Ultrazvočna proizvodnja visoko prečiščenih beta-glukanov shizofilana

Shizofilan je glivni β-glukan z imunomodulatornimi lastnostmi. Za zelo izrazite zdravilne učinke mora imeti shizofilan nizko molekulsko maso, da izkazuje izboljšano biološko uporabnost. Dokazano je, da ultrazvočna obdelava zmanjšuje molekulsko maso shizofilana. Sonikacijo je kot zanesljivo in učinkovito metodo mogoče preprosto uporabiti za proizvodnjo shizofilana z nizko molekulsko maso.

Gobe Schizophyllum in ultrazvočna ekstrakcija beta-glukanov

Vrste gob iz rodu Schizophyllum v naravi rastejo na razpadajočih drevesih po deževnih obdobjih. Trosišča se nabirajo v naslednjem sušnem obdobju. Vrste iz rodu Schizophyllum so bogate z biokemičnimi spojinami, kot so glukani, zato se zlasti v tropskih državah uživajo kot hrana in zdravilo. Zaradi imunomodulatornih, protiglivičnih, antineoplastičnih in protivirusnih lastnosti je Schizophyllum commune, znana tudi kot navadna cepilistka, pritegnila pozornost biotehnoloških in farmacevtskih podjetij.
Polisaharid shizofilan, znan tudi kot sizofiran, sonifilan ali sizofilan, je glavni β-glukan v gobah Schizophyllum, ki so vir zelo učinkovitega bioaktivnega β-glukana shizofilana.
Gobe Schizophyllum commune v naravi rastejo na drevesih, micelij pa je mogoče gojiti tudi v fermentacijski brozgi. Za farmacevtske in kozmetične uporabe je shizofilan z nizko molekulsko maso precej učinkovitejši od shizofilana z visoko molekulsko maso. Razlog za to je, da shizofilan z nizko molekulsko maso izkazuje bistveno boljšo biološko uporabnost in hitrost absorpcije. Poleg tega je shizofilan z visoko molekulsko maso pri uporabi pogosto problematičen, saj povzroča visoko viskoznost svojih vodnih raztopin.
Ultrazvočno zmanjševanje velikosti je zelo učinkovita in zanesljiva tehnika za znižanje molekulske mase shizofilana, s čimer se poveča kakovost molekule β-glukana.

Protokol za proizvodnjo shizofilana z nizko molekulsko maso

Ker shizofilan z molekulsko maso izkazuje bistveno boljšo biološko uporabnost in lastnosti pri uporabi, je raziskovalna skupina Smirnou preučila ultrazvočno obdelavo za cepitev in zmanjšanje velikosti molekule β-glukana shizofilana.

Ultrazvočna obdelava shizofilana

β-1.3(1.6)-glukan shizofilan (SPG) je bil proizveden s submerznim gojenjem glive S. commune v bioreaktorju z uporabo saharoze kot substrata.
Po koncu gojenja je bila gojitvena brozga razredčena z demineralizirano vodo do koncentracije shizofilana 2 g/L in ultrazvočno obdelana z ultrazvočnim procesorjem UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Nemčija) v recirkulacijskem načinu pri naslednjih parametrih in pogojih: pretok medija 50 mL/s, frekvenca 20 kHz, izhodna moč 2000 W, sonotroda tipa BS2d22, ojačevalnik amplitude tipa B2-1.4 in amplituda 100%. Temperatura gojitvene brozge na začetku sonikacije je bila 25°C. Ultrazvočno obdelana gojitvena brozga (specifični vnos energije 100 Ws/mL) je bila filtrirana skozi globinski filter Seitz HS800 pri tlaku 1,5 bar in temperaturi 40°C. Ultrazvočno obdelani shizofilan (uSPG) za kemijsko karakterizacijo je bil oborjen iz filtrata s trikratno količino izopropilnega alkohola pri laboratorijski temperaturi in sušen pri 60°C 12h. Raztopine uSPG za imunološke študije so bile pripravljene na naslednji način: (1) filtrat ultrazvočno obdelane gojitvene brozge je bil diafiltriran skozi kaseto PES Pall Centramate serije T s površino 0,1m2 (mejna molekulska masa 100 kDa) pri 0,8 bar, diafiltracija pa se je nadaljevala, dokler prevodnost retentata ni bila 20 μS/cm; (2) raztopina je bila z diafiltracijo koncentrirana do koncentracije uSPG 1 g/L in sterilizirana z avtoklaviranjem pri 120°C/20 min. Denaturirani uSPG je bil pripravljen podobno, le da je bil filtratu gojitvene brozge dodan NaOH v koncentraciji 0,2 M, alkalizirana raztopina pa je bila pred diafiltracijo inkubirana 30 min pri laboratorijski temperaturi.

