Ultrazvočna priprava liposomov

Ultrazvočno proizvedeni liposomi izkazujejo zelo visoko učinkovitost zajetja, visoko kapaciteto nalaganja in enakomerno majhno velikost ter sferično obliko. Zato ultrazvočno pripravljeni liposomi zagotavljajo odlično biološko uporabnost. Hielscher Ultrasonics ponuja ultrazvočne naprave za zanesljivo proizvodnjo liposomov farmacevtske kakovosti v šaržnem in kontinuirnem načinu.

Prednosti ultrazvočne proizvodnje liposomov

Ultrazvočna liposomska enkapsulacija je tehnika, pri kateri se zdravila ali druge terapevtske učinkovine enkapsulirajo v liposome z uporabo ultrazvočne energije. V primerjavi z drugimi metodami liposomske enkapsulacije ima ultrazvočna enkapsulacija več prednosti, zaradi katerih je boljša proizvodna tehnika.

• Visoka vsebnost učinkovin, visoka učinkovitost zajetja: Ultrazvočna proizvodnja liposomov je dobro znana po pridobivanju liposomov z visoko vsebnostjo učinkovin, npr. vitamina C, molekul zdravil itd. Hkrati metoda sonikacije izkazuje visoko učinkovitost zajetja. To pomeni, da se z ultrazvočno obdelavo enkapsulira visok delež aktivne snovi. Zaradi tega je ultrazvočna obdelava zelo učinkovita metoda za proizvodnjo liposomov.
• Enakomerno majhni liposomi: Ena od prednosti ultrazvočne liposomske enkapsulacije je njena zmožnost proizvajanja zelo enotnih liposomov z ozko porazdelitvijo velikosti. Ultrazvočno energijo je mogoče uporabiti za razbijanje večjih liposomov ali lipidnih agregatov v manjše, bolj enotne liposome. To omogoča večjo enotnost velikosti in oblike liposomov, kar je lahko pomembno pri dostavi zdravil, kjer lahko velikost delcev vpliva na njihovo farmakokinetiko in učinkovitost.
• Uporabno za katere koli molekule: Druga prednost ultrazvočne liposomske enkapsulacije je njena zmožnost enkapsuliranja širokega nabora zdravil in drugih terapevtskih učinkovin. Tehniko je mogoče uporabiti za enkapsulacijo tako hidrofilnih kot hidrofobnih zdravil, kar je lahko z drugimi metodami težko izvedljivo. Poleg tega je mogoče ultrazvočno energijo uporabiti za enkapsulacijo makromolekul in nanodelcev, ki so lahko preveliki za enkapsulacijo z drugimi metodami.
• Hitro in zanesljivo: Ultrazvočna liposomska enkapsulacija je tudi razmeroma preprost in hiter postopek. Ne zahteva uporabe agresivnih kemikalij ali visokih temperatur, ki lahko škodujejo terapevtskim učinkovinam, ki se enkapsulirajo.
• Povečanje obsega proizvodnje: Poleg tega je mogoče tehniko preprosto prenesti v proizvodnjo velikega obsega, zaradi česar je stroškovno učinkovita možnost za dostavo zdravil.

Če povzamemo, je ultrazvočna liposomska enkapsulacija boljša tehnika liposomske enkapsulacije zaradi svoje zmožnosti proizvajanja enotnih liposomov z ozko porazdelitvijo velikosti, enkapsuliranja širokega nabora terapevtskih učinkovin ter svoje preprostosti in možnosti povečanja obsega proizvodnje.

Po nastanku lipidnega filma in njegovi naknadni rehidraciji se sonikacija uporablja za spodbujanje zajetja učinkovin v liposom. Poleg tega se s sonikacijo doseže želena velikost liposomov.

Ultrazvočna priprava liposomov za farmacevtske in kozmetične izdelke

Liposomi (vezikli na osnovi lipidov), transferosomi (ultradeformabilni liposomi), etosomi (ultradeformabilni vezikli z visoko vsebnostjo alkohola) in niosomi (sintetični vezikli) so mikroskopski vezikli, ki jih je mogoče umetno pripraviti kot kroglaste nosilce, v katere se lahko enkapsulirajo aktivne molekule. Ti vezikli s premeri med 25 in 5000 nm se pogosto uporabljajo kot nosilci zdravil v farmacevtski in kozmetični industriji, na primer za peroralno ali topikalno dostavo zdravil, gensko terapijo in imunizacijo. Ultrazvočna obdelava je znanstveno dokazana metoda za zelo učinkovito proizvodnjo liposomov. Ultrazvočne naprave Hielscher proizvajajo liposome z visoko vsebnostjo učinkovin in boljšo biološko uporabnostjo.

