Ultrazvočna deacetilacija hitina v hitozan
Ultrazvočna proizvodnja hitozana
Hitozan pridobivamo z N-deacetilacijo hitina. Pri običajni deacetilaciji hitin namakamo v vodnih alkalnih topilih (običajno 40 do 50% (w/w) NaOH). Postopek namakanja zahteva visoke temperature od 100 do 120ºC in je zelo zamuden, izkoristek hitozana pri posameznem koraku namakanja pa je nizek. Uporaba ultrazvoka visoke moči znatno intenzivira proces deacetilacije hitina in omogoča visok izkoristek hitozana z nizko molekulsko maso pri hitri obdelavi pri nižji temperaturi. Z ultrazvočno deacetilacijo pridobimo hitozan vrhunske kakovosti, ki se uporablja kot sestavina živil in farmacevtskih izdelkov, kot gnojilo in v številnih drugih industrijskih aplikacijah.
Ultrazvočna obdelava omogoča izjemno stopnjo acetilacije (DA) hitina, pri čemer stopnjo acetilacije zniža s hitina z DA≥90 na hitozan z DA≤10.
Številne raziskave potrjujejo učinkovitost ultrazvočne deacetilacije hitina v hitozan. Weiss J. et al. (2008) so ugotovili, da sonikacija izrazito izboljša pretvorbo hitina v hitozan. Ultrazvočna obdelava hitina znatno prihrani čas, saj potreben čas procesa skrajša z 12–24 ur na nekaj ur. Poleg tega je za popolno pretvorbo potrebno manj topila, kar zmanjšuje vpliv na okolje zaradi zavrženja in odstranjevanja porabljenega ali nezreagiranega topila, tj. koncentriranega NaOH.
Sonikacija spodbuja deacetilacijo hitina v hitozan
UIP4000hdT – ultrazvočni sistem z močjo 4kW
Načelo delovanja ultrazvočne obdelave hitozana
Ultrazvočna obdelava z visoko močjo in nizko frekvenco (∼20–26kHz) ustvarja akustično kavitacijo v tekočinah in suspenzijah. Ultrazvok visoke moči spodbuja pretvorbo hitina v hitozan, saj topilo (npr. NaOH) drobi trdne delce hitina in prodira vanje, s čimer povečuje površino in izboljšuje prenos snovi med trdno in tekočo fazo. Poleg tega velike strižne sile ultrazvočne kavitacije ustvarjajo proste radikale, ki med hidrolizo povečujejo reaktivnost reagenta (tj. NaOH). Sonikacija kot netermična tehnika obdelave preprečuje toplotno razgradnjo in omogoča proizvodnjo visokokakovostnega hitozana. Ultrazvok skrajša čas obdelave, potreben za pridobivanje hitina iz rakov, ter omogoča pridobivanje hitina (in s tem pozneje hitozana) višje čistosti v primerjavi s tradicionalnimi pogoji obdelave. Pri proizvodnji hitina in hitozana ima ultrazvok tako potencial za znižanje proizvodnih stroškov, skrajšanje časa obdelave, boljši nadzor proizvodnega procesa in zmanjšanje vpliva procesnih odpadkov na okolje.
- Višji izkoristek hitozana
- Vrhunska kakovost
- Krajši čas
- Nižja procesna temperatura
- Večja učinkovitost
- Preprosto in varno upravljanje
- Okolju prijazno
Ultrazvočna deacetilacija hitina v hitozan – protokol
1) Pripravite hitin:
Če kot izhodni material uporabljate oklepe rakovic, jih je treba temeljito oprati, da odstranite vse topne organske snovi in oprijete nečistoče, vključno z zemljo in beljakovinami. Nato je treba material oklepov popolnoma posušiti (npr. pri 60ºC za 24h v sušilniku). Posušene oklepe nato zmeljemo (npr. s kladivnim mlinom), deproteiniziramo v alkalnem mediju (npr. NaOH s koncentracijo od 0,125 do 5,0 M) in demineraliziramo v kislini (npr. razredčeni klorovodikovi kislini).
