Высокопроизводительная пробоподготовка для митохондриальной диагностики
Митохондриальная диагностика в научных центрах и клиниках проводится с использованием различных методов, таких как секвенирование, ПЦР и биохимические анализы. Эти методы используются для выявления мутаций ДНК и измерения функции митохондрий. Секвенирование помогает обнаружить генетические мутации, в то время как ПЦР может количественно определить конкретные последовательности ДНК. Биохимические анализы оценивают функциональность митохондриальных белков и ферментов.
Диагностика митохондриальных заболеваний особенно затруднена из-за выраженной клинической изменчивости этих заболеваний, а также из-за сложного взаимодействия между двумя по-разному наследуемыми геномами: митохондриальной ДНК (мтДНК) и ядерным геномом.
Экстракция и фрагментация ДНК с помощью ультразвуковой обработки
Экстракция ДНК из мышечной ткани особенно полезна при подозрении на тканеспецифические изменения мтДНК. Эти изменения могут включать делеции мтДНК при хронической прогрессирующей наружной офтальмоплегии (CPEO), точечные мутации мтДНК при митохондриальных миопатиях или истощение мтДНК при синдроме Альперса. ДНК, извлеченная из мышечной ткани, затем может быть использована для различных генетических тестов, таких как Саузерн-блот и ПЦР дальнего действия для делеций, ПЦР в реальном времени для истощения или секвенирование для точечных мутаций.
Ультразвуковая обработка с использованием интенсивных ультразвуковых волн применяется для нескольких применений в митохондриальной диагностике. Он используется для лизирования клеток, извлечения внутриклеточного содержимого, такого как митохондрии и ДНК, для среза ДНК, такой как мтДНК и нДНК, для секвенирования, а также для гомогенизации образцов.
UIP400MTP Планшетный ультразвуковой аппарат для высокопроизводительной пробоподготовки равномерно обрабатывает образцы ультразвуком в многолуночных и 96-луночных планшетах
Как выделить митохондрии из клеток и тканей
Митохондриальная изоляция состоит из двух основных этапов: разрушение клеток для высвобождения их содержимого и использование дифференциального центрифугирования для отделения и восстановления митохондриальных фракций.
Ультразвуковая обработка
Ультразвуковые аппараты Hielscher совместимы со стандартными лизисными буферами и комплектами, что делает их пригодными для изоляции митохондрий. Ультразвуковая обработка служит двум основным целям:
- Лизис клеток: Ультразвуковые волны разрушают клеточные мембраны, высвобождая внутриклеточное содержимое.
- Митохондриальное разрушение: Ультразвуковая обработка на следующем этапе может разорвать митохондрии для высвобождения митохондриальных белков или митохондриальной ДНК.
- Фрагментация мтДНК: Ультразвуковая обработка является надежным методом среза митохондриальной ДНК для секвенирования.
Многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP обеспечивает высокопроизводительную подготовку образцов митохондрий. В сочетании с дифференциальным центрифугированием ультразвуком повышает эффективность выделения митохондрий, обеспечивая высокий выход неповрежденных митохондрий, пригодных для различных последующих применений.
Hielscher UIP400MTP многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат Работает с любой стандартной пластиной
Многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP обладает многочисленными преимуществами для высокопроизводительной пробоподготовки, например, в митохондриальной диагностике.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator для высокопроизводительной пробоподготовки в диагностике биомаркеров.
Примерная инструкция по ультразвуковой фрагментации мтДНК
Подготовка и экстракция:
- Мышей C57BL/6 умерли от вывиха шейки матки.
- Печень быстро извлекалась и промывалась в ледяной стерильной PBS.
Выделение митохондрий:
- Митохондрии выделяли с помощью тканевого измельчителя Dounce объемом 2 мл и набора для выделения тканей из митохондрий.
- Начальное центрифугирование при 700× г и 3 000× г.
- Выполните два дополнительных этапа промывки с буфером C.
Выделение ДНК:
- Гранула из первого центрифугирования при 700× г была использована для выделения ядерной ДНК (нДНК).
- ДНК выделяли с помощью спиновых столбиков.
- Митохондриальная ДНК (мтДНК) была выделена из изолированных митохондрий.
- Ядерная ДНК (нДНК) была выделена из сырых ядерных экстрактов, как из ткани печени мыши.
Фрагментация ДНК:
- ДНК фрагментировали на льду с помощью ультразвукового ультразвукового аппарата UP50H мощностью 30 кГц/50 Вт с микрозондом 0,5 мм при длине волны 14 мкм в течение 2 × 30 секунд.
Визуализация и количественная оценка фрагментации:
- Фрагментацию после ультразвука визуализировали на 1% агарозном геле с безопасным ДНК-красителем SYBR.
- Относительную распространенность мтДНК и нДНК определяли методом количественной ПЦР.
(ср. Mariero et al., 2019)
Для высокопроизводительной пробоподготовки многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP облегчает подготовку больших объемов образцов в стандартных 96-луночных, многолуночных и микротитровых планшетах.
Узнайте больше о преимуществах высокопроизводительной подготовки образцов с помощью UIP400MTP!
Советы по оптимальной изоляции митохондрий с помощью ультразвуковой обработки:
- Контроль температуры: Проводите все этапы в диапазоне температур от 0°C до 4°C. Это имеет решающее значение для поддержания целостности и функциональности митохондрий.
- Эффективность и скорость: Работайте быстро и очищайте митохондрии только в той степени, в которой это необходимо для вашего конкретного применения. Чрезмерные манипуляции могут привести к значительным потерям митохондриального содержимого.