Analitske metode

Izkoristek micelija je bil ocenjen gravimetrično: gojitvena brozga je bila razredčena z vodo v razmerju 1:4 in centrifugirana pri 10.000 × g in 25°C 20 min, oborina pa je bila sprana s trikratno količino vode, posušena pri 60°C in stehtana. Shizofilan je bil oborjen iz supernatanta s trikratno količino izopropilnega alkohola in sušen pri 60°C 24h, njegov izkoristek pa je bil določen gravimetrično. pO2 v gojitveni brozgi je bil izmerjen z optično sondo Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Švica).
Dinamična viskoznost gojitvene brozge je bila izmerjena z napravo HAAKE Visco Tester 6L z vretenoma 1L in 2L pri 4°C in hitrosti vrtenja 30 rpm. Hitrost filtracije je bila izračunana iz časa filtracije 500 mL gojitvene brozge skozi globinski filter Seitz HS800 (Pall, ZDA) velikosti 200 × 200 mm pri tlaku 1,5 bar in temperaturi 40°C.
Molekulska masa uSPG je bila izmerjena z metodo SEC-MALLS na sistemu HPLC Alliance (Waters) z zaporedno povezanima kolonama PL aquagel OH60 in PL aquagel OH40, detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) pa je bil z diafiltracijo koncentriran do koncentracije uSPG 1 g/L in steriliziran z avtoklaviranjem pri 120°C/20 min. Denaturirani uSPG je bil pripravljen podobno, le da je bil filtratu gojitvene brozge dodan NaOH v koncentraciji 0,2 M, alkalizirana raztopina pa je bila pred diafiltracijo inkubirana 30 min pri laboratorijski temperaturi.

Rezultati:
Ultrazvočna obdelava je bila izvedena neposredno na gojitveni brozgi S. commune z micelijem po 144-h gojenju, da bi olajšali nadaljnjo predelavo SPG.
 
Značilnosti soniciranega shizofilana: Ultrazvočno obdelani shizofilan (uSPG) je bil oborjen iz filtrata gojitvene brozge z alkoholom in karakteriziran. Z metodo SEC-MALLS je bila Mw uSPG ocenjena na približno 1 MDa. Povprečna molekulska masa shizofilana iz tekočinske fermentacije je približno 5 MDa, pri gojenju na trdnem substratu pa lahko doseže do 10 MDa. Pri primerjavi molekulske mase ultrazvočno obdelanega shizofilana z molekulskimi masami nativnega neobdelanega shizofilana je mogoče opaziti 5- do 10-kratno zmanjšanje molekulske mase zaradi ultrazvočne obdelave.
Sonicirani polisaharid uSPG je vseboval 0,7%w/w beljakovin in 1,0%w/w ostanka po žarjenju. Hidrolizat uSPG je vseboval več kot 99% glukoze. Analitski rezultati kažejo, da sonikacija naključno cepi glavno verigo β-glukana, stranske veje pa ostanejo nedotaknjene, s čimer se zmanjšata velikost in molekulska masa shizofilana. Imunološke študije uSPG, ki je bil praktično brez beljakovin in endotoksinov, so pokazale, da ima ultrazvočno obdelani shizofilan z nizko Mw izrazito imunomodulatorno aktivnost.

 
Zmanjšana viskoznost: Ultrazvočna obdelava je povzročila bistveno zmanjšanje viskoznosti gojitvene brozge. Med ultrazvočno obdelavo se je viskoznost gojitvene brozge spreminjala nelinearno: na začetku ultrazvočne obdelave je bilo zmanjševanje viskoznosti hitro, pozneje pa se je upočasnilo. Specifični vnos energije 100 Ws/mL je zadostoval za skoraj 7-kratno zmanjšanje viskoznosti gojitvene brozge.

