Подготовка на проби с висок капацитет за митохондриална диагностика
Митохондриалната диагностика в научните изследвания и клиничната практика се извършва с помощта на различни техники като секвениране, PCR и биохимични анализи. Тези методи се използват за идентифициране на мутации в ДНК и измерване на митохондриалната функция. Секвенирането помага за откриването на генетични мутации, докато PCR може да определи количеството на специфични ДНК последователности. Биохимичните анализи оценяват функционалността на митохондриалните белтъци и ензими.
Диагностиката на митохондриалните заболявания е особено трудна поради изразената клинична вариабилност на тези заболявания, както и поради сложното взаимодействие между два генома с различен начин на унаследяване: митохондриалната ДНК (mtDNA) и ядрения геном.
Екстракция и фрагментиране на ДНК чрез ултразвукова обработка
Екстракцията на ДНК от мускулна тъкан е особено полезна, когато се подозират тъканно специфични промени в mtDNA. Тези промени могат да включват делеции на mtDNA при хронична прогресираща външна офталмоплегия (CPEO), точкови мутации на mtDNA при митохондриални миопатии или изчерпване на mtDNA при синдрома на Алперс. След това ДНК, извлечена от мускулната тъкан, може да се използва за различни генетични изследвания, като Southern blot и PCR за дълги фрагменти за откриване на делеции, PCR в реално време за установяване на изчерпване или секвениране за откриване на точкови мутации.
Ултразвуковата обработка, при която се използват интензивни ултразвукови вълни, има няколко приложения в митохондриалната диагностика. Тя се използва за лизиране на клетки с цел извличане на вътреклетъчното съдържимо, като митохондрии и ДНК, за фрагментиране чрез срязване на ДНК, като mtDNA и nDNA, за секвениране и за хомогенизиране на проби.
Ултразвуковият апарат UIP400MTP за плаки за подготовка на проби с висок капацитет обработва равномерно с ултразвук проби в многоямкови и 96-ямкови плаки
Как да изолирате митохондрии от клетки и тъкани
Изолирането на митохондрии включва две основни стъпки: разрушаване на клетките за освобождаване на съдържимото им и използване на диференциално центрофугиране за отделяне и получаване на митохондриални фракции.
Ултразвукова обработка
Ултразвуковите апарати на Hielscher са съвместими със стандартни буфери и комплекти за лизис, което ги прави подходящи за изолиране на митохондрии. Ултразвуковата обработка служи за две основни цели:
- Клетъчен лизис: Ултразвуковите вълни разрушават клетъчните мембрани, като освобождават вътреклетъчното съдържимо.
- Разрушаване на митохондриите: Ултразвуковата обработка на последващ етап може да разруши митохондриите, за да освободи митохондриални белтъци или митохондриална ДНК.
- Фрагментиране на mtDNA: Ултразвуковата обработка е надеждна техника за фрагментиране чрез срязване на митохондриална ДНК за секвениране.
Ултразвуковият апарат UIP400MTP за многоямкови плаки позволява подготовка на митохондриални проби с висок капацитет. В съчетание с диференциално центрофугиране ултразвуковата обработка повишава ефективността на изолирането на митохондрии, като осигурява висок добив на неповредени митохондрии, подходящи за различни последващи приложения.
Ултразвуковият апарат Hielscher UIP400MTP за многоямкови плаки работи с всяка стандартна плака
Ултразвуковият апарат UIP400MTP за многоямкови плаки предлага множество предимства за подготовка на проби с висок капацитет, например в митохондриалната диагностика.
Ултразвуков апарат UIP400MTP за многоямкови плаки за подготовка на проби с висок капацитет при диагностика чрез биомаркери.
Примерни инструкции за ултразвуково фрагментиране на mtDNA
Подготовка и екстракция:
- Мишки C57BL/6 бяха умъртвени чрез цервикална дислокация.
- Черните дробове бяха бързо извадени и промити с ледено студен стерилен PBS.
