Priprema uzoraka visoke propusnosti za mitohondrijsku dijagnostiku
Mitohondrijska dijagnostika u istraživanju i klinikama provodi se različitim tehnikama, kao što su sekvenciranje, PCR i biohemijski testovi. Ove metode služe za identifikaciju mutacija DNA i mjerenje mitohondrijske funkcije. Sekvenciranje pomaže u otkrivanju genetskih mutacija, dok PCR može kvantificirati specifične sekvence DNA. Biohemijski testovi procjenjuju funkcionalnost mitohondrijskih proteina i enzima.
Dijagnostika mitohondrijskih bolesti posebno je teška zbog izražene kliničke varijabilnosti ovih bolesti, kao i zbog složene interakcije između dva različito naslijeđena genoma: mitohondrijske DNA (mtDNA) i nuklearnog genoma.
Ekstrakcija i fragmentacija DNA pomoću sonikacije
Ekstrakcija DNA iz mišićnog tkiva posebno je korisna kada se sumnja na tkivno specifične promjene mtDNA. Te promjene mogu uključivati delecije mtDNA kod kronične progresivne vanjske oftalmoplegije (CPEO), tačkaste mutacije mtDNA kod mitohondrijskih miopatija ili deplecije mtDNA kod Alpersovog sindroma. DNA ekstrahirana iz mišićnog tkiva zatim se može koristiti za različite genetske testove, kao što su Southern blot i long-range PCR za delecije, PCR u stvarnom vremenu za deplecije ili sekvenciranje za tačkaste mutacije.
Ultrazvučna obrada (sonikacija) intenzivnim ultrazvučnim valovima primjenjuje se u nekoliko primjena u mitohondrijskoj dijagnostici. Koristi se za lizu ćelija radi ekstrakcije intracelularnog sadržaja, kao što su mitohondriji i DNA, za smicanje DNA, poput mtDNA i nDNA, za sekvenciranje te za homogenizaciju uzoraka.
Sonikator za ploče UIP400MTP za pripremu uzoraka visoke propusnosti ravnomjerno ultrazvučno obrađuje uzorke u pločama s više jažica i pločama s 96 jažica
Kako izolirati mitohondrije iz ćelija i tkiva
Izolacija mitohondrija obuhvata dva osnovna koraka: razgradnju ćelija radi oslobađanja njihovog sadržaja i primjenu diferencijalnog centrifugiranja za odvajanje i izdvajanje mitohondrijskih frakcija.
Sonikacija
Hielscher sonikatori kompatibilni su sa standardnim puferima za lizu i kompletima, zbog čega su pogodni za izolaciju mitohondrija. Sonikacija ima dvije glavne svrhe:
- Liza ćelija: Ultrazvučni valovi razaraju ćelijske membrane i oslobađaju intracelularni sadržaj.
- Razgradnja mitohondrija: Sonikacija u narednom koraku može razbiti mitohondrije radi oslobađanja mitohondrijskih proteina ili mitohondrijske DNA.
- Fragmentacija mtDNA: Sonikacija je pouzdana tehnika za smicanje mitohondrijske DNA za sekvenciranje.
Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP omogućava pripremu mitohondrijskih uzoraka visoke propusnosti. U kombinaciji s diferencijalnim centrifugiranjem, sonikacija povećava efikasnost izolacije mitohondrija i osigurava visoke prinose intaktnih mitohondrija pogodnih za različite naknadne primjene.
Hielscher UIP400MTP sonikator za ploče s više jažica radi sa svakom standardnom pločom
Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP nudi brojne prednosti za pripremu uzoraka visoke propusnosti, npr. u mitohondrijskoj dijagnostici.
UIP400MTP sonikator za ploče s više jažica za pripremu uzoraka visoke propusnosti u dijagnostici biomarkera.
Primjer uputa za ultrazvučnu fragmentaciju mtDNA
Priprema i ekstrakcija:
- Miševi C57BL/6 usmrćeni su cervikalnom dislokacijom.
- Jetre su brzo izvađene i isprane u ledeno hladnom sterilnom PBS-u.
