Visoko propusna priprema uzoraka za mitohondrijalnu dijagnostiku
Dijagnostika mitohondrija u istraživanjima i klinikama se izvodi pomoću različitih tehnika kao što su sekvenciranje, PCR i biohemijski testovi. Ove metode se koriste za identifikaciju DNK mutacija i mjerenje mitohondrijalne funkcije. Sekvenciranje pomaže u otkrivanju genetskih mutacija, dok PCR može kvantificirati specifične sekvence DNK. Biohemijski testovi procjenjuju funkcionalnost mitohondrijalnih proteina i enzima.
Dijagnostika mitohondrijalnih bolesti je posebno teška zbog izražene kliničke varijabilnosti ovih bolesti, kao i zbog složene interakcije između dva različito naslijeđena genoma: mitohondrijalne DNK (mtDNA) i nuklearnog genoma.
Ekstrakcija i fragmentacija DNK pomoću ultrazvuka
Ekstrakcija DNK iz mišićnog tkiva je posebno korisna kada se sumnja na tkivno specifične promjene u mtDNK. Ove promjene mogu uključivati delecije mtDNK kod kronične progresivne vanjske oftalmoplegije (CPEO), tačkaste mutacije mtDNK kod mitohondrijalnih miopatija ili iscrpljivanje mtDNK kod Alpersovog sindroma. DNK ekstrahirana iz mišićnog tkiva može se zatim koristiti za različite genetske testove, kao što su Southern blot i PCR dugog dometa za delecije, PCR u realnom vremenu za iscrpljivanje ili sekvenciranje za tačkaste mutacije.
Sonikacija, korištenjem intenzivnih ultrazvučnih valova, primjenjuje se za nekoliko primjena u mitohondrijalnoj dijagnostici. Koristi se za lizu ćelija za ekstrakciju intracelularnog sadržaja kao što su mitohondrije i DNK, za smicanje DNK kao što su mtDNA i nDNK za sekvenciranje i za homogenizaciju uzoraka.
UIP400MTP sonikator ploča za pripremu uzoraka visokog protoka ujednačeno obrađuje uzorke ultrazvukom u pločama sa više i 96 jažica
Kako izolovati mitohondrije od ćelija i tkiva
Izolacija mitohondrija sastoji se od dva bitna koraka: razbijanje ćelija kako bi se oslobodio njihov sadržaj i korištenje diferencijalnog centrifugiranja za odvajanje i oporavak mitohondrijalnih frakcija.
sonication
Hielscher sonikatori su kompatibilni sa standardnim puferima i kompletima za lizu, što ih čini pogodnim za izolaciju mitohondrija. Sonikacija ima dvije glavne svrhe:
- ćelijska liza: Ultrazvučni talasi ometaju ćelijske membrane, oslobađajući intracelularni sadržaj.
- Mitohondrijski poremećaj: Sonikacija u sljedećem koraku može razbiti mitohondrije kako bi se oslobodili mitohondrijalni proteini ili mitohondrijski DNK.
- mtDNK fragmentacija: Sonikacija je pouzdana tehnika za smicanje mitohondrijske DNK za sekvenciranje.
Sonikator ploča sa više jažica UIP400MTP omogućava pripremu uzoraka mitohondrijalnih uzoraka visokog protoka. U kombinaciji s diferencijalnim centrifugiranjem, ultrazvuk poboljšava efikasnost izolacije mitohondrija, osiguravajući visoke prinose netaknutih mitohondrija pogodnih za različite nizvodne primjene.
Hielscher UIP400MTP sonikator ploča sa više jažica radi sa bilo kojom standardnom pločom
Sonikator ploča sa više jažica UIP400MTP nudi brojne prednosti za pripremu uzoraka visokog protoka, npr. u mitohondrijalnoj dijagnostici.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator za visokopropusnu pripremu uzoraka u dijagnostici biomarkera.
Primeri uputstava za ultrazvučnu fragmentaciju mtDNK
Priprema i ekstrakcija:
- C57BL/6 miševi su ubijeni dislokacijom grlića materice.
- Jetra su brzo izvađena i isprana u ledeno hladnom sterilnom PBS-u.