Liposomi in liposomske formulacije

Liposomi so unilamelarni, oligolamelarni ali multilamelarni vezikularni sistemi in so sestavljeni iz istega materiala kot celična membrana (lipidni dvosloj). Glede na sestavo in velikost liposome razlikujemo takole:

• multilamelarni vezikli (MLV, 0,1–10μm)
• majhni unilamelarni vezikli (SUV, <100 nm)
• veliki unilamelarni vezikli (LUV, 100–500 nm)
• orjaški unilamelarni vezikli (GUV, ≥1 μm)

Osnovno strukturo liposomov sestavljajo fosfolipidi. Fosfolipidi imajo hidrofilno glavno skupino in hidrofobno repno skupino, ki jo sestavlja dolga ogljikovodikova veriga.
Liposomska membrana ima zelo podobno sestavo kot kožna pregrada, zato se liposomi zlahka vključijo v človeško kožo. Ko se liposomi zlijejo s kožo, lahko zajete učinkovine sprostijo neposredno na ciljno mesto, kjer lahko te opravljajo svoje funkcije. Tako liposomi izboljšajo prehodnost oziroma prepustnost kože za zajete farmacevtske in kozmetične učinkovine. Tudi liposomi brez enkapsuliranih učinkovin, torej prazni vezikli, so močne učinkovine za kožo, saj »phosphatidylcholin« vsebuje dve esencialni sestavini, ki ju človeški organizem ne more proizvajati sam: linolno kislino in holin.
Liposomi se uporabljajo kot biokompatibilni nosilci zdravil, peptidov, beljakovin, »plasmic DNA«, protismiselnih oligonukleotidov ali ribocimov za farmacevtske, kozmetične in biokemijske namene. Izjemna raznolikost velikosti delcev in fizikalnih parametrov lipidov ponuja privlačne možnosti za oblikovanje po meri prilagojenih nosilcev za širok nabor uporab. (Ulrich 2002)

Ultrazvočno tvorjenje liposomov

Liposome je mogoče tvoriti z uporabo ultrazvoka. Osnovni material za pripravo liposomov so molekule »amphilic«, ki izvirajo iz lipidov bioloških membran ali temeljijo na njih. Za tvorjenje majhnih unilamelarnih veziklov (SUV) se lipidna disperzija nežno sonikira – npr. z ročno ultrazvočno napravo UP50H (50W, 30kHz), napravo VialTweeter ali ultrazvočnim reaktorjem CupHorn – v ledeni kopeli. Takšna ultrazvočna obdelava traja približno 5 – 15 minut. Druga metoda za proizvodnjo majhnih unilamelarnih veziklov je sonikacija liposomov v obliki multilamelarnih veziklov.
Dinu-Pirvu et al. (2010) poročajo o pridobivanju transferosomov s sonikacijo MLV pri sobni temperaturi.
Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne naprave, sonotrode in dodatno opremo ter lahko tako zagotovi najprimernejšo ultrazvočno konfiguracijo za zelo učinkovito liposomsko enkapsulacijo v katerem koli obsegu.

Ultrazvočna enkapsulacija aktivnih snovi v liposome

Liposomi delujejo kot nosilci učinkovin, kot so vitamini, terapevtske molekule, peptidi itd. Ultrazvok je učinkovito orodje za pripravo in tvorjenje liposomov za zajetje učinkovin. Hkrati sonikacija podpira postopek enkapsulacije in zajetja, tako da nastanejo liposomi z visoko vsebnostjo učinkovin. Pred enkapsulacijo liposomi zaradi površinskih interakcij med naboji polarnih glav fosfolipidov težijo k tvorjenju skupkov (prim. Míckova et al. 2008), poleg tega jih je treba odpreti. Zhu et al. (2003) na primer opisujejo enkapsulacijo biotinskega prahu v liposome z ultrazvočno obdelavo. Ko so biotinski prah dodali v raztopino s suspenzijo veziklov, so raztopino sonikirali. Po tej obdelavi je bil biotin zajet v liposomih.
Preberite več o ultrazvočni enkapsulaciji »peptrides« GLP-1 (npr. semaglutida) v liposome!