Изолиране на митохондрии:
- Митохондриите бяха изолирани с помощта на 2-mL тъканен хомогенизатор Dounce и комплект за изолиране на митохондрии от тъкан.
- Първоначално центрофугиране при 700× g и 3 000× g.
- Извършете две допълнителни стъпки на промиване с буфер C.
Изолиране на ДНК:
- Утайката от първото центрофугиране при 700× g беше използвана за изолиране на ядрена ДНК (nDNA).
- ДНК беше изолирана с помощта на центрофужни колонки.
- Митохондриална ДНК (mtDNA) беше извлечена от изолирани митохондрии.
- Ядрена ДНК (nDNA) беше извлечена от неочистени ядрени екстракти, като и двата вида ДНК бяха получени от чернодробна тъкан на мишки.
Фрагментиране на ДНК:
- ДНК беше фрагментирана върху лед с помощта на ултразвуков апарат UP50H с характеристики 30-kHz/50-W и сонотрод с микровръх 0,5-mm при 14 μm за 2 × 30 секунди.
Визуализация и количествено определяне на фрагментирането:
- Фрагментирането след ултразвуковата обработка беше визуализирано върху 1% агарозен гел с багрилото за ДНК SYBR safe.
- Относителното количество на mtDNA и nDNA беше определено чрез qPCR.
(вж. Mariero et al., 2019)
За подготовка на проби с висок капацитет ултразвуковият апарат UIP400MTP за многоямкови плаки улеснява подготовката на голям брой проби в стандартни 96-ямкови, многоямкови и микротитърни плаки.
Прочетете повече за предимствата на подготовката на проби с висок капацитет с помощта на UIP400MTP!
Съвети за оптимално изолиране на митохондрии чрез ултразвукова обработка:
- Контрол на температурата: Извършвайте всички стъпки в температурния диапазон от 0°C до 4°C. Това е от решаващо значение за запазване на целостта и функционалността на митохондриите.
- Ефективност и бързина: Работете бързо и пречиствайте митохондриите само до степента, необходима за конкретното ви приложение. Прекомерните манипулации могат да доведат до значителни загуби на митохондриално съдържимо.
- Разреждане на суспензиите: Поддържайте ниски концентрации на клетъчните и органелните суспензии през целия процес на изолиране. Това помага да се сведат до минимум рисковете от улавяне и аглутинация, като по този начин се подобрява чистотата на изолираните митохондрии.
- Обем на пробата: Изберете множество препаративни процедури в малък мащаб вместо една в голям мащаб. Този подход обикновено води до по-добър добив, тъй като увеличаването на мащаба не увеличава пропорционално количеството митохондрии, които могат да бъдат получени. Ултразвуковият апарат UIP400MTP за многоямкови плаки улеснява бързия и надежден лизис на клетки за изолиране на митохондрии, както и екстракцията на белтъци от митохондриите.
Тези насоки ще направят процеса на изолиране чрез ултразвуков лизис и центрофугиране по-ефективен, като осигурят висококачествени митохондриални препарати, подходящи за последващи приложения.
Ултразвукови апарати на Hielscher – качество, произведено в Германия
Ултразвуковите апарати на Hielscher са добре известни с най-високите си стандарти за качество и конструкция. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Ултразвуковите апарати на Hielscher лесно се справят с тежки условия и взискателни работни среди.
Hielscher Ultrasonics е компания, сертифицирана по ISO, и поставя специален акцент върху високопроизводителни ултразвукови апарати, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher съответстват на CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.
Ултразвуков апарат UIP400MTP за 96-ямкови плаки за ултразвукова обработка на микротитърни и многоямкови плаки
Литература / Източници
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Често задавани въпроси за митохондриите и митохондриалната диагностика
Какво представляват митохондриите?