2) Ultrazvočna deacetilacija
Za izvedbo tipične reakcije ultrazvočne deacetilacije delce beta-hitina (0,125 mm < d < 0,250 mm) suspendiramo v 40% (w/w) vodni raztopini NaOH pri razmerju beta-hitin/vodna raztopina NaOH 1/10(g mL-1), suspenzijo prenesemo v stekleno čašo z dvojno steno in jo sonificiramo z ultrazvočnim homogenizatorjem Hielscher UP400St . Pri izvajanju reakcije ultrazvočne deacetilacije hitina vzdržujemo naslednje parametre konstantne (prim. Fiamingo et al. 2016): (i) ultrazvočna sonda (sonotroda Hielscher S24d22D, premer konice = 22 mm); (ii) pulzni način sonikacije (IP = 0,5sec); (iii) površinska intenziteta ultrazvoka
(I = 52,6 W cm-2), (iv) reakcijska temperatura (60ºC ±1ºC), (v) reakcijski čas (50 min), (vi) razmerje masa beta-hitina/prostornina 40% (w/w) vodne raztopine natrijevega hidroksida (BCHt/NaOH = 1/10 g mL-1); (vii) prostornina suspenzije beta-hitina (50mL).
Prva reakcija poteka 50min ob stalnem magnetnem mešanju, nato pa jo prekinemo s hitrim ohlajanjem suspenzije na 0ºC. Nato dodamo razredčeno klorovodikovo kislino, da dosežemo pH 8,5, vzorec CHs1 pa izoliramo s filtracijo, temeljito speremo z deionizirano vodo in posušimo pri pogojih okolice. Ko enako ultrazvočno deacetilacijo ponovimo kot drugi korak na CHs1, dobimo vzorec CHs2.
Posnetki z vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM) pri povečavi 100×: a) gladij, b) gladij, obdelan z ultrazvokom, c) β-hitin, d) β-hitin, obdelan z ultrazvokom, in e) hitozan (vir: Preto et al. 2017)
Fiamingo et al. so ugotovili, da ultrazvočna deacetilacija beta-hitina učinkovito proizvaja hitozan z visoko molekulsko maso in nizko stopnjo acetilacije brez uporabe dodatkov, inertne atmosfere ali dolgih reakcijskih časov, čeprav reakcija ultrazvočne deacetilacije poteka pri blažjih pogojih – tj. pri nizki reakcijski temperaturi v primerjavi z večino termokemičnih deacetilacij. Ultrazvočna deacetilacija beta-hitina omogoča pripravo naključno deacetiliranega hitozana s spremenljivo stopnjo acetilacije (4% ≤ DA ≤ 37%), visoko masno povprečno molekulsko maso (900.000 g mol-1 ≤ Mw ≤ 1.200.000 g mol-1 ) in nizko disperznostjo (1,3 ≤ Ð ≤ 1,4) z izvedbo treh zaporednih reakcij (50 min/korak) pri 60ºC.
Ultrazvočni procesorji visoke moči za laboratorijsko, pilotno in industrijsko merilo.
Visokozmogljivi ultrazvočni sistemi za proizvodnjo hitozana
Drobljenje hitina in deacetilacija hitina v hitozan zahtevata zmogljivo in zanesljivo ultrazvočno opremo, ki lahko zagotavlja visoke amplitude, omogoča natančen nadzor procesnih parametrov in lahko deluje 24/7 pri velikih obremenitvah in v zahtevnih okoljih. Ponudba izdelkov Hielscher Ultrasonics pokriva vaše potrebe in zahteve vašega procesa. Ultrazvočne naprave Hielscher so visokozmogljivi sistemi, ki jih je mogoče opremiti z dodatno opremo, kot so sonotrode, ojačevalniki amplitude, reaktorji ali pretočne celice, da se optimalno prilagodijo potrebam vašega procesa.
Digitalni barvni zaslon, možnost prednastavitve ciklov sonikacije, samodejno beleženje podatkov na vgrajeno kartico SD, daljinsko upravljanje prek brskalnika in številne druge funkcije zagotavljajo najvišjo stopnjo nadzora procesa in prijaznosti do uporabnika. Zaradi robustnosti in sposobnosti prenašanja velikih obremenitev so ultrazvočni sistemi Hielscher vaš zanesljivi delovni konj v proizvodnji.
