Sonicarea microplăcilor în proteomica de tip „shotgun” – Notă de aplicare

Proteomica de tip „shotgun” depinde de o pregătire eficientă și reproductibilă a probelor pentru a transforma materialul biologic complex în peptide pregătite pentru LC-MS/MS. Sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP susține acest proces, permițând sonicația standardizată și paralelă a probelor de volum mic, ajutând laboratoarele să îmbunătățească procesele de disrupție, extracție și resolubilizare în fluxurile de lucru bazate pe microplăci. Această notă de aplicație descrie modul în care UIP400MTP poate fi integrat în pregătirea probelor proteomice, utilizând ca exemplu testat în laborator un flux de lucru publicat privind veziculele extracelulare, provenit din studiile PLA2G12A/Th17.

Sonicarea microplăcilor pentru o proteomică de tip „shotgun” mai reproductibilă

Pentru cercetătorii din domeniul proteomicii, pregătirea reproductibilă a probelor este esențială pentru obținerea unor date LC-MS/MS de înaltă calitate. Sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP permite sonicația standardizată și paralelă în fluxuri de lucru bazate pe plăci și în cele cu volum redus și randament ridicat.

Este deosebit de util pentru laboratoarele care lucrează cu:

• Seturi mari de probe care necesită o prelucrare uniformă în numeroase godeuri
• Material cu cantitate limitată, în cazul căruia pierderile de probă și variabilitatea trebuie reduse la minimum
• Probele bogate în lipide, cum ar fi veziculele extracelulare
• Preparate biologice complexe care necesită o dezintegrare, o extracție sau o resolubilizare eficientă
• Proteomica comparativă de tip „shotgun”, în care reproductibilitatea între condiții și replici este esențială

Prin integrarea sonicației microplăcilor înainte de digestie, cercetătorii pot îmbunătăți pregătirea probelor pentru:

• Extracția și resolubilizarea proteinelor
• Digestie cu tripsină/Lys-C
• Achiziția datelor prin Nano-LC/MS/MS
• Analiza proteomică cantitativă în etapa ulterioară

 

Extindeți-vă procesul de pregătire a probelor pentru proteomică cu încredere!
Aflați cum sonicația microplăcilor contribuie la reducerea variabilității asociate manipulării manuale, la îmbunătățirea disrupției probelor și la pregătirea probelor biologice complexe pentru o analiză LC-MS/MS fiabilă.

Cerere de informații


Adresa de email (obligatoriu)


Produs sau domeniu de interes



Sunt de acord cu Politica de confidențialitate









Solicitați informații

Sonicarea microplăcilor poate fi utilă în următoarele cazuri:

• Unități centrale de proteomică
• Laboratoare de cercetare în domeniul vehiculelor electrice
• Laboratoare de imunologie și biologie celulară
• Grupuri de cercetare translațională
• Echipe din domeniul științelor vieții care trec de la pregătirea unei singure probe la fluxuri de lucru cu randament mai ridicat

Pregătirea probelor cu randament ridicat pentru analiza proteomului veziculelor extracelulare

Ce este proteomica de tip „shotgun”?

Proteomica de tip „shotgun” a devenit o strategie analitică esențială pentru caracterizarea probelor biologice complexe, de la lizate de celule întregi și extracte tisulare până la organite purificate, vezicule extracelulare și probe clinice cu cantitate redusă de material. Principalul său avantaj constă în combinarea digestiei proteinelor, a cromatografiei lichide de înaltă rezoluție cu spectrometrie de masă în tandem și a inferenței computationale de la peptidă la proteină. Cu toate acestea, calitatea setului final de date proteomice este determinată cu mult înainte ca proba să ajungă la spectrometrul de masă. Disrupția eficientă a probei, solubilizarea proteinelor, îndepărtarea substanțelor care interferează, digestia enzimatică reproductibilă și recuperarea robustă a peptidelor sunt toate decisive pentru profunzimea acoperirii și fiabilitatea cantitativă.
Pentru cercetătorii din domeniul proteomicii și laboratoarele din domeniul științelor vieții care lucrează cu probe limitate sau prețioase, pregătirea probelor reprezintă adesea un punct de blocaj.

