Ultrazvočna priprava liposomov

Ultrazvočno proizvedeni liposomi kažejo zelo visoko učinkovitost ujetja, visoko nosilnost in enakomerno majhno sferično velikost. S tem ultrazvočni liposomi ponujajo odlično biološko uporabnost. Hielscher Ultrasonics ponuja ultrazvočne aparate za zanesljivo proizvodnjo farmacevtskih liposomov v serijnem in neprekinjenem načinu.

Prednosti ultrazvočne proizvodnje liposomov

Ultrazvočna inkapsulacija liposomov je tehnika, ki se uporablja za kapsuliranje zdravil ali drugih terapevtskih sredstev v liposomih z uporabo ultrazvočne energije. V primerjavi z drugimi metodami za inkapsulacijo liposomov ima ultrazvočna enkapsulacija več prednosti, zaradi katerih je vrhunska proizvodna tehnika.

• Visoka obremenitev, visoka učinkovitost ujetja: Znano je, da ultrazvočna proizvodnja liposomov proizvaja liposome z visoko obremenitvijo aktivnih sestavin, npr. vitamina C, molekul zdravil itd. Hkrati metoda ultrazvočnega razbijanja kaže visoko učinkovitost ujetja. To pomeni, da je visok odstotek zdravilne učinkovine inkapsuliran z ultrazvokom. Skratka, zaradi tega je ultrasonication zelo učinkovita metoda za proizvodnjo liposomov.
• Enakomerno majhni liposomi: Ena od prednosti ultrazvočne inkapsulacije liposomov je njegova sposobnost izdelave zelo enakomernih liposomov z ozko porazdelitvijo velikosti. Ultrazvočna energija se lahko uporablja za razgradnjo večjih liposomov ali lipidnih agregatov v manjše, bolj enakomerne liposome. To vodi do večje doslednosti v velikosti in obliki liposomov, kar je lahko pomembno za aplikacije za dostavo zdravil, kjer lahko velikost delcev vpliva na njihovo farmakokinetiko in učinkovitost.
• Uporablja se za vse molekule: Druga prednost ultrazvočne inkapsulacije liposomov je njegova sposobnost, da inkapsulira široko paleto zdravil in drugih terapevtskih sredstev. Tehnika se lahko uporablja za kapsuliranje hidrofilnih in hidrofobnih zdravil, kar je težko storiti z drugimi metodami. Poleg tega se lahko ultrazvočna energija uporablja za kapsuliranje makromolekul in nanodelcev, ki so lahko preveliki, da bi jih lahko inkapsulirali z drugimi metodami.
• Hitro in zanesljivo: Ultrazvočna inkapsulacija liposomov je tudi razmeroma preprost in hiter postopek. Ne zahteva uporabe ostrih kemikalij ali visokih temperatur, ki so lahko škodljive za terapevtska sredstva, ki se kapsulirajo.
• Razširitev: Poleg tega je tehniko mogoče enostavno povečati za obsežno proizvodnjo, zaradi česar je stroškovno učinkovita možnost za uporabo zdravil.

Če povzamemo, ultrazvočna inkapsulacija liposomov je vrhunska tehnika za inkapsulacijo liposomov zaradi svoje sposobnosti izdelave enakomernih liposomov z ozko porazdelitvijo velikosti, kapsuliranja širokega spektra terapevtskih sredstev ter njegove preprostosti in razširljivosti.

Po nastanku lipidnega filma naknadno rehidracijo se ultrazvočna razbijanje uporablja za spodbujanje ujetja aktivnih sestavin v liposom. Poleg tega ultrazvočno razbijanje doseže želeno velikost liposomov.

Ultrazvočni liposomski pripravek za farmacevtske izdelke in kozmetiko

Liposomi (mehurčki na osnovi lipidov), transferosomi (ultradeformabilni liposomi), etosomi (ultradeformabilni mehurčki z visoko vsebnostjo alkohola) in niosomi (sintetični mehurčki) so mikroskopski vezikli, ki jih je mogoče umetno pripraviti kot globularne nosilce, v katere se lahko kapsulirajo aktivne molekule. Ti mehurčki s premerom med 25 in 5000 nm se pogosto uporabljajo kot nosilci zdravil v farmacevtski in kozmetični industriji, kot so peroralna ali lokalna dostava zdravil, genska terapija in imunizacija. Ultrasonication je znanstveno dokazana metoda za visoko učinkovito proizvodnjo liposomov. Hielscher ultrazvočni aparati proizvajajo liposome z visoko obremenitvijo aktivnih sestavin in vrhunsko biološko uporabnostjo.

