Liza celulelor de drojdie în microplăci prin sonicare de intensitate ridicată

Microbiologii și cercetătorii din domeniul științelor vieții care lucrează cu Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, iar cei care lucrează cu alte sisteme bazate pe drojdie cunosc această provocare: celulele de drojdie sunt rezistente, liza reproductibilă poate fi dificilă, iar disrupția manuală a probelor devine rapid un punct de blocaj atunci când trebuie analizate numeroase tulpini, clone, condiții de cultură sau construcții de expresie.

Liza drojdiei cu randament ridicat pentru microbiologie, biologie moleculară și analiza proteinelor

Sonicatoarele Hielscher pentru microplăci, precum modelele UIP400MTP (400 W) și UIP550MTP (550 W), oferă o soluție de mare capacitate pentru liza mecanică a celulelor de drojdie direct în microplăci. În loc să se prelucreze probele una câte una cu o sondă, microplacile întregi pot fi supuse tratamentului cu ultrasunete în condiții uniforme. Acest lucru face ca liza cu ultrasunete a drojdiei să fie mai rapidă, mai reproductibilă și mai ușor de integrat în fluxurile de lucru moderne din microbiologie, expresia proteinelor, screeningul enzimelor și domeniul omicii.
Fie că aveți nevoie să extrageți proteine recombinante din P. pastoris, să pregătiți lizate de drojdie pentru teste enzimatice, să distrugeți celule de S. cerevisiae pentru analiza proteinelor sau să selectați zeci de clone de drojdie în paralel, sonicatoarele pentru microplăci Hielscher asigură o distrugere puternică a celulelor bazată pe cavitație, cu un control precis al procesului.

De ce celulele de drojdie necesită o liză mecanică eficientă

Celulele de drojdie sunt mai greu de lizat decât multe celule bacteriene sau mamifere, deoarece sunt protejate de un perete celular rigid, compus în principal din polizaharide, glucani, manoproteine și chitină. Acest perete celular asigură stabilitatea mecanică, dar limitează totodată eliberarea proteinelor intracelulare, a acizilor nucleici, a metaboliților și a enzimelor.
Metodele convenționale de liză a drojdiei includ omagierea cu bile, digestia enzimatică, ciclurile de îngheț-dezgheț, liza chimică și sonicația cu sondă. Aceste metode pot fi eficiente, dar prezintă și anumite limitări. Agitarea cu bile poate genera resturi și încălzire, digestia enzimatică poate crește costurile și variabilitatea, iar sonicația cu sondă pentru o singură probă este consumatoare de timp atunci când trebuie procesate un număr mare de probe.
Cavitația ultrasonică focalizată, de intensitate ridicată, depășește aceste limitări prin aplicarea unor forțe mecanice de forfecare intense, a fluctuațiilor de presiune și a microcurenților asupra suspensiei de drojdie. Rezultatul constă în ruperea rapidă a pereților celulari și a membranelor, o eliberare intracelulară îmbunătățită și o pregătire a probelor extrem de reproductibilă în format de placă.

Sonicarea microplăcilor pentru pregătirea în paralel a probelor de drojdie

Aparatele Hielscher UIP400MTP și UIP550MTP sunt concepute pentru sonicare uniformă a microplăcilor, a plăcilor cu mai multe godeuri, a plăcilor PCR și a suporturilor adecvate pentru probe. Spre deosebire de sonicarea cu sondă, probele nu trebuie tratate individual. Placa completă este expusă la energie ultrasonică controlată, ceea ce face ca acest flux de lucru să fie extrem de potrivit pentru procesarea paralelă a probelor.

