Высокопроизводительная подготовка образцов для митохондриальной диагностики
Митохондриальную диагностику в научных исследованиях и клинической практике проводят с помощью различных методов, таких как секвенирование, ПЦР и биохимические анализы. Эти методы используют для выявления мутаций ДНК и измерения функции митохондрий. Секвенирование помогает обнаружить генетические мутации, а ПЦР позволяет количественно определять конкретные последовательности ДНК. Биохимические анализы оценивают функциональность митохондриальных белков и ферментов.
Диагностика митохондриальных заболеваний особенно сложна из-за выраженной клинической вариабельности этих заболеваний, а также из-за сложного взаимодействия между двумя геномами с различными типами наследования: митохондриальной ДНК (mtDNA) и ядерным геномом.
Выделение и фрагментация ДНК с помощью обработки ультразвуком
Выделение ДНК из мышечной ткани особенно полезно при подозрении на тканеспецифические изменения mtDNA. Эти изменения могут включать делеции mtDNA при хронической прогрессирующей наружной офтальмоплегии (CPEO), точечные мутации mtDNA при митохондриальных миопатиях или истощение mtDNA при синдроме Альперса. ДНК, выделенную из мышечной ткани, затем можно использовать для различных генетических исследований, таких как Саузерн-блоттинг и ПЦР длинных фрагментов для выявления делеций, ПЦР в реальном времени для выявления истощения или секвенирование для выявления точечных мутаций.
Обработка ультразвуком с использованием интенсивных ультразвуковых волн применяется для решения ряда задач в митохондриальной диагностике. Ее используют для лизиса клеток с целью извлечения внутриклеточного содержимого, такого как митохондрии и ДНК, для фрагментации ДНК, в том числе mtDNA и nDNA, под действием сдвига для секвенирования, а также для гомогенизации образцов.
Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для планшетов для высокопроизводительной подготовки образцов равномерно обрабатывает ультразвуком образцы в многолуночных и 96-луночных планшетах
Как выделить митохондрии из клеток и тканей
Выделение митохондрий включает два основных этапа: разрушение клеток для высвобождения их содержимого и применение дифференциального центрифугирования для разделения и получения митохондриальных фракций.
Обработка ультразвуком
Ультразвуковые аппараты Hielscher совместимы со стандартными буферами и наборами для лизиса, что делает их подходящими для выделения митохондрий. Обработка ультразвуком служит двум основным целям:
- Лизис клеток: Ультразвуковые волны разрушают клеточные мембраны, высвобождая внутриклеточное содержимое.
- Разрушение митохондрий: Обработка ультразвуком на последующем этапе может разрушить митохондрии для высвобождения митохондриальных белков или митохондриальной ДНК.
- Фрагментация mtDNA: Обработка ультразвуком – надежный метод фрагментации митохондриальной ДНК под действием сдвига для секвенирования.
Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для многолуночных планшетов позволяет выполнять высокопроизводительную подготовку митохондриальных образцов. В сочетании с дифференциальным центрифугированием обработка ультразвуком повышает эффективность выделения митохондрий, обеспечивая высокий выход неповрежденных митохондрий, пригодных для различных последующих применений.
Ультразвуковой аппарат Hielscher UIP400MTP для многолуночных планшетов работает с любым стандартным планшетом
Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для многолуночных планшетов обеспечивает многочисленные преимущества для высокопроизводительной подготовки образцов, например в митохондриальной диагностике.
Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для многолуночных планшетов для высокопроизводительной подготовки образцов при диагностике по биомаркерам.
Пример инструкции по ультразвуковой фрагментации mtDNA
Подготовка и извлечение:
- Мышей C57BL/6 умерщвляли путем шейной дислокации.
- Печень быстро извлекали и промывали в ледяном стерильном PBS.
Выделение митохондрий:
- Митохондрии выделяли с помощью гомогенизатора тканей Даунса объемом 2 mL и набора для выделения митохондрий из тканей.
- Начальное центрифугирование при 700× g и 3 000× g.
- Выполните два дополнительных этапа промывки буфером C.
Выделение ДНК:
- Осадок после первого центрифугирования при 700× g использовали для выделения ядерной ДНК (nDNA).
- ДНК выделяли с помощью центрифужных колонок.
- Митохондриальную ДНК (mtDNA) выделяли из изолированных митохондрий.
- Ядерную ДНК (nDNA) выделяли из неочищенных ядерных экстрактов; оба типа ДНК получали из ткани печени мышей.
Фрагментация ДНК:
- ДНК фрагментировали на льду с помощью ультразвукового аппарата UP50H с частотой 30 kHz и мощностью 50 W, оснащенного сонотродом с микронаконечником диаметром 0,5 mm, при 14 μm в течение 2 × 30 секунд.
Визуализация и количественная оценка фрагментации:
- Фрагментацию после обработки ультразвуком визуализировали в 1% агарозном геле с красителем ДНК SYBR safe.
- Относительное содержание mtDNA и nDNA определяли с помощью qPCR.
(см. Mariero et al., 2019)
Для высокопроизводительной подготовки образцов ультразвуковой аппарат UIP400MTP для многолуночных планшетов облегчает подготовку большого количества образцов в стандартных 96-луночных, многолуночных и микротитрационных планшетах.
Узнайте больше о преимуществах высокопроизводительной подготовки образцов с помощью UIP400MTP!
Советы по оптимальному выделению митохондрий с помощью обработки ультразвуком:
- Контроль температуры: Проводите все этапы в диапазоне температур от 0°C до 4°C. Это критически важно для сохранения целостности и функциональности митохондрий.