Izolacija mitohondrija:
- Mitohondrije su izolovane korišćenjem Dounce mlevenja tkiva od 2 mL i kompleta za izolaciju mitohondrija za tkivo.
- Početno centrifugiranje na 700× g i 3.000× g.
- Izvršite dva dodatna koraka pranja sa puferom C.
Izolacija DNK:
- Pelet iz prvog centrifugiranja na 700× g korišten je za izolaciju nuklearne DNK (nDNA).
- DNK je izolirana pomoću spin kolona.
- Mitohondrijska DNK (mtDNA) je ekstrahirana iz izolovanih mitohondrija.
- Nuklearna DNK (nDNA) ekstrahirana je iz sirovih nuklearnih ekstrakata, oba iz tkiva jetre miša.
fragmentacija DNK:
- DNK je fragmentirana na ledu pomoću ultrazvučnog sonikatora UP50H od 30 kHz/50 W sa sonotrodom od 0,5 mm sa mikro vrhom na 14 μm u trajanju od 2 × 30 sekundi.
Vizualizacija i kvantifikacija fragmentacije:
- Fragmentacija nakon ultrasonifikacije vizualizirana je na 1% agaroznom gelu sa SYBR sigurnom DNK bojom.
- Relativna zastupljenost mtDNK i nDNK određena je qPCR.
(usp. Mariero et al., 2019.)
Za pripremu uzoraka visokog protoka, sonikator ploča sa više jažica UIP400MTP olakšava pripremu velikog broja uzoraka u standardnim pločama sa 96 jažica, više jažica i mikrotitarskim pločama.
Pročitajte više o prednostima visokopropusne pripreme uzoraka pomoću UIP400MTP!
Savjeti za optimalnu izolaciju mitohondrija pomoću ultrazvuka:
- Kontrola temperature: Provedite sve korake na temperaturnom rasponu od 0°C do 4°C. Ovo je ključno za održavanje integriteta i funkcionalnosti mitohondrija.
- Efikasnost i brzina: Radite brzo i pročistite mitohondrije samo u mjeri koja je potrebna za vašu specifičnu primjenu. Pretjerana manipulacija može dovesti do značajnih gubitaka mitohondrijalnog sadržaja.
- Razrjeđivanje suspenzija: Održavajte niske koncentracije suspenzija stanica i organela tijekom cijelog procesa izolacije. Ovo pomaže da se minimiziraju rizici od hvatanja i aglutinacije, čime se poboljšava čistoća izolovanih mitohondrija.
- Volumen uzorka: Odlučite se za više priprema manjih razmjera radije nego za jednu veliku. Ovaj pristup obično rezultira boljim prinosima, jer povećanje ne proporcionalno povećava količinu povratnih mitohondrija. Sonikator ploča sa više jažica UIP400MTP olakšava brzu i pouzdanu lizu ćelije za izolaciju mitohondrija, kao i ekstrakciju proteina iz mitohondrija.
Ove smjernice će učiniti proces izolacije pomoću ultrazvučne lize i centrifugiranja efikasnijim, dajući visokokvalitetne mitohondrijalne preparate pogodne za daljnje primjene.
Hielscher sonicators – Kvaliteta Made in Germany
Hielscher ultrasonicatori su poznati po najvišoj kvaliteti i standardima dizajna. Robusnost i jednostavan rad omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih aparata u industrijske objekte. Hielscher ultrasonikatori lako se nose sa teškim uslovima i zahtevnim okruženjima.
Hielscher Ultrasonics je ISO sertifikovana kompanija i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne aparate visokih performansi koji se odlikuju najsavremenijom tehnologijom i lakoćom korišćenja. Naravno, Hielscher ultrasonikatori su usklađeni sa CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoH.
Sonikator ploča sa 96 jažica UIP400MTP za sonikaciju mikrotitarskih i ploča sa više jažica
Literatura / Reference
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Često postavljana pitanja o mitohondrijama i mitohondrijalnoj dijagnostici
Šta su mitohondrije?
Mitohondrije su organele vezane za membranu koje se nalaze u ćelijama većine eukariotskih organizama. Poznati su kao elektrane ćelije jer proizvode energiju u obliku adenozin trifosfata (ATP) kroz proces ćelijskog disanja. Osim toga, mitohondrije imaju vlastitu DNK i igraju ključnu ulogu u drugim ćelijskim procesima, uključujući regulaciju ćelijskog ciklusa i ćelijske smrti.