Liposomske emulzije z ultrazvočno obdelavo

Za izboljšanje negovalnega učinka vlažilnih krem ali krem proti staranju, losjonov, gelov in drugih kozmecevtskih formulacij se liposomskim disperzijam dodajajo emulgatorji, ki stabilizirajo večje količine lipidov. Vendar so raziskave pokazale, da je zmogljivost liposomov na splošno omejena. Z dodatkom emulgatorjev se ta učinek pojavi prej, dodatni emulgatorji pa zmanjšajo afiniteto fosfatidilholina do kožne pregrade. Nanodelci – sestavljeni iz fosfatidilholina in lipidov – so odgovor na to težavo. Te nanodelce tvori oljna kapljica, prekrita z monoslojem fosfatidilholina. Uporaba nanodelcev omogoča formulacije, ki lahko sprejmejo več lipidov in ostanejo stabilne, zato dodatni emulgatorji niso potrebni.
Ultrazvočna obdelava je dokazana metoda za proizvodnjo nanoemulzij in nanodisperzij. Zelo intenziven ultrazvok zagotavlja moč, potrebno za dispergiranje tekoče faze (dispergirane faze) v obliki majhnih kapljic v drugi fazi (kontinuirni fazi). V območju dispergiranja implozija kavitacijskih mehurčkov povzroči intenzivne udarne valove v okoliški tekočini in nastanek tekočinskih curkov z visoko hitrostjo tekočine. Za stabilizacijo novonastalih kapljic dispergirane faze proti koalescenci se emulziji dodajo emulgatorji (površinsko aktivne snovi, tenzidi) in stabilizatorji. Ker koalescenca kapljic po razbijanju vpliva na končno porazdelitev velikosti kapljic, se uporabljajo emulgatorji z učinkovitim stabilizacijskim delovanjem, ki ohranjajo končno porazdelitev velikosti kapljic na ravni, enaki porazdelitvi neposredno po razbijanju kapljic v ultrazvočnem območju dispergiranja.

Liposomske disperzije z ultrazvočno obdelavo

Liposomske disperzije, ki temeljijo na nenasičenem »phosphatidylchlorine«, niso dovolj stabilne proti oksidaciji. Disperzijo je mogoče stabilizirati z antioksidanti, na primer s kompleksom vitaminov C in E.
 

Tvorjenje liposomov z metodo izparevanja z obratno fazo z uporabo sonikacije

 
Ortan et al. (2002) so v svoji študiji ultrazvočne priprave eteričnega olja Anethum graveolens v liposomih dosegli dobre rezultate. Po sonikaciji so bile velikosti liposomov med 70–150 nm, pri MLV pa med 230–475 nm; te vrednosti so bile približno nespremenjene tudi po 2 mesecih, vendar so se po 12 mesecih povečale, zlasti v disperziji SUV (glejte spodnje histograme). Meritve stabilnosti, ki so obravnavale izgubo eteričnega olja in porazdelitev velikosti, so prav tako pokazale, da so liposomske disperzije ohranile vsebnost hlapnega olja. To nakazuje, da je zajetje eteričnega olja v liposome povečalo stabilnost olja.

Ortan et al. (2009): Stabilnost disperzij MLV in SUV po 1 letu. Liposomske formulacije so bile shranjene pri 4±1 ºC.

Ultrazvočni procesorji Hielscher so idealne naprave za uporabo v kozmetični in farmacevtski industriji. Sistemi, sestavljeni iz več ultrazvočnih procesorjev z močjo do 16.000 vatov vsak, zagotavljajo zmogljivost, potrebno za prenos te laboratorijske uporabe v učinkovito proizvodno metodo za pridobivanje fino dispergiranih emulzij v kontinuirnem toku ali v šarži – pri čemer dosegajo rezultate, primerljive z današnjimi najboljšimi razpoložljivimi visokotlačnimi homogenizatorji, kot so ventili z odprtino. Poleg te visoke učinkovitosti pri kontinuirnem emulgiranju ultrazvočne naprave Hielscher zahtevajo zelo malo vzdrževanja ter so zelo preproste za upravljanje in čiščenje. Ultrazvok dejansko podpira čiščenje in izpiranje. Ultrazvočna moč je nastavljiva in jo je mogoče prilagoditi posameznim izdelkom in zahtevam emulgiranja. Na voljo so tudi posebni reaktorji s pretočno celico, ki izpolnjujejo napredne zahteve CIP (čiščenje na mestu) in SIP (sterilizacija na mestu).

Pogosta vprašanja o liposomih

Katere vrste liposomov razlikujemo?

Liposomi se razvrščajo v različne vrste glede na velikost in število dvoslojev, ki jih vsebujejo. Te kategorije vključujejo:

• Majhni unilamelarni vezikli (SUV): To so najmanjši liposomi z enim lipidnim dvoslojem.
• Veliki unilamelarni vezikli (LUV): So večji od SUV in imajo prav tako en dvosloj.
• Multilamelarni vezikli (MLV): Vsebujejo več koncentričnih dvoslojev.
• Multivezikularni vezikli (MVV): Sestavljeni so iz več manjših veziklov znotraj večjega vezikla.