Izolacija mitohondrija:
- Mitohondriji su izolirani pomoću Dounceovog homogenizatora za tkivo od 2 mL i kompleta za izolaciju mitohondrija iz tkiva (Mitochondria Isolation Kit for Tissue).
- Početno centrifugiranje pri 700× g i 3.000× g.
- Provedite dva dodatna koraka pranja puferom C.
Izolacija DNA:
- Talog iz prvog centrifugiranja pri 700× g korišten je za izolaciju nuklearne DNA (nDNA).
- DNA je izolirana pomoću spin-kolona.
- Mitohondrijska DNA (mtDNA) ekstrahirana je iz izoliranih mitohondrija.
- Nuklearna DNA (nDNA) ekstrahirana je iz sirovih nuklearnih ekstrakata, oboje iz jetrenog tkiva miša.
Fragmentacija DNA:
- DNA je fragmentirana na ledu pomoću ultrazvučnog sonikatora UP50H od 30 kHz/50 W sa sonotrodom s mikrovrhom od 0,5 mm pri 14 μm tokom 2 × 30 sekundi.
Vizualizacija i kvantifikacija fragmentacije:
- Fragmentacija nakon ultrazvučne obrade vizualizirana je na 1% agaroznom gelu uz SYBR Safe DNA boju.
- Relativna zastupljenost mtDNA i nDNA određena je pomoću qPCR-a.
(cf. Mariero et al., 2019)
Za pripremu uzoraka visoke propusnosti sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP omogućava pripremu velikog broja uzoraka u standardnim pločama s 96 jažica, pločama s više jažica i mikrotitarskim pločama.
Saznajte više o prednostima pripreme uzoraka visoke propusnosti pomoću UIP400MTP!
Savjeti za optimalnu izolaciju mitohondrija pomoću sonikacije:
- Kontrola temperature: Sve korake provodite u temperaturnom rasponu od 0°C do 4°C. To je ključno za očuvanje integriteta i funkcionalnosti mitohondrija.
- Efikasnost i brzina: Radite brzo i prečistite mitohondrije samo u mjeri potrebnoj za vašu specifičnu primjenu. Prekomjerno manipuliranje može dovesti do značajnih gubitaka mitohondrijskog sadržaja.
- Razrjeđivanje suspenzija: Tokom cijelog procesa izolacije održavajte niske koncentracije suspenzija ćelija i organela. To pomaže da se smanje rizici od zarobljavanja i aglutinacije, čime se poboljšava čistoća izoliranih mitohondrija.
- Volumen uzorka: Radije pripremite više manjih uzoraka nego jedan veliki. Ovaj pristup obično daje bolje prinose, jer povećanje razmjera ne povećava proporcionalno količinu mitohondrija koji se mogu izdvojiti. Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP olakšava brzu i pouzdanu lizu ćelija za izolaciju mitohondrija, kao i ekstrakciju proteina iz mitohondrija.
Ove smjernice učinit će proces izolacije ultrazvučnom lizom i centrifugiranjem efikasnijim i dati visokokvalitetne mitohondrijske preparate pogodne za naknadne primjene.
Hielscher sonikatori – kvalitet proizveden u Njemačkoj
Hielscher ultrazvučni uređaji poznati su po svom najvišem kvalitetu i standardima dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Hielscher ultrazvučni uređaji lako podnose teške uslove i zahtjevna okruženja.
Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana kompanija koja posebnu pažnju posvećuje visokoučinkovitim ultrazvučnim uređajima s najsavremenijom tehnologijom i jednostavnošću korištenja. Naravno, Hielscher ultrazvučni uređaji u skladu su s CE oznakom i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.
Sonikator za ploče s 96 jažica UIP400MTP za ultrazvučnu obradu mikrotitarskih ploča i ploča s više jažica
Literatura / reference
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Često postavljana pitanja o mitohondrijima i mitohondrijskoj dijagnostici
Šta su mitohondriji?
Mitohondriji su organele okružene membranom koje se nalaze u ćelijama većine eukariotskih organizama. Poznati su kao energane ćelije jer proizvode energiju u obliku adenozin trifosfata (ATP) procesom ćelijskog disanja. Osim toga, mitohondriji imaju vlastitu DNA i imaju ključne uloge u drugim ćelijskim procesima, uključujući regulaciju ćelijskog ciklusa i ćelijsku smrt.