Acest lucru este deosebit de util pentru:

• screening Drojdia de panificație mutanți sau tulpini de expresie
• Liza Tată, păstor / K. phaffii clone după exprimarea proteinei recombinante
• Prepararea lizatelor de drojdie pentru testele enzimatice
• Extracția proteinelor pentru SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS sau testarea activității
• Eliberarea metaboliților intracelulari în scopuri metabolomice
• Pregătirea probelor de ADN și ARN după o purificare adecvată în etapele ulterioare
• Optimizarea la scară largă a tampoanelor de liză, a aditivilor și a condițiilor de extracție

Cum distruge cavitația ultrasonică celulele de drojdie

În timpul sonicației, ultrasunetele focalizate de mare putere generează cicluri alternante de compresie și rarefiere în proba lichidă. La o intensitate suficientă, aceste fluctuații de presiune produc cavitație acustică. Bulele de cavitație se formează, oscilează și se prăbușesc, generând forțe de forfecare localizate, microjeturi, turbulențe și gradienți puternici de presiune.
În suspensiile de drojdie, aceste efecte mecanice slăbesc și rup peretele celular și membrana celulară. Proteinele intracelulare, enzimele, acizii nucleici și metaboliții sunt eliberați în tamponul de liză. Deoarece procesul este de natură mecanică, acesta poate fi utilizat cu numeroase sisteme tampon diferite și poate fi combinat cu inhibitori de protează, agenți reducători, detergenți, săruri sau un pretratament enzimatic ușor.

Protocol general: Liza celulelor de drojdie în microplăci

Protocolul de mai jos oferă un punct de plecare practic pentru liza drojdiei cu ajutorul sonicatorului pentru microplăci Hielscher UIP400MTP sau UIP550MTP. Parametrii trebuie optimizați în funcție de tulpina de drojdie, densitatea celulară, molecula țintă, compoziția tamponului, tipul plăcii și testul ulterior.

1. Recoltarea și spălarea celulelor de drojdie

Cultivați Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces sau o altă tulpină de drojdie în condițiile de cultură dorite. Recoltați celulele prin centrifugare și îndepărtați mediul de cultură. Spălați sedimentul cu apă distilată rece, PBS sau tamponul de liză selectat pentru a îndepărta componentele reziduale ale mediului care ar putea interfera cu analizele ulterioare.
Pentru extragerea proteinelor, păstrați probele la rece și lucrați rapid. Dacă există riscul apariției proteazelor, răciți în prealabil toate tampoanele și consumabilele.

2. Resuspendeți sedimentul celular

Resuspendeți sedimentul de drojdie într-un tampon de liză rece adecvat. Pentru o eliberare eficientă a proteinelor, o densitate celulară ridicată este adesea avantajoasă. Ca punct de plecare, utilizați aproximativ 10–20 % g/v din sedimentul celular umed sau o suspensie densă corespunzătoare unei OD₆₀₀ > 10, în funcție de test.

Un tampon tipic de liză a proteinelor din drojdie poate conține:

• un sistem tampon, cum ar fi Tris-HCl, tampon fosfat sau HEPES
• sare, cum ar fi NaCl sau KCl
• Cocktail inhibitor de protează
• un agent reducător opțional, cum ar fi DTT sau β-mercaptoetanolul
• detergent opțional, cum ar fi Triton X-100, NP-40, SDS sau CHAPS, în funcție de compatibilitatea cu etapele ulterioare
• inhibitori opționali ai fosfatazei pentru studiile privind fosforilarea

În cazul tulpinilor de drojdie dificile sau pentru o extracție foarte delicată a proteinelor, se poate recurge la un pretratament scurt cu Zymolyase, Lyticase sau o altă enzimă care descompune peretele celular, înainte de sonicare. Acest pretratament enzimatic este opțional, dar poate îmbunătăți eficiența lizei sau reduce intensitatea ultrasonică necesară.