- Разбавление суспензий: Поддерживайте низкие концентрации суспензий клеток и органелл на протяжении всего процесса выделения. Это помогает свести к минимуму риски захвата и агглютинации, тем самым улучшая чистоту изолированных митохондрий.
- Объем образца: Выбирайте несколько небольших препаратов, а не одну большую. Такой подход обычно приводит к повышению урожайности, так как увеличение масштаба не приводит к пропорциональному увеличению количества восстанавливаемых митохондрий. Многолуночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP способствует быстрому и надежному лизису клеток для выделения митохондрий, а также экстракции белка из митохондрий.
Эти рекомендации сделают процесс выделения с использованием ультразвукового лизиса и центрифугирования более эффективным, что позволит получить высококачественные митохондриальные препараты, пригодные для последующих применений.
Ультразвуковые аппараты Hielscher – Качество «Сделано в Германии»
Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны своими высочайшими стандартами качества и дизайна. Надежность и простота в эксплуатации позволяют без проблем интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с суровыми условиями и требовательными условиями окружающей среды.
Hielscher Ultrasonics является компанией, сертифицированной по стандарту ISO, и уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, отличающимся самыми современными технологиями и удобством в использовании. Конечно, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и соответствуют требованиям UL, CSA и RoHs.
96-луночный планшетный ультразвуковой аппарат UIP400MTP для ультразвуковой обработки микротитровых и многолуночных планшетов
Литература / Литература
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Часто задаваемые вопросы о митохондриях и митохондриальной диагностике
Что такое митохондрии?
Митохондрии — это связанные с мембранами органеллы, обнаруженные в клетках большинства эукариотических организмов. Они известны как электростанции клетки, потому что они производят энергию в форме аденозинтрифосфата (АТФ) в процессе клеточного дыхания. Кроме того, митохондрии имеют свою собственную ДНК и играют ключевую роль в других клеточных процессах, включая регуляцию клеточного цикла и гибель клеток.
Что отличает мтДНК от геномной ДНК?
Митохондриальная ДНК (мтДНК) отличается от геномной ДНК (гДНК) по нескольким ключевым параметрам. МтДНК расположена в митохондриях, является кольцевой и наследуется по материнской линии, в то время как гДНК расположена в ядре клетки, является линейной и наследуется от обоих родителей. МтДНК намного меньше, она кодирует всего 37 генов, в то время как гДНК содержит около 20 000-25 000 генов. МтДНК присутствует в нескольких копиях на клетку, имеет более высокую частоту мутаций и в первую очередь кодирует белки, участвующие в функции митохондрий. Напротив, гДНК обычно диплоидна, имеет более низкую частоту мутаций и кодирует широкий спектр генов, необходимых для развития и функционирования организма. Кроме того, транскрипция и трансляция мтДНК происходят в митохондриях, тогда как транскрипция гДНК происходит в ядре, а трансляция происходит в цитоплазме. Эти различия отражают их различные роли и эволюционное происхождение.
Что такое бесклеточный экстракт?
Бесклеточный экстракт — это раствор, содержащий содержимое лизированных клеток, включая белки, нуклеиновые кислоты и другие клеточные компоненты, но без интактных клеточных мембран. Этот экстракт используется в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях для изучения клеточных процессов in vitro, что позволяет исследователям анализировать реакции и механизмы за пределами живых клеток.
Какую роль играют ПЦР-тесты в митохондриальной диагностике?
ПЦР-тесты играют важную роль в митохондриальной диагностике, позволяя обнаруживать мутации, делеции или вариации числа копий в митохондриальной ДНК (мтДНК). Они позволяют проводить амплификацию определенных участков мтДНК для выявления патогенных вариантов, связанных с митохондриальными нарушениями. Методы на основе ПЦР, такие как количественная ПЦР (кПЦР) и дальняя ПЦР, также используются для оценки целостности мтДНК, уровней гетероплазмии и истощения мтДНК, что дает важную информацию о функции митохондрий и заболеваниях.
Узнайте, как ультразвуковой аппарат UIP400MTP Microplate облегчает проведение ПЦР-тестов и анализов!
Что такое дифференциальное центрифугирование?
Дифференциальное центрифугирование является широко используемым методом фракционирования клеток и выделения митохондрий. Этот метод разделяет клеточные структуры на основе их коэффициента седиментации, который зависит как от плотности, так и от формы. Этот процесс включает в себя приложение различных уровней центробежной силы к образцам в буферных растворах солей с определенной плотностью. Структуры с аналогичными коэффициентами осаждения будут оседать на дне сборной трубки в то же время, что позволит их восстановить.
Как дифференциальное центрифугирование используется для выделения митохондрий?
Дифференциальное центрифугирование позволяет исследователям эффективно отделять митохондриальные фракции от других клеточных компонентов. Выделение митохондрий включает в себя несколько этапов центрифугирования и последующее восстановление изолята.
Первичное центрифугирование: Прикладывайте низкую центробежную силу для осаждения крупного клеточного мусора и ядер.
Последующие центрифугирования: Увеличивайте центробежную силу ступенчато до гранул фракций, обогащенных митохондриями. На каждом этапе центрифугирования удаляются структуры с постепенно повышающимися коэффициентами осаждения.
Извлечение фракции: После каждого центрифугирования гранула собирается, а надосадочная жидкость подвергается воздействию более высоких перегрузок для выделения следующей фракции. Это повторяется до тех пор, пока не будет достигнута желаемая чистота митохондрий.