Preparación de muestras de alto rendimiento para el diagnóstico mitocondrial
El diagnóstico mitocondrial en investigación y clínica se realiza mediante diversas técnicas, como la secuenciación, la PCR y los ensayos bioquímicos. Estos métodos se utilizan para identificar mutaciones del ADN y medir la función mitocondrial. La secuenciación ayuda a detectar mutaciones genéticas, mientras que la PCR puede cuantificar secuencias específicas de ADN. Los ensayos bioquímicos evalúan la funcionalidad de las proteínas y enzimas mitocondriales.
El diagnóstico de las enfermedades mitocondriales es especialmente difícil debido a la pronunciada variabilidad clínica de estas enfermedades, así como a la compleja interacción entre dos genomas heredados de forma diferente: el ADN mitocondrial (ADNmt) y el genoma nuclear.
Extracción y fragmentación del ADN mediante sonicación
La extracción de ADN del tejido muscular es especialmente útil cuando se sospecha la existencia de cambios específicos en el ADNmt. Estos cambios pueden incluir deleciones del ADNmt en la oftalmoplejía externa progresiva crónica (OEPC), mutaciones puntuales del ADNmt en miopatías mitocondriales o depleción del ADNmt en el síndrome de Alpers. El ADN extraído del tejido muscular puede utilizarse para diversas pruebas genéticas, como Southern blot y PCR de largo alcance para deleciones, PCR en tiempo real para depleción o secuenciación para mutaciones puntuales.
La sonicación, que utiliza ondas ultrasónicas intensas, se utiliza para varias aplicaciones en el diagnóstico mitocondrial. Se utiliza para lisar células para extraer contenidos intracelulares como mitocondrias y ADN, para cizallar ADN como ADNmt y ADNn para secuenciación, y para homogeneizar muestras.
Sonicator de placas UIP400MTP para la preparación de muestras de alto rendimiento sonicación uniforme de muestras en placas multipocillo y de 96 pocillos
Cómo aislar mitocondrias de células y tejidos
El aislamiento mitocondrial comprende dos pasos esenciales: la disrupción de las células para liberar su contenido y el empleo de la centrifugación diferencial para separar y recuperar las fracciones mitocondriales.
Sonicación
Los sonicadores Hielscher son compatibles con los tampones y kits de lisis estándar, lo que los hace adecuados para el aislamiento de mitocondrias. La sonicación tiene dos objetivos principales:
- Lisis celular: Las ondas ultrasónicas alteran las membranas celulares, liberando el contenido intracelular.
- Alteración mitocondrial: La sonicación en un paso posterior puede romper las mitocondrias para liberar proteínas mitocondriales o ADN mitocondrial.
- Fragmentación del ADNmt: La sonicación es una técnica fiable para cizallar el ADN mitocondrial para su secuenciación.
El sonicador de placas multipocillo UIP400MTP permite una preparación de muestras mitocondriales de alto rendimiento. Junto con la centrifugación diferencial, la sonicación mejora la eficiencia del aislamiento mitocondrial, garantizando altos rendimientos de mitocondrias intactas adecuadas para diversas aplicaciones posteriores.
Hielscher UIP400MTP sonicador de placas multipocillo funciona con cualquier placa estándar
El sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP ofrece numerosas ventajas para la preparación de muestras de alto rendimiento, por ejemplo en el diagnóstico mitocondrial.
UIP400MTP Sonicator de placas multipocillo para la preparación de muestras de alto rendimiento en el diagnóstico de biomarcadores.
Instrucciones ejemplares para la fragmentación ultrasónica del ADNmt
Preparación y extracción:
- Los ratones C57BL/6 fueron sacrificados por dislocación cervical.
- Los hígados se extrajeron rápidamente y se lavaron en PBS estéril helado.
Aislamiento de mitocondrias:
- Las mitocondrias se aislaron utilizando un triturador de tejidos Dounce de 2 ml y un kit de aislamiento de mitocondrias para tejidos.
- Centrifugación inicial a 700× g y 3.000× g.
- Realizar dos lavados adicionales con tampón C.
Aislamiento de ADN:
- El pellet de la primera centrifugación a 700× g se utilizó para aislar el ADN nuclear (ADNn).
- El ADN se aisló mediante columnas de centrifugación.
- El ADN mitocondrial (ADNmt) se extrajo de mitocondrias aisladas.
- El ADN nuclear (ADNn) se extrajo de extractos nucleares brutos, ambos procedentes de tejido hepático de ratón.
Fragmentación del ADN:
- El ADN se fragmentó en hielo utilizando un sonicador ultrasónico UP50H de 30 kHz/50 W con un sonotrodo de micropunta de 0,5 mm a 14 μm durante 2 × 30 segundos.
Visualización y cuantificación de la fragmentación:
- La fragmentación tras la ultrasonificación se visualizó en un gel de agarosa al 1% con colorante de ADN seguro SYBR.
- La abundancia relativa de ADNmt y ADNn se determinó mediante qPCR.
(cf. Mariero et al., 2019)
Para la preparación de muestras de alto rendimiento, el sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP facilita la preparación de grandes cantidades de muestras en placas estándar de 96 pocillos, de pocillos múltiples y de microtitulación.
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Consejos para el aislamiento óptimo de mitocondrias mediante sonicación:
- Control de temperatura: Realice todos los pasos a una temperatura comprendida entre 0 °C y 4 °C. Esto es fundamental para mantener la integridad y funcionalidad de las mitocondrias.
- Eficacia y rapidez: Trabaje con rapidez y purifique las mitocondrias sólo en la medida necesaria para su aplicación específica. Una manipulación excesiva puede provocar pérdidas significativas del contenido mitocondrial.