Drobljenje in deacetilacija hitina zahtevata ultrazvok visoke moči za doseganje želene pretvorbe in končnega hitozanskega izdelka visoke kakovosti. Zlasti pri drobljenju hitinskih kosmičev so ključne visoke amplitude in povišani tlaki. Industrijski ultrazvočni procesorji Hielscher Ultrasonics zlahka zagotavljajo zelo visoke amplitude. Amplitude do 200µm je mogoče neprekinjeno vzdrževati pri delovanju 24/7. Za še višje amplitude so na voljo prilagojene ultrazvočne sonotrode. Razpoložljiva moč ultrazvočnih sistemov Hielscher omogoča učinkovito in hitro deacetilacijo v varnem procesu, prijaznem do uporabnika.
Spodnja preglednica prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih naprav:
| Prostornina šarže | Pretok | Priporočene naprave |
|---|---|---|
| 1 do 500mL | 10 do 200mL/min | UP100H |
| 10 do 2000mL | 20 do 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 do 20L | 0,2 do 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 do 100L | 2 do 10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 do 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | večji | sklop naprav UIP16000 |
Stopite v stik z nami! / Vprašajte nas!
Literatura/viri
- Butnaru E., Stoleru E., Brebu M.A., Darie-Nita R.N., Bargan A., Vasile C. (2019): Bionanokompozitni filmi na osnovi hitozana, pripravljeni z emulzijsko tehniko za konzerviranje živil. Materials 2019, 12(3), 373.
- Fiamingo A., de Moura Delezuk J.A., Trombotto St. David L., Campana-Filho S.P. (2016): Obsežno deacetiliran hitozan z visoko molekulsko maso, pridobljen z večstopenjsko ultrazvočno podprto deacetilacijo beta-hitina. Ultrasonics Sonochemistry 32, 2016. 79–85.
- Kjartansson, G., Wu, T., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Sonokemično podprta pretvorba hitina v hitozan, srečanje vodij raziskav Nacionalne raziskovalne pobude USDA, New Orleans, LA, June 28th.
- Kjartansson, G., Kristbergsson, K. Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Vpliv temperature med deacetilacijo hitina v hitozan s predobdelavo z ultrazvokom visoke intenzitete, letno srečanje Inštituta živilskih tehnologov, New Orleans, LA, June 30th, 95-18.
- Kjartansson, G., Kristbergsson, K., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Vpliv ultrazvoka visoke intenzitete na pospešitev pretvorbe hitina v hitozan, letno srečanje Inštituta živilskih tehnologov, New Orleans, LA, June 30th, 95-17.
- Preto M.F., Campana-Filho S.P., Fiamingo A., Cosentino I.C., Tessari-Zampieri M.C., Abessa D.M.S., Romero A.F., Bordon I.C. (2017): Gladij in njegovi derivati kot potencialni biosorbenti za ladijsko dizelsko gorivo. Environmental Science and Pollution Research (2017) 24:22.932–22.939.
- Wijesena R.N., Tissera N., Kannangara Y.Y., Lin Y., Amaratunga G.A.J., de Silva K.M.N. (2015): Metoda priprave hitozanskih nanodelcev in nanovlaken s pristopom od zgoraj navzdol. Carbohydrate Polymers 117, 2015. 731–738.
- Wu, T., Zivanovic, S., Hayes, D.G., Weiss, J. (2008). Učinkovito zmanjšanje molekulske mase hitozana z ultrazvokom visoke intenzitete: osnovni mehanizem in vpliv parametrov obdelave. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(13):5112-5119.
- Yadav M.; Goswami P.; Paritosh K.; Kumar M.; Pareek N.; Vivekanand V. (2019): Odpadki morske hrane: vir za pripravo komercialno uporabnih materialov iz hitina/hitozana. Bioresources and Bioprocessing 6/8, 2019.
Dejstva, ki jih je vredno poznati
Kako deluje ultrazvočna deacetilacija hitina?
Ko ultrazvok visoke moči in nizke frekvence (npr. 20–26kHz) sklopimo v tekočino ali suspenzijo, tekočino izpostavimo izmeničnim visokotlačnim/nizkotlačnim ciklom, ki ustvarjajo stiskanje in redčenje. Med temi izmeničnimi visokotlačnimi/nizkotlačnimi cikli nastajajo majhni vakuumski mehurčki, ki rastejo skozi več tlačnih ciklov. Ko vakuumski mehurčki ne morejo več absorbirati energije, silovito kolapsirajo. Med to implozijo mehurčkov se lokalno pojavijo zelo intenzivni pogoji: visoke temperature do 5000K, tlaki do 2000atm, zelo visoke hitrosti segrevanja/ohlajanja in tlačne razlike. Ker je dinamika kolapsa mehurčkov hitrejša od prenosa snovi in toplote, je energija v kolapsirajoči votlini omejena na zelo majhno območje, imenovano tudi »vroča točka«. Implozija kavitacijskega mehurčka povzroča tudi mikroturbulence, tekočinske curke s hitrostjo do 280m/s in posledične strižne sile. Ta pojav je znan kot ultrazvočna ali akustična kavitacija.