3. Transferați probele într-o microplacă adecvată

Turnați suspensia de drojdie într-o microplacă compatibilă cu sonicația. Plăcile cu fund rotund sunt adesea preferate, deoarece îmbunătățesc colectarea probelor și reduc zonele moarte. Utilizați volume egale de probă în toate godeurile pentru a îmbunătăți reproductibilitatea.
Acoperiți placa cu un covoraș sau o folie de etanșare adecvată pentru a preveni evaporarea, formarea de aerosoli și contaminarea încrucișată. Asigurați-vă că materialul de etanșare este compatibil cu temperatura și condițiile de sonicare selectate.
Volumele tipice de lucru depind de formatul plăcii și de aplicație. Printre formatele obișnuite se numără plăcile cu 96 de godeuri, plăcile cu godeuri adânci, plăcile pentru PCR sau suporturile adecvate pentru eprubete.

4. Configurarea sistemului de răcire

Liza drojdiei necesită o intensitate ultrasonică ridicată, iar ruperea mecanică generează căldură. Prin urmare, controlul temperaturii este esențial, în special pentru analiza proteinelor, enzimelor, ARN-ului sau a fosforilării.

Folosiți o strategie de răcire adecvată, cum ar fi:

• tampon de liză răcit în prealabil
• microplăci pre-răcite
• pauze de răcire între intervalele de sonicare
• răcirea externă a platformei de sonicare, dacă este cazul

Scopul este acela de a menține proba la o temperatură suficient de scăzută pentru a preveni denaturarea proteinelor, inactivarea enzimelor, degradarea ARN-ului și variabilitatea probei indusă de căldură.

5. Se tratează cu ultrasunete suspensia de drojdie

Așezați placa sigilată în sonicatorul pentru microplăci Hielscher UIP400MTP sau UIP550MTP și selectați un program de sonicare pulsată. Se recomandă utilizarea modului pulsat, deoarece acesta permite fragmentarea mecanică în fazele de activare (ON) și disiparea căldurii în fazele de oprire (OFF).
Ca punct de plecare pentru liza celulelor de drojdie:

În cazul suspensiilor de drojdie foarte rezistente, al biomasei dense de P. pastoris sau al extracției dificile a proteinelor recombinante, creșteți treptat timpul cumulativ de activare (ON-time). Pentru proteinele sensibile la căldură sau pentru testele enzimatice, utilizați impulsuri mai scurte, pauze de răcire mai lungi și o amplitudine inițială mai mică.

Liza drojdiei cu randament ridicat în plăci cu mai multe godeuri cu ajutorul aparatului UIP400MTP

6. Clarificarea lizatului

După tratarea cu ultrasunete, centrifugați microplaca sau transferați probele în eprubete pentru centrifugare. Îndepărtați resturile celulare prin centrifugare la o viteză și o temperatură adecvate. Recoltați supernatantul pentru analizele ulterioare.

În funcție de aplicație, lizatul poate fi utilizat pentru:

• Cuantificarea proteinelor
• testele de activitate enzimatică
• SDS-PAGE și Western blotting
• ELISA și testele imunologice
• Proteomică LC-MS/MS
• analiza metaboliților
• Purificarea ADN-ului sau ARN-ului

7. Optimizarea și documentarea metodei

Pentru a asigura reproducibilitatea lizei drojdiei, înregistrați toți parametrii relevanți, inclusiv tulpina, condițiile de cultură și OD₆₀₀, masa celulei umede, compoziția tamponului, tipul plăcii, volumul probei, amplitudinea, ciclul de impulsuri, timpul cumulativ de funcționare, metoda de răcire și temperatura finală a probei.
În cazul în care sonicatorul Hielscher este echipat cu funcția de înregistrare automată a datelor, datele de proces pot fi utilizate pentru documentare, dezvoltarea metodelor, extinderea la scară mai mare și controlul calității.