Митохондриите са органели, обградени с мембрани, които се намират в клетките на повечето еукариотни организми. Те са известни като енергийните централи на клетката, защото произвеждат енергия под формата на аденозинтрифосфат (ATP) чрез процеса на клетъчно дишане. Освен това митохондриите имат собствена ДНК и играят ключова роля в други клетъчни процеси, включително регулирането на клетъчния цикъл и клетъчната смърт.
Какво отличава mtDNA от геномната ДНК?
Митохондриалната ДНК (mtDNA) се различава от геномната ДНК (gDNA) по няколко основни признака. MtDNA се намира в митохондриите, има кръгова структура и се унаследява по майчина линия, докато gDNA се намира в клетъчното ядро, има линейна структура и се унаследява от двамата родители. MtDNA е много по-малка и кодира само 37 гена, докато gDNA съдържа около 20 000–25 000 гена. MtDNA присъства в множество копия във всяка клетка, има по-висока честота на мутации и кодира предимно белтъци, участващи в митохондриалната функция. За разлика от нея, gDNA обикновено е диплоидна, има по-ниска честота на мутации и кодира огромен набор от гени, необходими за развитието и функционирането на организма. Освен това транскрипцията и транслацията на mtDNA протичат в митохондриите, докато транскрипцията на gDNA протича в ядрото, а транслацията – в цитоплазмата. Тези различия отразяват различните им роли и еволюционен произход.
Какво представлява безклетъчният екстракт?
Безклетъчният екстракт е разтвор, съдържащ съдържимото на лизирани клетки, включително белтъци, нуклеинови киселини и други клетъчни компоненти, но без неповредени клетъчни мембрани. Този екстракт се използва в биохимични и молекулярно-биологични изследвания за изучаване на клетъчни процеси in vitro, като позволява на изследователите да анализират реакции и механизми извън живите клетки.
Каква роля играят PCR тестовете в митохондриалната диагностика?
PCR тестовете играят решаваща роля в митохондриалната диагностика, като позволяват откриването на мутации, делеции или вариации в броя на копията на митохондриалната ДНК (mtDNA). Те позволяват амплификацията на специфични участъци от mtDNA за идентифициране на патогенни варианти, свързани с митохондриални заболявания. Техники, основани на PCR, като количествена PCR (qPCR) и PCR за дълги фрагменти, се използват и за оценка на целостта на mtDNA, нивата на хетероплазмия и изчерпването на mtDNA, като предоставят съществена информация за митохондриалната функция и заболяванията.
Научете как ултразвуковият апарат UIP400MTP за микроплаки улеснява PCR тестовете и анализите!
Какво представлява диференциалното центрофугиране?
Диференциалното центрофугиране е широко използвана техника за клетъчно фракциониране и изолиране на митохондрии. Този метод разделя клетъчните структури въз основа на техния коефициент на седиментация, който зависи както от плътността, така и от формата. Процесът включва прилагане на различни нива на центробежна сила върху проби в буферирани солеви разтвори с определени плътности. Структури със сходни коефициенти на седиментация ще се утаят на дъното на събирателната епруветка по едно и също време, което позволява получаването им.
Как се използва диференциалното центрофугиране за изолиране на митохондрии?
Диференциалното центрофугиране позволява на изследователите ефективно да отделят митохондриалните фракции от другите клетъчни компоненти. Изолирането на митохондрии включва няколко стъпки на центрофугиране и последващо получаване на изолата.
Първоначално центрофугиране: Приложете ниска центробежна сила, за да утаите големите клетъчни остатъци и ядрата.
Последващи центрофугирания: Увеличавайте центробежната сила стъпаловидно, за да утаите фракции, обогатени с митохондрии. Всяка стъпка на центрофугиране отстранява структури с прогресивно по-високи коефициенти на седиментация.
Получаване на фракциите: След всяко центрофугиране утайката се събира, а супернатантът се подлага на по-високи g-сили, за да се изолира следващата фракция. Това се повтаря до постигане на желаната чистота на митохондриите.