Izboljšana filtracija: Ultrazvočno obdelana gojitvena brozga je tekla skozi filter hitreje kot neobdelana gojitvena brozga (specifični vnos energije 0 Ws/mL) s SPG z visoko molekulsko maso. Poleg tega je ultrazvočna obdelava bistveno zmanjšala izgubo proizvoda med filtracijo. Filtrat neobdelane gojitvene brozge s SPG z visoko molekulsko maso (specifični vnos energije 0 Ws/mL) je vseboval 0,3 ± 0,07 g/L SPG, medtem ko je bila koncentracija SPG pred globinsko filtracijo 2 g/L. Nasprotno pa je filtrat gojitvene brozge, ultrazvočno obdelane s 100 Ws/mL, vseboval SPG v koncentraciji 2,2 ± 0,2 g/L, kar ustreza skoraj ničelni izgubi proizvoda.

Sklep: Raziskovalna skupina v svojem sklepu povzema, da je ultrazvočna obdelava učinkovita tehnologija za proizvodnjo shizofilana z nizko molekulsko maso, ki se nato lahko uporablja v kozmetiki in medicini. Ultrazvočna obdelava celotne gojitvene brozge z micelijem prinaša določene prednosti pri proizvodnji shizofilana. Zmanjšuje izgube proizvoda med nadaljnjo predelavo in zaradi učinkovite uporabe ultrafiltracije omogoča proizvodnjo visoko prečiščenega polisaharida.
Poleg tega so raziskovalci ugotovili, da je ultrazvočno obdelavo shizofilana preprosto prenesti v večje merilo. Ena enota ultrazvočnega dezintegratorja UIP2000hdT v pilotnem obratu je v pretočnem načinu obdelala 1 liter gojitvene brozge v 110 s. Produktivnost sistema je mogoče preprosto povečati z zaporedno povezavo dodatnih ultrazvočnih enot.

 
Preberite več o preprostem prenosu ekstrakcije gob v večje merilo!
 

Visokozmogljiva ultrazvočna oprema za obdelavo glivnih glukanov

Fragmentacijo polisaharidov, kot so glukani, in drugih bioaktivnih spojin, kot sta hitin in hitozan, je mogoče zanesljivo izvajati z visokozmogljivo ultrazvočno opremo Hielscher. Naše ultrazvočne naprave lahko zagotavljajo visoke amplitude, omogočajo natančen nadzor procesnih parametrov in lahko delujejo 24/7 pri veliki obremenitvi in v zahtevnih okoljih. Nabor opreme Hielscher Ultrasonics zanesljivo izpolnjuje te zahteve. Poleg izjemne ultrazvočne zmogljivosti se ultrazvočne naprave Hielscher ponašajo z visoko energijsko učinkovitostjo, kar je pomembna gospodarska prednost – zlasti pri uporabi v obsežni komercialni proizvodnji.
Ultrazvočne naprave Hielscher so visokozmogljivi sistemi, ki jih je mogoče opremiti z dodatki, kot so sonotrode, ojačevalniki amplitude, reaktorji ali pretočne celice, da se optimalno prilagodijo potrebam vašega procesa.
Digitalni barvni zaslon, možnost prednastavitve ciklov sonikacije, samodejno beleženje podatkov na vgrajeno kartico SD, daljinsko upravljanje prek brskalnika in številne druge funkcije zagotavljajo najvišjo raven nadzora procesa in prijaznosti do uporabnika. Ultrazvočni sistemi Hielscher so zaradi robustnosti in sposobnosti prenašanja velikih obremenitev vaša zanesljiva delovna sila v proizvodnji.
Zmanjševanje molekulske mase β-glukanov, kot je shizofilan, zahteva močan ultrazvok, da se dosežeta želena cepitev in visokokakovosten končni proizvod shizofilana, ki se lahko uporablja v farmacevtske namene.
 
Več informacij o ultrazvočni ekstrakciji beta-glukanov iz gob, vključno z navodili po korakih, najdete tukaj!
 
Spodnja preglednica prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih naprav: