsakar effekterna av akustisk kavitation en övergående permeabilisering av membranen i cellvävnader. Denna ultraljudseffekt kallas sonoporation och används för genöverföring till celler eller vävnader.
Fördelarna med ultraljudsbehandling bygger på dess icke-termiska mekaniska verkningsprincip, vilket ofta gör ultraljudsbehandling mer mångsidig och mindre beroende av celltyp. Den mångsidiga tillämpningen av sonoporation öppnar möjligheten att använda transgena växter, som har betydande potential för bioproduktion av komplexa humana terapeutiska proteiner. Sådana växtbaserade bioreaktorer kan enkelt manipuleras genetiskt, förhindrar potentiell kontaminering med humana patogener, skadar inte bakterier som medierar transformationen (t.ex. Agrobacterium) och utgör en billig och effektiv metod för biosyntes.

Ultraljudsassisterad celltransformation

Ultraljudsbehandling är en teknik där lågfrekventa ultraljudsvågor används för att sätta partiklar i rörelse i en lösning och blanda lösningar, vilket ökar hastigheten för massöverföring och upplösning. Samtidigt kan ultraljudsbehandling avlägsna lösta gaser ur vätskor. Vid växttransformation orsakar ultraljudsbehandling bildning av mikrosår i växtvävnad och förbättrar tillförseln av naket DNA till växtprotoplasten.

För genetisk transformation är ultraljudsassisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) den föredragna metoden och har en betydligt högre effektivitet än ultraljudsbehandling som används för att överföra naket DNA och DNA-vektorer direkt till protoplasten. Många studier har visat att ultraljudsassisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) kan användas för att framkalla mekanisk sönderdelning och sårbildning i växtceller genom ultraljudsvågor och den resulterande akustiska kavitationen. En kort ultraljudsbehandling skapar mikrosår på explantatens yta. De sårade cellerna gör det möjligt för Agrobacterium att tränga in i djupare delar av växtvävnaden, vilket ökar sannolikheten för att växtceller infekteras. Dessutom förbättrar de utsöndrade fenolföreningarna transformationen. De mikrosår som skapas med ultraljud gör det också lättare för bakterier att tränga in i explantaten. SAAT har framgångsrikt använts för genetisk transformation i växtarter som särskilt betraktas som resistenta mot Agrobacterium.
De främsta fördelarna med SAAT är att metoden är mycket enkel och billig samt att den avsevärt förbättrar Agrobacterium-medierad genöverföring. Utöver framgångsrik användning av SAAT vid transformation av Chenopodium rubrum L. och Beta vulgaris L. har denna metod även tillämpats vid produktion av rekombinant värmelabilt holotoxin av vildtyp från Escherichia coli och vaccinadjuvans baserade på muterat LT från Escherichia coli i Nicotiana tabacum, där de högsta systemiska LT-B-specifika IgG-titrarna påvisades hos fåglar.
(jfr Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka och R. Baranski, 2014)

Allmänt förfarande för genöverföring via sonoporation i växtceller

1. Beredning av genetiskt material: Börja med att bereda det genetiska material som du vill föra in i växtcellerna. Det kan vara plasmid-DNA, RNA eller andra nukleinsyror.
2. Isolering av växtceller: Isolera de växtceller du vill behandla. Beroende på ditt experiment kan dessa celler isoleras från växtvävnader eller kulturer.
3. Cellsuspension: Suspendera växtcellerna i ett lämpligt medium eller en lämplig buffert. Detta är nödvändigt för att säkerställa att cellerna är friska och i ett tillstånd som främjar genupptag.
4. Ställ in din sonikator: Förbered din sonikator av sondtyp genom att förinställa sonikeringsparametrar som amplitud, tid, energi och temperatur. Sänk ned ultraljudssonden i cellsuspensionen.
5. Sonikering: Starta sonikeringen. Sondspetsens snabba svängningar genererar kavitationsbubblor i vätskan. Dessa bubblor expanderar och kollapsar på grund av ultraljudsvågorna, vilket skapar mekaniska krafter och mikroströmning i suspensionen.
6. Sonoporation: De mekaniska krafter och den mikroströmning som genereras av kavitation skapar tillfälliga porer och hål i växtcellernas membran. Det genetiska material som finns i suspensionen kan tränga in i växtcellerna genom dessa porer.
7. Inkubation: Inkubera växtcellerna efter sonoporationsbehandlingen så att de kan återhämta sig och stabilisera sina membran. Detta är ett avgörande steg för att säkerställa cellöverlevnad och framgångsrik genöverföring.

Genöverföring via Agrobacterium eller liposomer

Det finns två vanliga sätt att transfektera växtceller. De använder antingen Agrobacterium, ett släkte av gramnegativa bakterier, eller liposomer som bärare av det genetiska materialet.