 
Druge specializirane vrste vključujejo:

• PEGilirani liposomi: Liposomi, modificirani s polietilenglikolom (PEG) za izboljšanje stabilnosti in podaljšanje časa kroženja.
• Nanoliposomi: Zelo majhni liposomi, ki se običajno uporabljajo za ciljno dostavo zdravil.

Katere vezikularne strukture lahko imajo liposomi?

Liposomi se glede na vezikularno strukturo nadalje razvrščajo v sedem glavnih vrst:

• Veliki multilamelarni vezikli (MLV): Vsebujejo več dvoslojev.
• Oligolamelarni vezikli (OLV): Imajo nekaj dvoslojev.
• Majhni unilamelarni vezikli (SUV): Najmanjši, z enim dvoslojem.
• Srednje veliki unilamelarni vezikli (MUV): Srednje velikosti, z enim dvoslojem.
• Veliki unilamelarni vezikli (LUV): Večji, z enim dvoslojem.
• Orjaški unilamelarni vezikli (GUV): Zelo veliki, z enim dvoslojem.
• Multivezikularni vezikli (MVV): Več veziklov znotraj enega velikega vezikla.

Kakšne so razlike med liposomi in niosomi?

Liposomi in niosomi se razlikujejo predvsem po sestavi:
Liposomi: Izdelani iz fosfolipidov z dvema verigama, ki so lahko nevtralni ali nabiti.
Niosomi: Izdelani iz nenabitih tenzidov z eno verigo in holesterola.
Obe strukturi nastaneta s sonikacijo, ki spodbuja sestavljanje veziklov z dvoslojno strukturo.

Kakšna je idealna velikost liposoma?

Za dostavo terapevtskih učinkovin je idealna velikost liposoma teoretično med 50 in 200 nanometri v premeru. Ta razpon velikosti optimizira stabilnost in biološko uporabnost. Sonikacija se običajno uporablja za zmanjšanje vezikla na želeno velikost.

Ali lahko liposomi prenašajo hidrofilna zdravila?

Da, liposomi lahko prenašajo hidrofilna zdravila. V biomedicini so cenjeni zaradi svoje zmožnosti enkapsuliranja tako hidrofobnih kot hidrofilnih učinkovin. Poleg tega zagotavljajo visoko biokompatibilnost in biološko razgradljivost, zaradi česar so učinkoviti dostavni sistemi.

Kako pripraviti liposome?

Najpogostejši tehniki priprave liposomov sta metoda tankega filma in metoda izparevanja z obratno fazo.
Metoda hidratacije tankega filma:

1. Lipide raztopite v organskem topilu.
2. Topilo izparite, da nastane tanek lipidni film.
3. Film hidratirajte z vodno raztopino ob uporabi sonikacije, da nastanejo multilamelarni vezikli.

Metoda izparevanja z obratno fazo:

1. Lipide raztopite v vodi in etanolu.
2. Raztopino sonikirajte pri 60°C približno 10 minut, da nastane lipidna pasta.
3. Lipidno suspenzijo ohladite ter med mešanjem po kapljicah dodajajte vodo ali pufer.
4. Suspenzijo hidratirajte 1 uro, da nastanejo multilamelarni vezikli.
5. Velikost liposomov zmanjšajte z nadaljnjo sonikacijo.

Kaj so arheosomi?

Arheosomi so liposomi, izdelani iz lipidov arhej, ki so znani po svoji stabilnosti in odpornosti proti ekstremnim razmeram. Zaradi teh lastnosti so arheosomi še posebej uporabni za dostavo zdravil in razvoj cepiv v zahtevnih okoljih.

Kako se pripravljajo arheosomi?

Postopek sonikacije po Pise (2022): Arheosome je mogoče izdelati iz polarne lipidne frakcije »PLF« organizma Sulfolobussolfataricus s sonikacijo pri 60°C, ne da bi bilo potrebno dodajanje zunanjih lipidov. Pri 0°C so bili polarni lipidi organizma Sulfolobusacidocaldarius učinkovito sonikirani za tvorjenje arheosomov. Arheosomi z vsebnostjo BMD in običajni liposomi ter lipidi arhej, izolirani iz Archaea H. salinarum in obogateni s fosfatidilholinom, so bili izdelani z uporabo tehnik sonikacije. Sonikirani vezikli za topikalno dostavo so bili ustvarjeni s sonikacijo disperzij MLV pri 80 odstotkih amplitude 4 minute z uporabo sonikatorja Hielscher UP50H s sondo (glejte sliko na levi).

Literatura/viri

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.