Po čemu se mtDNA razlikuje od genomske DNA?
Mitohondrijska DNA (mtDNA) razlikuje se od genomske DNA (gDNA) u nekoliko ključnih aspekata. MtDNA se nalazi u mitohondrijima, kružna je i nasljeđuje se po majci, dok se gDNA nalazi u jezgri ćelije, linearna je i nasljeđuje se od oba roditelja. MtDNA je znatno manja i kodira samo 37 gena, dok gDNA sadrži oko 20.000–25.000 gena. MtDNA je prisutna u više kopija po ćeliji, ima višu stopu mutacija i prvenstveno kodira proteine uključene u mitohondrijsku funkciju. Nasuprot tome, gDNA je obično diploidna, ima nižu stopu mutacija i kodira široki spektar gena neophodnih za razvoj i funkciju organizma. Osim toga, transkripcija i translacija mtDNA odvijaju se unutar mitohondrija, dok se transkripcija gDNA odvija u jezgri, a translacija u citoplazmi. Ove razlike odražavaju njihove različite uloge i evolucijsko porijeklo.
Šta je bezćelijski ekstrakt?
Bezćelijski ekstrakt je otopina koja sadrži sadržaj liziranih ćelija, uključujući proteine, nukleinske kiseline i druge ćelijske komponente, ali bez intaktnih ćelijskih membrana. Ovaj ekstrakt koristi se u biohemijskim i molekularnobiološkim istraživanjima za proučavanje ćelijskih procesa in vitro, što istraživačima omogućava analizu reakcija i mehanizama izvan živih ćelija.
Kakvu ulogu imaju PCR testovi u mitohondrijskoj dijagnostici?
PCR testovi imaju ključnu ulogu u mitohondrijskoj dijagnostici jer omogućavaju otkrivanje mutacija, delecija ili varijacija broja kopija u mitohondrijskoj DNA (mtDNA). Omogućavaju amplifikaciju specifičnih regija mtDNA radi identifikacije patogenih varijanti povezanih s mitohondrijskim poremećajima. Tehnike zasnovane na PCR-u, kao što su kvantitativni PCR (qPCR) i long-range PCR, koriste se i za procjenu integriteta mtDNA, nivoa heteroplazmije i deplecije mtDNA, pružajući ključne uvide u mitohondrijsku funkciju i bolest.
Saznajte kako sonikator za mikroploče UIP400MTP olakšava PCR testove i analize!
Šta je diferencijalno centrifugiranje?
Diferencijalno centrifugiranje široko je korištena tehnika za frakcioniranje ćelija i izolaciju mitohondrija. Ova metoda razdvaja ćelijske strukture na osnovu njihovog koeficijenta sedimentacije, koji zavisi i od gustoće i od oblika. Proces uključuje primjenu različitih nivoa centrifugalne sile na uzorke u puferiranim slanim otopinama specifičnih gustoća. Strukture sličnih koeficijenata sedimentacije taložit će se na dnu epruvete za prikupljanje istovremeno, što omogućava njihovo izdvajanje.
Kako se diferencijalno centrifugiranje koristi za izolaciju mitohondrija?
Diferencijalno centrifugiranje omogućava istraživačima da efikasno odvoje mitohondrijske frakcije od ostalih ćelijskih komponenata. Izolacija mitohondrija uključuje nekoliko koraka centrifugiranja i naknadno izdvajanje izolata.
Početno centrifugiranje: Primijenite malu centrifugalnu silu za sedimentaciju velikih ćelijskih ostataka i jezgara.
Naknadna centrifugiranja: Postepeno povećavajte centrifugalnu silu kako biste istaložili frakcije obogaćene mitohondrijima. Svaki korak centrifugiranja uklanja strukture s progresivno višim koeficijentima sedimentacije.
Izdvajanje frakcije: Nakon svakog centrifugiranja talog se prikuplja, a supernatant se izlaže višim g-silama radi izolacije sljedeće frakcije. To se ponavlja dok se ne postigne željena čistoća mitohondrija.