Te kavitacijske sile delujejo na kapljice in delce v sonificirani tekočini; ko pospešeni delci trčijo med seboj, se zaradi medsebojnih trkov zdrobijo. Akustična kavitacija je načelo delovanja ultrazvočnega mletja, dispergiranja, emulgiranja in sonokemije.
Pri deacetilaciji hitina ultrazvok visoke intenzitete povečuje površino z aktiviranjem površine in spodbujanjem prenosa snovi med delci in reagentom.
Hitozan
Hitozan je modificiran, kationski, netoksičen ogljikohidratni polimer s kompleksno kemijsko strukturo, ki jo tvorijo enote β-(1,4) glukozamina kot glavna sestavina (>80%) in enote N-acetilglukozamina (<20%), naključno razporejene vzdolž verige. Hitozan pridobivamo iz hitina s kemijsko ali encimsko deacetilacijo. Stopnja deacetilacije (DA) določa vsebnost prostih amino skupin v strukturi in se uporablja za razlikovanje med hitinom in hitozanom. Hitozan je dobro topen v blagih topilih, kot je razredčena ocetna kislina, in ima več prostih amino skupin, ki delujejo kot aktivna mesta. Zaradi tega ima hitozan v številnih kemijskih reakcijah prednost pred hitinom.
Hitozan je cenjen zaradi odlične biokompatibilnosti in biorazgradljivosti, netoksičnosti, dobrega protimikrobnega delovanja (proti bakterijam in glivam), neprepustnosti za kisik in sposobnosti tvorjenja filmov. V primerjavi s hitinom ima hitozan prednost, da je topen v vodi, zato sta ravnanje z njim in njegova uporaba v formulacijah lažja.
Hitin je drugi najpogostejši polisaharid za celulozo, zaradi njegove izjemne razširjenosti pa je poceni in trajnostna surovina.
Proizvodnja hitozana
Hitozan se proizvaja v dvostopenjskem procesu. V prvem koraku surovino, kot so oklepi rakov (tj. kozic, rakovic, jastogov), deproteiniziramo, demineraliziramo in očistimo, da pridobimo hitin. V drugem koraku hitin obdelamo z močno bazo (npr. NaOH), da odstranimo acetilne stranske verige in pridobimo hitozan. Običajni proces proizvodnje hitozana je znan kot zelo zamuden in stroškovno zahteven.
Hitin
Hitin (C8H13O5N)n je polimer β-1,4-N-acetilglukozamina z ravno verigo in ga razvrščamo v α-, β- in γ-hitin. Hitin je derivat glukoze in glavna sestavina zunanjih skeletov členonožcev, kot so raki in žuželke, strgač mehkužcev, kljunov glavonožcev ter lusk rib in sodobnih dvoživk, najdemo pa ga tudi v celičnih stenah gliv. Struktura hitina je primerljiva s strukturo celuloze in tvori kristalinične nanofibrile ali igličaste kristale. Celuloza je najpogostejši polisaharid na svetu, sledi pa ji hitin kot drugi najpogostejši polisaharid.
Glukozamin
Glukozamin (C6H13NO5) je amino sladkor in pomemben prekurzor v biokemijski sintezi glikoziliranih beljakovin in lipidov. Glukozamin je v naravi zelo razširjena spojina, ki je del strukture obeh polisaharidov, hitozana in hitina, zaradi česar je eden najpogostejših monosaharidov. Večina komercialno dostopnega glukozamina se proizvaja s hidrolizo zunanjih skeletov rakov, tj. oklepov rakovic in jastogov.
Glukozamin se uporablja predvsem kot prehransko dopolnilo v oblikah glukozamin sulfata, glukozamin hidroklorida ali N-acetilglukozamina. Dopolnila z glukozamin sulfatom se jemljejo peroralno za zdravljenje bolečega stanja, ki ga povzročajo vnetje, razgradnja in sčasoma izguba hrustanca (osteoartritis).