Sfaturi de optimizare pentru liza drojdiei

Pentru o eliberare maximă a proteinelor, utilizați suspensii dense de drojdie, o intensitate ultrasonică ridicată și un timp cumulativ de funcționare suficient. În cazul proteinelor sensibile, reduceți amplitudinea, prelungiți pauzele de răcire și mențineți placa rece pe toată durata ciclului.
Dacă liza este incompletă, măriți treptat durata de sonicare, încercați un pretratament enzimatic, reduceți vâscozitatea probei sau optimizați tamponul. Dacă proteinele se degradează sau își pierd activitatea, îmbunătățiți răcirea, scurtați intervalele de ON, adăugați inhibitori și verificați dacă sistemul detergent este compatibil cu proteina țintă.
Deoarece tulpinile de drojdie diferă substanțial în ceea ce privește structura peretelui celular, faza de creștere, sistemul de expresie și densitatea biomasei, se recomandă utilizarea unei matrice de optimizare succinte. De exemplu, testați trei amplitudini, două cicluri de impulsuri și două durate totale de activare, apoi evaluați eficiența lizei și integritatea proteinei.

Avantajele sonicatoarelor pentru microplăci Hielscher în cazul lizei drojdiei

Sonicatoarele Hielscher pentru microplăci sunt ideale pentru laboratoarele care au nevoie de o liză reproductibilă pentru un număr mare de probe. Acestea elimină procesul lent de prelucrare a probelor, una câte una, caracteristic sonicației cu sondă, și reduc variabilitatea cauzată de poziționarea manuală a sondei, adâncimea de imersie și diferențele de manipulare de la o probă la alta.

Principalele avantaje includ:

• Procesare cu randament ridicat: Tratați cu ultrasunete mai multe probe de drojdie în paralel, în microplăci sau în suporturi compatibile pentru probe.
• Condiții reproductibile: Condiții de sonicare identice în toate godeurile, pentru a obține rezultate de liză uniforme și comparabile.
• Fără contaminare încrucișată a sondelor: Probele rămân sigilate pe durata tratării cu ultrasunete, ceea ce reduce contaminarea încrucișată și numărul etapelor de curățare.
• Potrivit pentru celule rezistente: Ultrasunetele de intensitate ridicată contribuie la distrugerea pereților celulari ai drojdiei.
• Un flux de lucru eficient: Ideal pentru screeningul tulpinilor, clonelor, condițiilor de expresie și tampoanelor de liză.
• Un flux de lucru eficient: Setări programabile, înregistrare automată a datelor și compatibilitate cu automatizarea de laborator.

Aplicații în biotehnologia drojdiei și în cercetarea din domeniul științelor vieții

Liza ultrasonică a drojdiilor în microplăci susține numeroase fluxuri de lucru de cercetare și screening. În expresia proteinelor recombinante, clonele de P. pastoris și S. cerevisiae pot fi lizate în paralel pentru a compara nivelurile de expresie sau activitatea enzimatică. În biologia sistemelor și în domeniul omicii, liza standardizată îmbunătățește comparabilitatea între diferite condiții. În microbiologie, sonicația permite prepararea rapidă a lizatelor provenite de la mai multe tulpini, condiții de mediu sau tratamente de stres.
Domeniile tipice de aplicare includ:

• extragerea proteinelor din drojdie
• screeningul proteinelor recombinante
• analiza activității enzimatice
• selectarea clonelor după transformare
• optimizarea fermentației
• pregătirea probelor pentru proteomică
• pregătirea probelor pentru metabolomică
• studii privind distrugerea peretelui celular
• teste microbiologice de mare capacitate

O liza fiabilă a drojdiei începe cu o sonicare controlată

Liza drojdiei poate fi dificilă atunci când numărul probelor crește, însă sonicatoarele pentru microplăci Hielscher fac ca acest proces să fie mai rapid, mai curat și mai reproductibil. Modelele UIP400MTP și UIP550MTP permit cercetătorilor să proceseze plăci întregi în condiții ultrasonice definite, îmbunătățind randamentul și reducând în același timp manipularea manuală.
Pentru microbiologi, biologi moleculari, cercetători în domeniul proteinelor și laboratoarele de biotehnologie, sonicarea microplăcilor reprezintă un instrument eficient pentru eliberarea componentelor intracelulare ale drojdiei într-un mod eficient și reproductibil.

Literatură / Referințe