Liposomi in liposomska formulacija

Liposomi so enolamelarni, oligolamelarni ali multilamelarni vezikularni sistemi in so sestavljeni iz istega materiala kot celična membrana (lipidni dvosloj). Glede na njihovo sestavo in velikost se liposomi razlikujejo na naslednji način:

• večlamelni mehurčki (MLV, 0,1-10μm)
• majhni enolamelarni mehurčki (SUV, <100 nm)
• veliki enolamelarni mehurčki (LUV, 100–500 nm)
• velikanski unilamelarni mehurčki (GUV, ≥1 μm)

Glavna struktura liposomov je sestavljena iz fosfolipidov. Fosfolipidi imajo hidrofilno glavno skupino in hidrofobno repno skupino, ki je sestavljena iz dolge ogljikovodikove verige.
Liposomska membrana ima zelo podobno sestavo kot kožna bariera, tako da se lahko zlahka vključijo v človeško kožo. Ko se liposomi združijo s kožo, lahko ujeta sredstva raztovorijo neposredno na cilj, kjer lahko aktivne snovi izpolnijo svoje funkcije. Tako liposomi ustvarjajo izboljšanje penetrabilnosti / prepustnosti kože za ujeta farmacevtska in kozmetična sredstva. Tudi liposomi brez inkapsuliranih snovi, prazni mehurčki, so močni aktivni učinki za kožo, saj fosfatidilholin vsebuje dve bistveni sestavini, ki ju človeški organizem ne more proizvesti sam: linolno kislino in holin.
Liposomi se uporabljajo kot biokompatibilni nosilci zdravil, peptidov, beljakovin, plazemske DNA, antisense oligonukleotidov ali ribozime, za farmacevtske, kozmetične in biokemične namene. Ogromna vsestranskost v velikosti delcev in fizikalnih parametrih lipidov ponuja privlačen potencial za izdelavo vozil po meri za širok spekter uporabe. (Ulrich 2002)

Tvorba ultrazvočnih liposomov

Liposomi se lahko oblikujejo z uporabo ultrazvoka. Osnovni material za pripravo liposomov so amfilične molekule, pridobljene ali na osnovi bioloških membranskih lipidov. Za nastanek majhnih unilamelarnih veziklov (SUV) se lipidna disperzija nežno sonikira – npr. z ročno ultrazvočno napravo UP50H (50W, 30kHz), VialTweeter ali ultrazvočnim reaktorjem CupHorn – v ledeni kopeli. Trajanje takšnega ultrazvočnega zdravljenja traja približno 5 – 15 minut. Druga metoda za proizvodnjo majhnih enlamelarnih veziklov je ultrazvočna razbijanje liposomov multilamelarnih veziklov.
(2010) poroča o pridobivanju transferosomov s ultrazvočnim razbijanjem MLV pri sobni temperaturi.
Hielscher Ultrasonics ponuja različne ultrazvočne naprave, sonotrode in dodatke in lahko s tem zagotovi najprimernejšo ultrazvočno nastavitev za visoko učinkovito inkapsulacijo liposomov v katerem koli obsegu.

Ultrazvočna enkapsulacija aktivnih snovi v liposome

Liposomi delujejo kot nosilci aktivnih sestavin, kot so vitamini, terapevtske molekule, peptidi itd. Ultrazvok je učinkovito orodje za pripravo in oblikovanje liposomov za ujetje aktivnih snovi. Hkrati ultrazvočna razbijanje pomaga pri procesu inkapsulacije in ujetja, tako da se proizvajajo liposomi z visoko obremenitvijo aktivnih sestavin. Pred inkapsulacijo liposomi ponavadi tvorijo grozde zaradi interakcije površinskega naboja in naboja fosfolipidnih polarnih glav (prim. Míckova et al. 2008), poleg tega pa jih je treba odpreti. Na primer, Zhu et al. (2003) opisujejo inkapsulacijo biotinskega prahu v liposomih z ultrasonication. Ko je bil biotinski prašek dodan v raztopino suspenzije veziklov, je bila raztopina ultrazvočna. Po tem zdravljenju je bil biotin ujet v liposome.