- Dilución de suspensiones: Mantener bajas concentraciones de suspensiones de células y orgánulos durante todo el proceso de aislamiento. Esto ayuda a minimizar los riesgos de atrapamiento y aglutinación, mejorando así la pureza de las mitocondrias aisladas.
- Volumen de la muestra: Opte por múltiples preparaciones a pequeña escala en lugar de una sola a gran escala. Este enfoque suele dar lugar a mejores rendimientos, ya que la ampliación no aumenta proporcionalmente la cantidad de mitocondrias recuperables. El sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP facilita la lisis rápida y fiable de células para el aislamiento de mitocondrias, así como la extracción de proteínas de las mitocondrias.
Gracias a estas directrices, el proceso de aislamiento mediante lisis ultrasónica y centrifugación será más eficaz y se obtendrán preparaciones mitocondriales de alta calidad aptas para aplicaciones posteriores.
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Los ultrasonidos de Hielscher son conocidos por sus elevados estándares de calidad y diseño. Su robustez y fácil manejo permiten una integración sin problemas de nuestros ultrasonidos en las instalaciones industriales. Los ultrasonidos de Hielscher soportan sin problemas las condiciones más duras y los entornos más exigentes.
Hielscher Ultrasonics es una empresa con certificación ISO y pone especial énfasis en los ultrasonidos de alto rendimiento con tecnología punta y facilidad de uso. Por supuesto, los ultrasonidos de Hielscher cumplen la normativa CE y los requisitos de UL, CSA y RoHs.
Sonicador de placas de 96 pocillos UIP400MTP para sonicación de placas microtiter y multipocillo
Literatura / Referencias
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Preguntas frecuentes sobre mitocondrias y diagnóstico mitocondrial
¿Qué son las mitocondrias?
Las mitocondrias son orgánulos con membrana que se encuentran en las células de la mayoría de los organismos eucariotas. Se las conoce como las centrales eléctricas de la célula porque producen energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP) a través del proceso de respiración celular. Además, las mitocondrias tienen su propio ADN y desempeñan funciones clave en otros procesos celulares, como la regulación del ciclo celular y la muerte celular.
¿Qué diferencia el ADNmt del ADN genómico?
El ADN mitocondrial (ADNmt) difiere del ADN genómico (ADNg) en varios aspectos fundamentales. El ADNmt se localiza en las mitocondrias, es circular y se hereda por vía materna, mientras que el ADNg se localiza en el núcleo celular, es lineal y se hereda de ambos progenitores. El ADNmt es mucho más pequeño, ya que sólo codifica 37 genes, mientras que el ADNg contiene entre 20.000 y 25.000 genes. El ADNmt está presente en múltiples copias por célula, tiene una mayor tasa de mutación y codifica principalmente proteínas implicadas en la función mitocondrial. En cambio, el ADNg es típicamente diploide, tiene una tasa de mutación más baja y codifica una amplia gama de genes necesarios para el desarrollo y la función del organismo. Además, la transcripción y traducción del ADNmt se produce en las mitocondrias, mientras que la del ADNg tiene lugar en el núcleo y la traducción en el citoplasma. Estas diferencias reflejan sus distintas funciones y orígenes evolutivos.
¿Qué es el extracto sin células?
Un extracto libre de células es una solución que contiene el contenido de células lisadas, incluidas proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes celulares, pero sin membranas celulares intactas. Este extracto se utiliza en la investigación bioquímica y de biología molecular para estudiar procesos celulares in vitro, lo que permite a los investigadores analizar reacciones y mecanismos fuera de las células vivas.
¿Qué papel desempeñan las pruebas PCR en el diagnóstico mitocondrial?
Las pruebas PCR desempeñan un papel fundamental en el diagnóstico mitocondrial al permitir la detección de mutaciones, deleciones o variaciones del número de copias en el ADN mitocondrial (ADNmt). Permiten amplificar regiones específicas del ADNmt para identificar variantes patogénicas asociadas a trastornos mitocondriales. Las técnicas basadas en la PCR, como la PCR cuantitativa (qPCR) y la PCR de largo alcance, también se utilizan para evaluar la integridad del ADNmt, los niveles de heteroplasmia y la depleción del ADNmt, proporcionando conocimientos esenciales sobre la función mitocondrial y las enfermedades.
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¿Qué es la centrifugación diferencial?
La centrifugación diferencial es una técnica ampliamente utilizada para el fraccionamiento celular y el aislamiento mitocondrial. Este método separa las estructuras celulares en función de su coeficiente de sedimentación, que depende tanto de la densidad como de la forma. El proceso consiste en aplicar distintos niveles de fuerza centrífuga a las muestras en soluciones salinas tamponadas con densidades específicas. Las estructuras con coeficientes de sedimentación similares se depositan al mismo tiempo en el fondo del tubo de recogida, lo que permite su recuperación.
¿Cómo se utiliza la centrifugación diferencial para el aislamiento de mitocondrias?
La centrifugación diferencial permite a los investigadores separar eficazmente las fracciones mitocondriales de otros componentes celulares. El aislamiento de mitocondrias implica varios pasos de centrifugación y la posterior recuperación del aislado.
Centrifugación inicial: Aplique una fuerza centrífuga baja para sedimentar los restos celulares grandes y los núcleos.
Centrifugaciones posteriores: Aumentar la fuerza centrífuga paso a paso para granular fracciones enriquecidas con mitocondrias. Cada paso de centrifugación elimina estructuras con coeficientes de sedimentación progresivamente más altos.
Recuperación de fracciones: Después de cada centrifugación, se recoge el pellet y el sobrenadante se somete a fuerzas g mayores para aislar la siguiente fracción. Esto se repite hasta alcanzar la pureza deseada de mitocondrias.