Sonicarea microplăcilor în proteomica shotgun – Notă de aplicație

Proteomica shotgun depinde de o pregătire eficientă și reproductibilă a probelor pentru a transforma materialul biologic complex în peptide pregătite pentru LC-MS/MS. Sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP sprijină acest proces, permițând sonicarea standardizată, în paralel, a probelor de volum mic și ajutând laboratoarele să îmbunătățească dezintegrarea, extracția și resolubilizarea în fluxurile de lucru bazate pe microplăci. Această notă de aplicație descrie modul în care UIP400MTP poate fi integrat în pregătirea probelor pentru proteomică, folosind ca exemplu testat în laborator un flux de lucru publicat pentru vezicule extracelulare din studiile PLA2G12A/Th17.

Sonicarea microplăcilor pentru o proteomică shotgun mai reproductibilă

Pentru cercetătorii din domeniul proteomicii, pregătirea reproductibilă a probelor este esențială pentru obținerea unor date LC-MS/MS de înaltă calitate. Sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP permite sonicarea standardizată, în paralel, în fluxuri de lucru bazate pe plăci și în fluxuri de lucru cu volume mici/capacitate mare de procesare a probelor.

Este deosebit de util pentru laboratoarele care lucrează cu:

• Seturi mari de probe care necesită o procesare uniformă în numeroase godeuri
• Material disponibil în cantitate limitată, la care pierderile de probă și variabilitatea trebuie reduse la minimum
• Probe bogate în lipide, cum ar fi veziculele extracelulare
• Preparate biologice complexe care necesită dezintegrare, extracție sau resolubilizare eficientă
• Proteomică shotgun comparativă, în care reproductibilitatea între condiții și replicate este esențială

Prin integrarea sonicării microplăcilor înainte de digestie, cercetătorii pot îmbunătăți gradul de pregătire a probelor pentru:

• Extracția și resolubilizarea proteinelor
• Digestia cu tripsină/Lys-C
• Achiziția Nano-LC/MS/MS
• Analiza proteomică cantitativă ulterioară

Sonicarea microplăcilor poate aduce beneficii pentru:

• Platformele centrale de proteomică
• Laboratoarele de cercetare a EV
• Laboratoarele de imunologie și biologie celulară
• Grupurile de cercetare translațională
• Echipele din domeniul științelor vieții care trec de la pregătirea individuală a probelor la fluxuri de lucru cu capacitate mai mare de procesare a probelor

Pregătirea probelor cu capacitate mare de procesare pentru analiza proteomului veziculelor extracelulare

Ce este proteomica shotgun?

Proteomica shotgun a devenit o strategie analitică centrală pentru caracterizarea probelor biologice complexe, de la lizate celulare totale și extracte tisulare până la organite purificate, vezicule extracelulare și specimene clinice disponibile în cantitate redusă. Principalul său punct forte constă în cuplarea digestiei proteinelor, a cromatografiei de lichide de înaltă rezoluție combinate cu spectrometria de masă în tandem și a inferenței computaționale de la peptide la proteine. Cu toate acestea, calitatea setului final de date proteomice este determinată cu mult înainte ca proba să ajungă în spectrometrul de masă. Dezintegrarea eficientă a probei, solubilizarea proteinelor, îndepărtarea substanțelor interferente, digestia enzimatică reproductibilă și recuperarea robustă a peptidelor sunt toate decisive pentru profunzimea acoperirii și fiabilitatea cantitativă.
Pentru cercetătorii din proteomică și laboratoarele din domeniul științelor vieții care lucrează cu probe limitate sau prețioase, pregătirea probelor este adesea punctul de strangulare.