Liposomske emulzije z ultrazvokom

Za povečanje negovalnega učinka vlažilnih ali anti-aging krem, losjonov, gelov in drugih kozmecevtičnih formulacij se liposomskim disperzijam doda emulgator za stabilizacijo večjih količin lipidov. Toda preiskave so pokazale, da je sposobnost liposomov na splošno omejena. Z dodatkom emulgatorjev se bo ta učinek pojavil prej, dodatni emulgatorji pa povzročijo oslabitev pregradne afinitete fosfatidilholina. Nanodelci – sestavljen iz fosfatidilholina in lipidov - so odgovor na ta problem. Te nanodelce tvori oljna kapljica, ki je prekrita z enoplastjo fosfatidilholina. Uporaba nanodelcev omogoča formulacije, ki lahko absorbirajo več lipidov in ostanejo stabilne, tako da dodatni emulgatorji niso potrebni.
Ultrasonication je preizkušena metoda za proizvodnjo nanoemulzij in nanodisperzij. Visoko intenziven ultrazvok zagotavlja moč, potrebno za razpršitev tekoče faze (dispergirana faza) v majhnih kapljicah v drugi fazi (neprekinjena faza). V disperzijskem območju implodirajoči kavitacijski mehurčki povzročajo intenzivne udarne valove v okoliški tekočini in povzročijo nastanek tekočih curkov visoke hitrosti tekočine. Da bi stabilizirali novonastale kapljice disperzne faze proti koalescenci, se emulziji dodajo emulgatorji (površinsko aktivne snovi, površinsko aktivne snovi) in stabilizatorji. Ker koalescenca kapljic po motnji vpliva na končno porazdelitev velikosti kapljic, se učinkovito stabilizacijski emulgatorji uporabljajo za vzdrževanje končne porazdelitve velikosti kapljic na ravni, ki je enaka porazdelitvi takoj po prekinitvi kapljic v ultrazvočnem disperzijskem območju.

Liposomske disperzije z uporabo ultrazvoka

Liposomske disperzije, ki temeljijo na nenasičenih fosfatidilklorih, nimajo stabilnosti proti oksidaciji. Stabilizacijo disperzije lahko dosežemo z antioksidanti, kot je kompleks vitaminov C in E.
 

Nastajanje liposomov z metodo izhlapevanja z obratno fazo z uporabo ultrazvočnega razbijanja

 
Ortan et al. (2002) so v svoji študiji o ultrazvočni pripravi eteričnega olja Anethum graveolens v liposomih dosegli dobre rezultate. Po ultrazvočnem razbijanju je bila dimenzija liposomov med 70-150 nm, za MLV pa med 230-475 nm; te vrednosti so bile približno konstantne tudi po 2 mesecih, vendar so umrle po 12 mesecih, zlasti pri disperziji SUV (glejte histograme spodaj). Merjenje stabilnosti, ki se nanaša na izgubo eteričnega olja in porazdelitev velikosti, je pokazalo tudi, da liposomske disperzije ohranjajo vsebnost hlapnega olja. To kaže, da je ujetje eteričnega olja v liposomih povečalo stabilnost olja.

Ortan et al. (2009): Stabilnost disperzij MLV in SUV po 1 letu. Liposomske formulacije so bile shranjene pri 4±1 °C.

Hielscher ultrazvočni procesorji so idealne naprave za uporabo v kozmetični in farmacevtski industriji. Sistemi, sestavljeni iz več ultrazvočnih procesorjev do 16.000 vatov, zagotavljajo zmogljivost, potrebno za prevajanje te laboratorijske aplikacije v učinkovito proizvodno metodo za pridobivanje fino razpršenih emulzij v neprekinjenem pretoku ali v seriji – doseganje rezultatov, primerljivih z današnjimi najboljšimi visokotlačnimi homogenizatorji, kot so odprti ventili. Poleg te visoke učinkovitosti pri neprekinjenem emulgiranju Hielscher ultrazvočne naprave zahtevajo zelo nizko vzdrževanje in so zelo enostavne za uporabo in čiščenje. Ultrazvok dejansko podpira čiščenje in izpiranje. Ultrazvočna moč je nastavljiva in jo je mogoče prilagoditi določenim izdelkom in zahtevam emulgiranja. Na voljo so tudi posebni reaktorji pretočnih celic, ki izpolnjujejo napredne zahteve CIP (čiščenje na mestu) in SIP (sterilizacija na mestu).

Pogosto zastavljena vprašanja o liposomih

Katere vrste liposomov se razlikujejo?

Liposomi so razvrščeni v različne vrste glede na njihovo velikost in število dvoslojev, ki jih vsebujejo. Te kategorije vključujejo:

• Majhni enolamelni mehurčki (SUV): To so najmanjši liposomi z enim lipidnim dvoslojem.
• Veliki enolamelarni mehurčki (LUV): Večji od SUV-jev, imajo tudi en dvosloj.
• Multilamelarni mehurčki (MLV): Vsebujejo več koncentričnih dvoslojev.
• Multivezikularni mehurčki (MVV): Sestavljeni so iz več manjših veziklov v večjem mehurčku.