Šta razlikuje mtDNK od genomske DNK?
Mitohondrijska DNK (mtDNA) se razlikuje od genomske DNK (gDNK) na nekoliko ključnih načina. MtDNK se nalazi u mitohondrijima, kružna je i naslijeđena je po majci, dok se gDNK nalazi u ćelijskom jezgru, linearna je i naslijeđena je od oba roditelja. MtDNK je mnogo manja i kodira samo 37 gena, dok gDNK sadrži oko 20.000-25.000 gena. MtDNA je prisutna u više kopija po ćeliji, ima veću stopu mutacija i prvenstveno kodira proteine uključene u funkciju mitohondrija. Nasuprot tome, gDNK je tipično diploidna, ima nižu stopu mutacija i kodira široku lepezu gena neophodnih za razvoj i funkciju organizma. Dodatno, transkripcija i translacija mtDNK se dešavaju unutar mitohondrija, dok se transkripcija gDNK dešava u jezgru, a translacija se dešava u citoplazmi. Ove razlike odražavaju njihove različite uloge i evolucijsko porijeklo.
Šta je ekstrakt bez ćelija?
Ekstrakt bez ćelija je rastvor koji sadrži sadržaj liziranih ćelija, uključujući proteine, nukleinske kiseline i druge ćelijske komponente, ali bez netaknutih ćelijskih membrana. Ovaj ekstrakt se koristi u biohemijskim i molekularnim biološkim istraživanjima za proučavanje ćelijskih procesa in vitro, omogućavajući istraživačima da analiziraju reakcije i mehanizme izvan živih ćelija.
Koju ulogu igraju PCR testovi u mitohondrijalnoj dijagnostici?
PCR testovi igraju ključnu ulogu u mitohondrijalnoj dijagnostici omogućavajući otkrivanje mutacija, delecija ili varijacija broja kopija u mitohondrijskoj DNK (mtDNA). Oni omogućavaju amplifikaciju specifičnih mtDNA regiona da bi se identifikovale patogene varijante povezane sa mitohondrijskim poremećajima. Tehnike zasnovane na PCR-u, kao što su kvantitativni PCR (qPCR) i PCR dugog dometa, također se koriste za procjenu integriteta mtDNK, nivoa heteroplazme i iscrpljivanja mtDNK, dajući suštinski uvid u mitohondrijalnu funkciju i bolest.
Saznajte kako UIP400MTP Microplate Sonicator olakšava PCR testove i analize!
Šta je diferencijalno centrifugiranje?
Diferencijalno centrifugiranje je široko korištena tehnika za frakcioniranje stanica i izolaciju mitohondrija. Ova metoda razdvaja ćelijske strukture na osnovu njihovog koeficijenta sedimentacije, koji zavisi i od gustine i od oblika. Proces uključuje primjenu različitih nivoa centrifugalne sile na uzorke u puferiranim otopinama soli određene gustine. Strukture sa sličnim koeficijentima sedimentacije će se istovremeno taložiti na dnu sabirne cijevi, omogućavajući njihov oporavak.
Kako se diferencijalna centrifugacija koristi za izolaciju mitohondrija?
Diferencijalno centrifugiranje omogućava istraživačima da efikasno odvoje mitohondrijalne frakcije od ostalih ćelijskih komponenti. Izolacija mitohondrija uključuje nekoliko koraka centrifugiranja i naknadni oporavak izolata.
Početno centrifugiranje: Primijenite nisku centrifugalnu silu na taloženje velikih staničnih ostataka i jezgara.
Naknadna centrifugiranja: Postepeno povećavajte centrifugalnu silu do frakcija peleta obogaćenih mitohondrijama. Svaki korak centrifugiranja uklanja strukture sa progresivno višim koeficijentima sedimentacije.
Oporavak frakcije: Nakon svakog centrifugiranja, talog se sakuplja, a supernatant se podvrgava većim g-silama kako bi se izolirala sljedeća frakcija. Ovo se ponavlja sve dok se ne postigne željena čistoća mitohondrija.