Provocarea reprezentată de veziculele extracelulare în proteomică

Veziculele extracelulare (EV), de exemplu, reprezintă o categorie de probe deosebit de dificilă. Acestea sunt particule la scară nanometrică, delimitate de membrană și bogate în lipide, cu un randament proteic relativ scăzut și un potențial ridicat de contaminare cu lipide, săruri, detergenți, proteine serice și alte componente ale matricei. Aceste caracteristici pot afecta eficiența digestiei, performanța cromatografică, stabilitatea în electrospray și identificarea peptidelor. Prin urmare, un flux de lucru de preparare pentru proteomica EV trebuie să fie suficient de puternic pentru a distruge structurile veziculelor și a solubiliza încărcătura proteică, rămânând în același timp compatibil cu digestia enzimatică ulterioară și cu analiza LC-MS/MS.
În acest context, tratamentul cu ultrasunete compatibil cu microplăcile oferă o abordare practică pentru prelucrarea reproductibilă și paralelizată a probelor. Modelele de sonicatoare pentru microplăci Hielscher UIP400MTP (400 W) și UIP550MTP (550 W) sunt proiectate pentru sonicare de probe în plăci cu mai multe godeuri și recipiente de volum mic, susținând fluxuri de lucru cu randament mai ridicat decât sonicatoarele convenționale cu o singură sondă. Pentru laboratoarele de proteomică, acest format este atractiv deoarece poate reduce variabilitatea manuală, poate îmbunătăți tratarea în paralel a mai multor probe și se poate integra mai natural în fluxurile de lucru de pregătire a probelor bazate pe plăci.

Un flux de lucru exemplar

Un flux de lucru recent de proteomică a veziculelor extracelulare în biologia celulelor Th17 mediate de PLA2G12A oferă un exemplu util, testat în laborator, al modului în care sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP poate fi integrat în pregătirea probelor pentru proteomica de tip „shotgun”. În acea serie de studii, probele de EV au fost prelucrate pentru analiza proteomică folosind tratamentul cu metanol, sonicația cu UIP400MTP, centrifugarea, uscarea, digestia cu tripsină/Lys-C și LC cu nano-debit cuprinsă de spectrometrie de masă în tandem de înaltă rezoluție. Aceeași lucrare biologică a fost raportată inițial ca preprint bioRxiv și publicată ulterior în „Cell Reports”, unde analiza proteomică a contribuit la caracterizarea modului în care PLA2G12A modifică proteinele transportate de EV în contextul răspunsurilor patogene ale celulelor T.

Sonicator cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP

De ce se utilizează sonicația microplăcilor?
Aparatul UIP400MTP permite sonicarea standardizată și paralelă a probelor de volum mic. Acest lucru este util atunci când reproducibilitatea, cantitatea redusă de probă introdusă și capacitatea de procesare a mai multor probe sunt aspecte importante.

Lista de verificare pentru controlul calității

• Asigurați-vă că cantitatea de proteine echivalente cu EV introdusă este aceeași în toate probele.
• Utilizați scheme de procesare a eșantioanelor aleatorii sau echilibrate.
• Mențineți constante volumul de metanol, durata de sonicare, durata de uscare și volumul de digestie.
• Monitorizați randamentul peptidelor și identificările proteinelor totale.
• Verificați rata de clivaj ratat și distribuția lungimii peptidelor.
• Verificați forma vârfurilor cromatografice și reproductibilitatea timpului de retenție.
• Includeți spații goale pentru a monitoriza reportul.
• Utilizați probe de control al calității (QC) combinate pentru studii de amploare mai mare.
• Evaluează coeficientul de variație al replicilor.
• Utilizați PCA sau metode similare pentru a identifica efectele de lot sau probele aberante.

Recomandări privind întocmirea proceselor-verbale

Atunci când publicați sau documentați acest flux de lucru, menționați cantitatea de EV introdusă, formatul plăcii, volumul de metanol, amplitudinea și durata de sonicare a aparatului UIP400MTP, condițiile de centrifugare, metoda de uscare, tamponul de digestie, concentrația enzimei, durata digestiei, condițiile de acidificare, platforma LC-MS/MS, modul de achiziție, versiunea software-ului, baza de date, pragul FDR, metoda de normalizare și fluxul de lucru statistic.
Toate aparatele de sonicare pentru microplăci Hielscher înregistrează automat parametrii importanți ai procesului, precum amplitudinea, durata sonicării și temperatura, împreună cu data și ora, sub formă de fișier CSV pe cardul SD integrat. Înregistrarea datelor în vederea asigurării reproductibilității și a controlului calității nu a fost niciodată mai ușoară!

Analiza detaliată: Proteomica EV Shotgun în studiul PLA2G12A

Studiul privind PLA2G12A oferă un exemplu concret de utilizare a UIP400MTP într-un flux de lucru de proteomică de tip „shotgun”. Problema biologică a fost aceea de a afla cum fosfolipaza secretată PLA2G12A modifică veziculele extracelulare derivate din celulele Th17 și, prin urmare, influențează diferențierea celulelor T patogene. Autorii au demonstrat că PLA2G12A acționează asupra membranelor veziculelor extracelulare (EV) pentru a produce lizofosfolipide, inclusiv 1-oleoil-lizofosfatidiletanolamină, și că semnalizarea în aval a acidului lizofosfatidic prin intermediul LPA2 contribuie la diferențierea celulelor Th17. Dincolo de semnalizarea lipidică, studiile au examinat și încărcătura veziculelor extracelulare, inclusiv conținutul de ARN și proteine, făcând din proteomica de tip „shotgun” o componentă importantă a strategiei de caracterizare.
În cadrul procesului de preparare a EV, celulele Th17 au fost cultivate într-un mediu care conținea ser fetal bovin din care fuseseră eliminate exozomii. Supernatantele de cultură au fost mai întâi centrifugate pentru a îndepărta celulele, filtrate printr-un filtru de 0,22 µm, concentrate prin ultrafiltrare/ultracentrifugare, spălate, resuspendate în PBS și cuantificate prin testul BCA pentru proteine. Această etapă inițială de preparare a EV-urilor a asigurat că o cantitate definită, echivalentă din punct de vedere proteic, de material EV a putut fi introdusă în fluxul de lucru proteomic.
Pentru analiza proteomică de tip „shotgun”, autorii au utilizat probe de EV corespunzătoare la 5 µg echivalenți de proteină. Aceste probe au fost uscate în tuburi de PCR, după care s-au adăugat 25 µL de metanol. Probele au fost apoi supuse sonicației timp de 3 minute folosind sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP. După sonicare, probele au fost centrifugate la 4 °C timp de 20 de minute la 19.000 × g. După îndepărtarea a 20 µL de supernatant, probele au fost centrifugate până la uscare. Proteinele au fost apoi dizolvate prin sonicare în 4 µL de soluție de tripsină/Lys-C la 100 ng/µL în bicarbonat de amoniu 50 mM. Digestia s-a efectuat timp de 2 ore la 37 °C, cu agitare la 300 rpm. Produsul digestiei a fost acidificat cu 1 µL de acid trifluoroacetic 1,25% și supus unei analize prin cromatografie de lichid cu flux nano (LC) cuprinsă de spectrometrie de masă în tandem de înaltă rezoluție.
Acest flux de lucru evidențiază câteva principii utile pentru proteomica EV cu cantități mici de probă. În primul rând, proba a fost normalizată în funcție de echivalentul proteic, aspect important atunci când se compară EV-urile provenite de la genotipuri sau tratamente diferite. În al doilea rând, s-a utilizat metanol înainte de sonicare, facilitând ruperea și extracția, evitându-se totodată utilizarea sistemelor detergente care ar putea complica analiza LC-MS/MS. În al treilea rând, etapa de sonicare a fost scurtă și standardizată, ceea ce este compatibil cu procesarea paralelă a probelor. În al patrulea rând, digestia cu tripsină/Lys-C a fost efectuată într-un volum foarte mic, reducând diluția și favorizând recuperarea peptidelor cu cantități reduse de material de intrare. În cele din urmă, trecerea directă de la digestie la acidificare și LC-MS/MS a redus la minimum etapele inutile de manipulare.
Metoda LC-MS/MS utilizată în etapa ulterioară a implicat separarea în fază inversă cu nano-debit, cuplată la un spectrometru de masă Q-Exactive HF Orbitrap. Probele au fost reținute pe o precolonă C18, apoi separate pe o coloană analitică cu diametrul interior de 50 µm, la un debit de 200 nL/min și la 40 °C. Gradientul a variat de la un conținut scăzut de solvent organic la 35% solvent B pe parcursul a 60 de minute, urmat de spălare cu conținut ridicat de solvent organic și reechilibrare. Achiziția MS a fost efectuată în modul de ioni pozitivi, utilizând achiziția independentă de date cu disociere prin coliziune de energie mai mare. Fișierele brute DIA au fost analizate folosind DIA-NN 1.8 cu o bibliotecă spectrală prevăzută in silico.