Provocarea veziculelor extracelulare în proteomică

Veziculele extracelulare (EV), de exemplu, reprezintă o clasă de probe deosebit de dificilă. Acestea sunt particule nanometrice, delimitate de membrană, bogate în lipide, cu un randament proteic relativ scăzut și cu un potențial ridicat de transfer rezidual (carry-over) al lipidelor, sărurilor, detergenților, proteinelor serice și al altor componente ale matricei. Aceste caracteristici pot interfera cu eficiența digestiei, performanța cromatografică, stabilitatea electrospray și identificarea peptidelor. Prin urmare, un flux de lucru de pregătire pentru proteomica EV trebuie să fie suficient de puternic pentru a dezintegra structurile veziculare și a solubiliza încărcătura proteică, rămânând în același timp compatibil cu digestia enzimatică ulterioară și cu analiza LC-MS/MS.
În acest context, ultrasonicarea compatibilă cu microplăcile oferă o abordare practică pentru procesarea reproductibilă și paralelizată a probelor. Modelele de sonicatoare pentru microplăci Hielscher UIP400MTP (400 W) și UIP550MTP (550 W) sunt concepute pentru sonicarea probelor în plăci multi-godeu și în recipiente de volum mic, permițând fluxuri de lucru cu o capacitate de procesare a probelor mai mare decât sonicatoarele convenționale cu o singură sondă. Pentru laboratoarele de proteomică, acest format este atractiv deoarece poate reduce variabilitatea cauzată de manipularea manuală, poate îmbunătăți tratarea în paralel a mai multor probe și se poate integra mai natural în fluxurile de pregătire a probelor bazate pe plăci.

Flux de lucru exemplificativ

Un flux de lucru recent de proteomică a veziculelor extracelulare din biologia celulelor Th17 determinată de PLA2G12A oferă un exemplu util, testat în laborator, al modului în care sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP poate fi încorporat în pregătirea probelor pentru proteomica shotgun. În acea serie de studii, probele EV au fost procesate pentru analiza proteomului folosind tratarea cu metanol, sonicarea cu UIP400MTP, centrifugarea, uscarea, digestia cu tripsină/Lys-C și LC în nanoflux cuplată cu MS în tandem de înaltă rezoluție. Lucrarea biologică a fost raportată în 2026 de Mochizuki-Ono și colaboratorii, analiza proteomică contribuind la caracterizarea modului în care PLA2G12A modifică proteinele din încărcătura EV în contextul răspunsurilor patogene ale celulelor T.

Sonicator pentru plăci multi-godeu UIP400MTP

De ce sonicarea microplăcilor?
UIP400MTP permite sonicarea standardizată, în paralel, a probelor de volum mic. Acest lucru este util atunci când reproductibilitatea, cantitatea redusă de probă și capacitatea de procesare a mai multor probe sunt importante.


Listă de verificare pentru controlul calității

• Confirmați o cantitate inițială egală, în echivalent proteic EV, pentru toate probele.
• Folosiți scheme de procesare a probelor randomizate sau echilibrate.
• Mențineți constante volumul de metanol, timpul de sonicare, timpul de uscare și volumul de digestie.
• Monitorizați randamentul peptidic și numărul total de proteine identificate.
• Verificați rata de clivaje ratate și distribuția lungimii peptidelor.
• Inspectați forma picurilor cromatografice și reproductibilitatea timpilor de retenție.
• Includeți probe blank pentru a monitoriza transferul rezidual (carryover).
• Folosiți probe QC combinate (pooled) pentru studiile mai mari.
• Evaluați coeficientul de variație al replicatelor.
• Folosiți PCA sau metode înrudite pentru a identifica efectele de lot sau probele aberante.

Recomandări privind protocolarea

Atunci când publicați sau documentați acest flux de lucru, raportați cantitatea inițială de EV, formatul plăcii, volumul de metanol, amplitudinea și timpul de sonicare ale UIP400MTP, condițiile de centrifugare, metoda de uscare, tamponul de digestie, concentrația enzimei, timpul de digestie, condițiile de acidifiere, platforma LC-MS/MS, modul de achiziție, versiunea software, baza de date, pragul FDR, metoda de normalizare și fluxul de lucru statistic.
Toate sonicatoarele pentru microplăci Hielscher înregistrează automat parametrii importanți ai procesului, cum ar fi amplitudinea, durata sonicării și temperatura, cu marcaj de dată și oră, sub forma unui fișier CVS pe cardul SD integrat. Protocolarea datelor pentru reproductibilitate și controlul calității nu a fost niciodată mai ușoară!