• Agrobacterium-medierad sonoporation: Agrobacterium tumefaciens är en bakterie som ofta används inom växtgenteknik. I denna metod förs plasmid-DNA som innehåller den önskade genen in i Agrobacterium, som sedan blandas med växtceller. Cellsuspensionen utsätts för sonoporation med hjälp av en sonikator av sondtyp. Ultraljudsenergin förbättrar överföringen av det genetiska materialet från Agrobacterium till växtcellerna. Denna metod används i stor utsträckning för genetisk modifiering av växter.
• Liposommedierad sonoporation: Liposomer är lipidbaserade vesiklar som kan bära genetiskt material. I denna metod blandas liposomer laddade med plasmid-DNA eller andra nukleinsyror med växtceller. Sonoporation med hjälp av en sonikator av sondtyp används för att underlätta växtcellernas upptag av liposomer. Ultraljudet bryter upp liposomernas lipiddubbelskikt och frigör därmed det genetiska materialet i växtcellerna. Denna metod är användbar för studier av transient genuttryck i växtceller.

Vetenskapligt bevisade fördelar med sonikeringsassisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT)

Sonikeringsassisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) har tillämpats på många växtarter. En kort och relativt mild ultraljudsbehandling av växtcellskulturer orsakar sonoporation, vilket därefter gör det möjligt för Agrobacterium att tränga djupt in som genbärare. Nedan kan du läsa exempel på studier som visar de gynnsamma effekterna av SAAT.

Ultraljudsassisterad transformation av ashwagandha

För att förbättra transformationseffektiviteten hos W. somnifera (känd som ashwagandha eller vinterkörsbär) undersökte Dehdashti och kollegor (2016) användningen av acetosyringon (AS) och ultraljudsbehandling.
Acetosyringon (AS) tillsattes i tre steg: vid vätskeodling av Agrobacterium, vid infektion med Agrobacterium och vid samodling av explantat med Agrobacterium. Tillsats av 75 μM AS till Agrobacterium-vätskekulturen visade sig vara optimal för induktion av vir-gener.
Kompletterande ultraljudsbehandling (SAAT) gav det högsta genuttrycket. Uttrycket av gusA-genen i håriga rötter visade sig vara bäst när bladen och skottspetsarna ultraljudsbehandlades i 10 respektive 20s. Transformationseffektiviteten för det förbättrade protokollet uppmättes till 66,5 respektive 59,5% för blad- respektive skottspetsexplantat. Jämfört med andra protokoll visade sig transformationseffektiviteten för detta förbättrade protokoll vara 2,5 gånger högre för blad och 3,7 gånger högre för skottspetsar. Southern blot-analyser bekräftade 1–2 kopior av gusA-transgenen i linjerna W1-W4, medan 1–4 transgenkopior detekterades i linjen W5 som framställdes med det förbättrade protokollet.

Effekten av varaktigheten för ultraljudsassisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) på transformationsfrekvensen hos bladexplantat (a) och skottspetsexplantat (b) av W. somnifera
(studie och grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Ultraljudsassisterad transformation av bomull

Hussain et al. (2007) visar de gynnsamma effekterna av ultraljudsassisterad transformation av bomull. Akustisk kavitation som orsakas av lågfrekvent ultraljud skapar mikroskador på och under växtvävnadens yta (sonoporation) och gör det möjligt för Agrobacterium att tränga djupare in och genom hela växtvävnaden. Denna typ av sårbildning ökar sannolikheten för att infektera växtceller som ligger djupare i vävnaden. För att utvärdera transformationseffektiviteten hos SAAT mättes GUS-genuttrycket. GUS-reportersystemet är ett reportergensystem som är särskilt användbart inom växtmolekylärbiologi och mikrobiologi. Genom att justera olika SAAT-parametrar förbättrades det transienta GUS-uttrycket i bomull avsevärt när mogna embryon användes som explantat. GUS detekterades först 24h efter inkubation av explantaten, och vid 48h var GUS-uttrycket mycket starkt, vilket fungerade som en användbar indikator på framgångsrik transformation av bomullsexplantatet efter ultraljudsassisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT). Vid jämförelse av olika transformationstekniker (närmare bestämt biolistisk transformation, Agro, BAAT och SAAT) visade ultraljudsassisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) de överlägset bästa transformationsresultaten.

Val av transformationsmetod baserat på transient uttryck av GUS. Ultraljudsassisterad Agrobacterium-medierad transformation (SAAT) visar ett signifikant högre transient uttryck.
(studie och grafik: © Hussain et al., 2007)

Högpresterande ultraljudslösningar för sonoporation och SAAT

Hielscher Ultrasonics har lång erfarenhet av utveckling och tillverkning av högpresterande ultraljudsapparater för laboratorier, forskningsanläggningar samt industriell produktion med mycket hög genomströmning. För mikrobiologi och biovetenskap erbjuder Hielscher olika lösningar för att tillgodose de skilda krav som specifika vävnader och deras behandling ställer. För samtidig ultraljudsbehandling av ett stort antal prover erbjuder Hielscher UIP400MTP för flerbrunnsplattor, VialTweeter för ultraljudsbehandling av upp till 10 provflaskor (t.ex. Eppendorf-rör) eller ultraljudsapparaten CupHorn. Ultraljudsapparater av sondtyp har effekter från 50 till 400 watt för laboratoriehomogenisatorer och från 500 watt till 16 kW för industriella system.
Kontakta oss och berätta om din tillämpning och dina processkrav. Vår erfarna personal rekommenderar gärna den ultraljudsapparat som är lämpligast för din biologiska process.
Tabellen nedan ger en uppfattning om våra ultraljudsapparaters ungefärliga bearbetningskapacitet: