Preparación de muestras de alto rendimiento para el diagnóstico mitocondrial
El diagnóstico mitocondrial en la investigación y la práctica clínica se realiza mediante diversas técnicas, como la secuenciación, la PCR y los ensayos bioquímicos. Estos métodos se utilizan para identificar mutaciones del ADN y medir la función mitocondrial. La secuenciación ayuda a detectar mutaciones genéticas, mientras que la PCR permite cuantificar secuencias específicas de ADN. Los ensayos bioquímicos evalúan la funcionalidad de las proteínas y enzimas mitocondriales.
El diagnóstico de las enfermedades mitocondriales es especialmente difícil debido a su marcada variabilidad clínica, así como a la compleja interacción entre dos genomas con distintos patrones de herencia: el ADN mitocondrial (mtDNA) y el genoma nuclear.
Extracción y fragmentación del ADN mediante sonicación
La extracción de ADN del tejido muscular es especialmente útil cuando se sospechan alteraciones del mtDNA específicas de este tejido. Estas alteraciones pueden incluir deleciones del mtDNA en la oftalmoplejía externa progresiva crónica (CPEO), mutaciones puntuales del mtDNA en las miopatías mitocondriales o depleción del mtDNA en el síndrome de Alpers. El ADN extraído del tejido muscular puede utilizarse después para diversas pruebas genéticas, como Southern blot y PCR de largo alcance para detectar deleciones, PCR en tiempo real para detectar depleción o secuenciación para detectar mutaciones puntuales.
La sonicación, que utiliza ondas ultrasónicas intensas, se emplea en diversas aplicaciones del diagnóstico mitocondrial. Se utiliza para lisar células y extraer su contenido intracelular, como mitocondrias y ADN, para fragmentar por cizallamiento el ADN, como el mtDNA y el nDNA, con fines de secuenciación, y para homogeneizar muestras.
El sonicador de placas UIP400MTP para la preparación de muestras de alto rendimiento somete uniformemente a sonicación las muestras en placas multipocillo y de 96 pocillos
Cómo aislar mitocondrias de células y tejidos
El aislamiento mitocondrial comprende dos pasos esenciales: romper las células para liberar su contenido y emplear la centrifugación diferencial para separar y recuperar las fracciones mitocondriales.
Sonicación
Los sonicadores Hielscher son compatibles con tampones y kits de lisis estándar, lo que los hace adecuados para el aislamiento de mitocondrias. La sonicación cumple dos funciones principales:
- Lisis celular: Las ondas ultrasónicas rompen las membranas celulares y liberan el contenido intracelular.
- Ruptura mitocondrial: La sonicación en un paso posterior puede romper las mitocondrias para liberar proteínas mitocondriales o ADN mitocondrial.
- Fragmentación del mtDNA: La sonicación es una técnica fiable para fragmentar por cizallamiento el ADN mitocondrial con fines de secuenciación.
El sonicador de placas multipocillo UIP400MTP permite la preparación de muestras mitocondriales de alto rendimiento. En combinación con la centrifugación diferencial, la sonicación mejora la eficiencia del aislamiento mitocondrial y garantiza un alto rendimiento de mitocondrias intactas adecuadas para diversas aplicaciones posteriores.
El sonicador de placas multipocillo Hielscher UIP400MTP funciona con cualquier placa estándar
El sonicador de placas multipocillo UIP400MTP ofrece numerosas ventajas para la preparación de muestras de alto rendimiento, por ejemplo, en el diagnóstico mitocondrial.
Sonicador de placas multipocillo UIP400MTP para la preparación de muestras de alto rendimiento en el diagnóstico mediante biomarcadores.
Ejemplo de instrucciones para la fragmentación ultrasónica del mtDNA
Preparación y extracción:
- Los ratones C57BL/6 se sacrificaron mediante dislocación cervical.
- Los hígados se extrajeron rápidamente y se lavaron en PBS estéril enfriado en hielo.
Aislamiento de mitocondrias:
- Las mitocondrias se aislaron utilizando un homogeneizador de tejidos Dounce de 2-mL y un kit de aislamiento de mitocondrias para tejidos.
- Centrifugación inicial a 700× g y 3.000× g.
- Realice dos pasos de lavado adicionales con el tampón C.
Aislamiento del ADN:
- El sedimento de la primera centrifugación a 700× g se utilizó para aislar el ADN nuclear (nDNA).
- El ADN se aisló mediante columnas de centrifugación.
- El ADN mitocondrial (mtDNA) se extrajo de mitocondrias aisladas.
- El ADN nuclear (nDNA) se extrajo de extractos nucleares crudos; ambos tipos de ADN procedían de tejido hepático de ratón.
Fragmentación del ADN:
- El ADN se fragmentó sobre hielo utilizando un sonicador ultrasónico UP50H de 30-kHz/50-W con un sonotrodo de micropunta de 0,5-mm a 14 μm durante 2 × 30 segundos.
Visualización y cuantificación de la fragmentación:
- La fragmentación tras la sonicación se visualizó en un gel de agarosa al 1% con el colorante para ADN SYBR safe.
- La abundancia relativa de mtDNA y nDNA se determinó mediante qPCR.
(cf. Mariero et al., 2019)
Para la preparación de muestras de alto rendimiento, el sonicador de placas multipocillo UIP400MTP facilita la preparación de un gran número de muestras en placas estándar de 96 pocillos, multipocillo y de microtitulación.
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Consejos para un aislamiento óptimo de mitocondrias mediante sonicación:
- Control de la temperatura: Realice todos los pasos en un intervalo de temperatura de 0 °C a 4 °C. Esto es fundamental para mantener la integridad y la funcionalidad de las mitocondrias.
- Eficiencia y rapidez: Trabaje con rapidez y purifique las mitocondrias solo hasta el grado necesario para su aplicación específica. Una manipulación excesiva puede provocar pérdidas significativas de contenido mitocondrial.
- Dilución de las suspensiones: Mantenga bajas las concentraciones de las suspensiones de células y orgánulos durante todo el proceso de aislamiento. Esto ayuda a minimizar los riesgos de atrapamiento y aglutinación, mejorando así la pureza de las mitocondrias aisladas.
- Volumen de muestra: Opte por varias preparaciones a pequeña escala en lugar de una sola de gran tamaño. Este enfoque suele proporcionar mejores rendimientos, ya que el aumento de escala no incrementa proporcionalmente la cantidad de mitocondrias recuperables. El sonicador de placas multipocillo UIP400MTP facilita la lisis celular rápida y fiable para el aislamiento de mitocondrias, así como la extracción de proteínas de las mitocondrias.
Estas pautas harán más eficiente el proceso de aislamiento mediante lisis ultrasónica y centrifugación, y permitirán obtener preparaciones mitocondriales de alta calidad adecuadas para aplicaciones posteriores.
Sonicadores Hielscher – Calidad fabricada en Alemania
Los equipos de ultrasonidos Hielscher son conocidos por sus máximos estándares de calidad y diseño. Su robustez y facilidad de uso permiten integrar nuestros equipos de ultrasonidos sin dificultades en instalaciones industriales. Los equipos de ultrasonidos Hielscher afrontan con facilidad condiciones adversas y entornos exigentes.
Hielscher Ultrasonics es una empresa con certificación ISO que presta especial atención a los equipos de ultrasonidos de alto rendimiento con tecnología de vanguardia y facilidad de uso. Por supuesto, los equipos de ultrasonidos Hielscher cumplen la normativa CE y los requisitos de UL, CSA y RoHs.
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Bibliografía / Referencias
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
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- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Preguntas frecuentes sobre las mitocondrias y el diagnóstico mitocondrial
¿Qué son las mitocondrias?
Las mitocondrias son orgánulos delimitados por membranas que se encuentran en las células de la mayoría de los organismos eucariotas. Se conocen como las centrales energéticas de la célula porque producen energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP) mediante el proceso de respiración celular. Además, las mitocondrias tienen su propio ADN y desempeñan funciones clave en otros procesos celulares, como la regulación del ciclo celular y la muerte celular.
¿Qué diferencia al mtDNA del ADN genómico?
El ADN mitocondrial (mtDNA) difiere del ADN genómico (gDNA) en varios aspectos clave. El mtDNA se encuentra en las mitocondrias, es circular y se hereda por vía materna, mientras que el gDNA se encuentra en el núcleo celular, es lineal y se hereda de ambos progenitores. El mtDNA es mucho más pequeño y codifica solo 37 genes, mientras que el gDNA contiene aproximadamente 20.000-25.000 genes. El mtDNA está presente en múltiples copias por célula, tiene una tasa de mutación más alta y codifica principalmente proteínas implicadas en la función mitocondrial. En cambio, el gDNA suele ser diploide, tiene una tasa de mutación más baja y codifica una amplia variedad de genes necesarios para el desarrollo y el funcionamiento del organismo. Además, la transcripción y la traducción del mtDNA se producen dentro de las mitocondrias, mientras que la transcripción del gDNA se produce en el núcleo y la traducción tiene lugar en el citoplasma. Estas diferencias reflejan sus distintas funciones y sus orígenes evolutivos.
¿Qué es un extracto libre de células?
Un extracto libre de células es una solución que contiene el contenido de células lisadas, incluidas proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes celulares, pero sin membranas celulares intactas. Este extracto se utiliza en la investigación bioquímica y de biología molecular para estudiar procesos celulares in vitro, lo que permite a los investigadores analizar reacciones y mecanismos fuera de las células vivas.
¿Qué función desempeñan las pruebas de PCR en el diagnóstico mitocondrial?
Las pruebas de PCR desempeñan una función fundamental en el diagnóstico mitocondrial al permitir la detección de mutaciones, deleciones o variaciones en el número de copias del ADN mitocondrial (mtDNA). Permiten amplificar regiones específicas del mtDNA para identificar variantes patogénicas asociadas a trastornos mitocondriales. Las técnicas basadas en PCR, como la PCR cuantitativa (qPCR) y la PCR de largo alcance, también se utilizan para evaluar la integridad del mtDNA, los niveles de heteroplasmia y la depleción del mtDNA, y proporcionan información esencial sobre la función mitocondrial y las enfermedades mitocondriales.
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¿Qué es la centrifugación diferencial?
La centrifugación diferencial es una técnica ampliamente utilizada para el fraccionamiento celular y el aislamiento mitocondrial. Este método separa las estructuras celulares en función de su coeficiente de sedimentación, que depende tanto de su densidad como de su forma. El proceso consiste en aplicar distintos niveles de fuerza centrífuga a muestras en soluciones salinas tamponadas con densidades específicas. Las estructuras con coeficientes de sedimentación similares se depositan en el fondo del tubo de recogida al mismo tiempo, lo que permite recuperarlas.
¿Cómo se utiliza la centrifugación diferencial para aislar mitocondrias?
La centrifugación diferencial permite a los investigadores separar eficazmente las fracciones mitocondriales de otros componentes celulares. El aislamiento de mitocondrias implica varios pasos de centrifugación y la posterior recuperación del material aislado.
Centrifugación inicial: Aplique una fuerza centrífuga baja para sedimentar los restos celulares grandes y los núcleos.
Centrifugaciones posteriores: Aumente la fuerza centrífuga de forma escalonada para sedimentar fracciones enriquecidas en mitocondrias. Cada paso de centrifugación elimina estructuras con coeficientes de sedimentación progresivamente más altos.
Recuperación de las fracciones: Después de cada centrifugación, se recoge el sedimento y el sobrenadante se somete a fuerzas g más altas para aislar la siguiente fracción. Este proceso se repite hasta alcanzar la pureza deseada de las mitocondrias.