Studiul în detaliu: proteomica shotgun a EV în studiul PLA2G12A

Studiul PLA2G12A oferă un exemplu concret de utilizare a UIP400MTP într-un flux de lucru de proteomică shotgun. Întrebarea biologică a fost modul în care fosfolipaza secretată PLA2G12A modifică veziculele extracelulare derivate din celulele Th17 și influențează astfel diferențierea patogenă a celulelor T. Autorii au arătat că PLA2G12A acționează asupra membranelor EV pentru a produce lizofosfolipide, inclusiv 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, și că semnalizarea ulterioară a acidului lizofosfatidic prin LPA2 contribuie la diferențierea Th17. Dincolo de semnalizarea lipidică, studiile au examinat și încărcătura EV, inclusiv conținutul de ARN și proteine, făcând din proteomica shotgun o componentă importantă a strategiei de caracterizare.
În fluxul de lucru de pregătire a EV, celulele Th17 au fost cultivate în mediu care conținea ser fetal bovin depletat de exozomi. Supernatanții de cultură au fost mai întâi centrifugați pentru a îndepărta celulele, filtrați printr-un filtru de 0,22 µm, concentrați prin ultrafiltrare/ultracentrifugare, spălați, resuspendați în PBS și cuantificați prin testul proteic BCA. Această pregătire prealabilă a EV a asigurat că o cantitate definită de material EV, exprimată în echivalent proteic, putea fi introdusă în fluxul de lucru proteomic.
Pentru analiza proteomică shotgun, autorii au folosit probe EV corespunzătoare unui echivalent de 5 µg proteină. Aceste probe au fost uscate în tuburi PCR și s-au adăugat 25 µL metanol. Probele au fost apoi sonicate timp de 3 minute folosind sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP. După sonicare, probele au fost centrifugate la 4°C timp de 20 de minute la 19.000 × g. După îndepărtarea a 20 µL de supernatant, probele au fost centrifugate până la uscare. Proteinele au fost apoi dizolvate prin sonicare în 4 µL soluție de tripsină/Lys-C de 100 ng/µL în bicarbonat de amoniu 50 mM. Digestia a fost efectuată timp de 2 ore la 37°C, cu agitare la 300 rpm. Digestatul a fost acidifiat cu 1 µL de acid trifluoroacetic 1,25% și supus analizei prin LC în nanoflux cuplată cu spectrometrie de masă în tandem de înaltă rezoluție.
Acest flux de lucru evidențiază câteva principii utile pentru proteomica EV cu cantitate redusă de probă. În primul rând, cantitatea inițială a fost normalizată în funcție de echivalentul proteic, ceea ce este important atunci când se compară EV provenite de la genotipuri sau tratamente diferite. În al doilea rând, metanolul a fost utilizat înainte de sonicare, sprijinind dezintegrarea și extracția și evitând totodată sistemele de detergenți care pot complica LC-MS/MS. În al treilea rând, etapa de sonicare a fost scurtă și standardizată, ceea ce este compatibil cu procesarea în paralel a probelor. În al patrulea rând, digestia cu tripsină/Lys-C a fost efectuată într-un volum foarte mic, reducând diluția și sprijinind recuperarea peptidelor din cantități reduse de probă. În final, trecerea directă de la digestie la acidifiere și LC-MS/MS a redus la minimum etapele de manipulare inutile.
Metoda LC-MS/MS ulterioară a utilizat separarea în fază inversă în nanoflux cuplată cu un spectrometru de masă Q-Exactive HF Orbitrap. Probele au fost reținute pe o precoloană C18, apoi separate pe o coloană analitică cu diametrul interior de 50 µm, la 200 nL/min și 40°C. Gradientul a evoluat de la un conținut scăzut de solvent organic până la 35% solvent B pe parcursul a 60 de minute, urmat de o spălare cu conținut ridicat de solvent organic și de reechilibrare. Achiziția MS a fost efectuată în modul de ioni pozitivi, folosind achiziția independentă de date cu disociere prin coliziune de energie mai înaltă. Fișierele brute DIA au fost analizate cu DIA-NN 1.8 folosind o bibliotecă spectrală prezisă in silico.