- Эффективность и скорость: Работайте быстро и очищайте митохондрии только до степени, необходимой для вашего конкретного применения. Избыточные манипуляции могут привести к значительным потерям митохондриального содержимого.
- Разведение суспензий: Поддерживайте низкие концентрации суспензий клеток и органелл на протяжении всего процесса выделения. Это помогает минимизировать риски захвата и агглютинации, тем самым повышая чистоту выделенных митохондрий.
- Объем образца: Отдавайте предпочтение нескольким процедурам подготовки небольших объемов вместо одной процедуры с большим объемом. Такой подход обычно обеспечивает более высокий выход, поскольку увеличение масштаба не приводит к пропорциональному увеличению количества митохондрий, которые можно получить. Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для многолуночных планшетов облегчает быстрый и надежный лизис клеток для выделения митохондрий, а также выделение белков из митохондрий.
Эти рекомендации повысят эффективность процесса выделения с использованием ультразвукового лизиса и центрифугирования, обеспечивая получение высококачественных митохондриальных препаратов, пригодных для последующих применений.
Ультразвуковые аппараты Hielscher – качество, произведенное в Германии
Ультразвуковые аппараты Hielscher известны высочайшим качеством и высочайшими стандартами проектирования. Прочность и простота эксплуатации позволяют без затруднений интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с тяжелыми условиями и высокими требованиями рабочей среды.
Hielscher Ultrasonics – компания, сертифицированная по ISO, которая уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, сочетающим самые современные технологии и удобство использования. Разумеется, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и требованиям UL, CSA и RoHs.
Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для 96-луночных планшетов для обработки ультразвуком микротитрационных и многолуночных планшетов
Литература / Ссылки
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Часто задаваемые вопросы о митохондриях и митохондриальной диагностике
Что такое митохондрии?
Митохондрии – окруженные мембранами органеллы, присутствующие в клетках большинства эукариотических организмов. Их называют энергетическими станциями клетки, поскольку они производят энергию в форме аденозинтрифосфата (АТФ) в процессе клеточного дыхания. Кроме того, митохондрии имеют собственную ДНК и играют ключевую роль в других клеточных процессах, включая регуляцию клеточного цикла и гибели клеток.
Чем mtDNA отличается от геномной ДНК?
Митохондриальная ДНК (mtDNA) отличается от геномной ДНК (gDNA) по нескольким ключевым признакам. MtDNA находится в митохондриях, имеет кольцевую форму и наследуется по материнской линии, тогда как gDNA находится в ядре клетки, имеет линейную форму и наследуется от обоих родителей. MtDNA значительно меньше и кодирует только 37 генов, тогда как gDNA содержит около 20 000–25 000 генов. MtDNA присутствует в клетке в нескольких копиях, имеет более высокую частоту мутаций и преимущественно кодирует белки, участвующие в функционировании митохондрий. В отличие от нее, gDNA обычно диплоидна, имеет более низкую частоту мутаций и кодирует огромное множество генов, необходимых для развития и функционирования организма. Кроме того, транскрипция и трансляция mtDNA происходят внутри митохондрий, тогда как транскрипция gDNA происходит в ядре, а трансляция – в цитоплазме. Эти различия отражают их разные роли и эволюционное происхождение.
Что такое бесклеточный экстракт?
Бесклеточный экстракт – это раствор, содержащий содержимое лизированных клеток, включая белки, нуклеиновые кислоты и другие клеточные компоненты, но без неповрежденных клеточных мембран. Этот экстракт используют в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях для изучения клеточных процессов in vitro, что позволяет исследователям анализировать реакции и механизмы вне живых клеток.
Какую роль играют ПЦР-тесты в митохондриальной диагностике?
ПЦР-тесты играют важнейшую роль в митохондриальной диагностике, позволяя выявлять мутации, делеции или изменения числа копий митохондриальной ДНК (mtDNA). Они позволяют амплифицировать определенные участки mtDNA для выявления патогенных вариантов, связанных с митохондриальными заболеваниями. Методы на основе ПЦР, такие как количественная ПЦР (qPCR) и ПЦР длинных фрагментов, также используют для оценки целостности mtDNA, уровня гетероплазмии и истощения mtDNA, предоставляя важнейшую информацию о функции митохондрий и заболеваниях.
Узнайте, как ультразвуковой аппарат UIP400MTP для микропланшетов облегчает проведение ПЦР-тестов и анализов!
Что такое дифференциальное центрифугирование?
Дифференциальное центрифугирование – широко используемый метод фракционирования клеток и выделения митохондрий. Этот метод разделяет клеточные структуры по их коэффициенту седиментации, который зависит как от плотности, так и от формы. Процесс предполагает воздействие центробежных сил различной величины на образцы в буферных солевых растворах с определенной плотностью. Структуры с близкими коэффициентами седиментации оседают на дно пробирки для сбора одновременно, что позволяет их получить.
Как дифференциальное центрифугирование используют для выделения митохондрий?
Дифференциальное центрифугирование позволяет исследователям эффективно отделять митохондриальные фракции от других клеточных компонентов. Выделение митохондрий включает несколько этапов центрифугирования и последующее получение изолята.
Начальное центрифугирование: Примените небольшую центробежную силу для осаждения крупных клеточных обломков и ядер.
Последующие центрифугирования: Поэтапно увеличивайте центробежную силу для осаждения фракций, обогащенных митохондриями. На каждом этапе центрифугирования удаляются структуры со все более высокими коэффициентами седиментации.
Получение фракций: После каждого центрифугирования собирают осадок, а надосадочную жидкость подвергают воздействию более высоких g-сил для выделения следующей фракции. Это повторяют до достижения требуемой чистоты митохондрий.