 
Druge specializirane vrste vključujejo:

• PEGilirani liposomi: Liposomi, modificirani s polietilen glikolom (PEG) za povečanje stabilnosti in časa cirkulacije.
• Nanoliposomi: Zelo majhni liposomi, ki se običajno uporabljajo za ciljno dostavo zdravil.

Katere strukture mehurčkov lahko razkažejo liposomi?

Liposomi so nadalje razvrščeni glede na strukturo veziklov v sedem glavnih vrst:

• Multilamelarni veliki mehurčki (MLV): Vsebujejo več dvoslojev.
• Oligolamelarni mehurčki (OLV): Imejte nekaj dvoslojev.
• Majhni enolamelni mehurčki (SUV): Najmanjši z enim dvoslojem.
• Srednje velike enolamelne vezikle (MUV): Vmesna velikost z enim dvoslojem.
• Veliki enolamelarni mehurčki (LUV): Večji z enim dvoslojem.
• Velikanski unilamelarni mehurčki (GUV): Zelo velik z enim dvoslojem.
• Multivezikularni mehurčki (MVV): Več veziklov v enem velikem mehurčku.

Kakšne so razlike med liposomi in niosomi?

Liposomi in niosomi se razlikujejo predvsem po sestavi:
Liposomi: Narejen je iz dvoverižnih fosfolipidov, ki so lahko nevtralni ali nabiti.
Niosomi: Narejen iz nenapolnjenih enoverižnih površinsko aktivnih snovi in holesterola.
Obe strukturi se oblikujeta z ultrazvočnim razbijanjem, ki spodbuja sestavljanje dvoslojnih veziklov.

Kakšna je idealna velikost liposoma?

Za terapevtsko dostavo je idealna velikost liposoma teoretično med 50 in 200 nanometrov v premeru. Ta razpon velikosti optimizira stabilnost in biološko uporabnost. Sonication se običajno uporablja za zmanjšanje mehurčka na želeno velikost.

Ali lahko liposomi nosijo hidrofilna zdravila?

Da, liposomi lahko nosijo hidrofilna zdravila. V biomedicinskih aplikacijah so cenjeni zaradi svoje sposobnosti kapsuliranja hidrofobnih in hidrofilnih sredstev. Poleg tega ponujajo visoko biokompatibilnost in biorazgradljivost, zaradi česar so učinkoviti sistemi dostave.

Kako narediti liposome?

Najpogostejši tehniki priprave liposomov sta tankofilmska metoda in metoda izhlapevanja z obratno fazo.
Metoda hidracije tankega filma:

1. Lipide raztopite v organskem topilu.
2. Topilo izhlapite, da nastane tanek lipidni film.
3. Folijo hidrirajte z vodno raztopino z ultrazvočnim razbijanjem, da nastanejo multilamelarni mehurčki.

Metoda izhlapevanja z obratno fazo:

1. Raztopite lipide v vodi in etanolu.
2. Raztopino sonikirajte pri 60 °C približno 10 minut, da ustvarite lipidno pasto.
3. Ohladite lipidno kašo in med mešanjem dodajte vodo ali pufer po kapljicah.
4. Suspenzijo hidrirajte 1 uro, da nastanejo multilamelarne vezikle.
5. Zmanjšajte velikost liposoma z nadaljnjo ultrazvočno razbijanjem.

Kaj so arheosomi?

Arheosomi so liposomi iz arhejskih lipidov, ki so znani po svoji stabilnosti in odpornosti na ekstremne pogoje. Zaradi teh lastnosti so arheosomi še posebej koristni za dostavo zdravil in razvoj cepiv v zahtevnih okoljih.

Kako se pripravljajo arheosomi?

Postopek ultrazvočnega razbijanja po Pise (2022): Arheosomi so lahko izdelani iz polarne lipidne frakcije “PLF” Sulfolobussolfataricus s ultrazvočno razbijanjem pri 60 °C brez potrebe po zunanjem dopolnjevanju lipidov. Pri 0 °C so bili polarni lipidi iz Sulfolobusacidocaldarius učinkovito sonikirani, da so tvorili arheosome. Arheosomi z BMD in konvencionalni liposomi ter arhejski lipidi, izolirani iz Archaea H. salinarum in obogateni s fosfatidilholinom, so bili izdelani z uporabo ultrazvočnih tehnik. Sonicirani mehurčki so bili ustvarjeni za lokalno dostavo s ultrazvočnimi disperzijami MLV pri 80-odstotni amplitudi za 4 minute z uporabo sondnega tipa Hielscher UP50H (glej sliko na levi).

Literatura/Reference