UIP400MTP mikroplitə sonikatoru ilə amiloid fibrillərinin əmələ gəlməsi

Amiloid fibrilləri, kristallar kimi, nüvələşmə və sonrakı böyümə prosesi nəticəsində əmələ gəlir. Lakin nüvələşmənin yüksək sərbəst enerji baryeri səbəbindən amiloid fibrillərinin spontan əmələ gəlməsi yalnız uzunmüddətli gecikmə fazasından sonra baş verir. Ultrasəs emalı amiloid nüvələşməsini induksiya etmək üçün güclü vasitəyə çevrilərək fibrillərin əmələ gəlməsini əhəmiyyətli dərəcədə sürətləndirir. Tioflavin T (ThT) flüoressensiyasından istifadə edən mikroplitə oxuyucusu ilə birləşdirildikdə ultrasəs emalı eyni vaxtda çoxsaylı nümunələrdə amiloid fibrillərinin yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı ilə aşkarlanmasını təmin edir.

UIP400MTP mikroplitə sonikatoru ilə ultrasəs vasitəsilə induksiya olunan amiloid fibrillərinin əmələ gəlməsi

UIP400MTP çoxyuvalı plitə sonikatoru ilə tədqiqat məqsədləri üçün eyni keyfiyyətli amiloid fibrillərini böyük miqdarda sürətlə sintez etmək mümkündür. Bu səmərəli yanaşma zülalların amiloid əmələ gətirmə qabiliyyətini öyrənməyə imkan verir. Bu üsul dializlə əlaqəli amiloidozla bağlı amiloidogen zülal olan β2-mikroqlobulin (β2-m) üzərində göstərildiyi kimi, sürətli və təkrarlana bilən amiloid fibrilləşməsini asanlaşdırır.

Sadə eksperimental yanaşma: ultrasəs vasitəsilə induksiya olunan amiloid fibrilləşməsi

Fibrillərin əmələ gəlməsini induksiya etmək üçün 96-yuvalı mikroplitə bütün yuvalarda bərabər ultrasəs təsirini təmin edən UIP400MTP çoxyuvalı plitə sonikatorunun mərkəzinə yerləşdirildi. Eksperimental şərait aşağıdakı kimi idi:

Hər yuvada 5 μM ThT əlavə edilmiş 0,2 ml β2-mikroqlobulin məhlulu (0,3 mg/ml, pH 2,5) var idi.
Plitə ultrasəs emalı dövrlərinə, məsələn, 1 dəqiqəlik ultrasəs emalından sonra 9 dəqiqəlik fasiləyə məruz qoyuldu.
Ultrasəs emalından sonra ThT flüoressensiyası mikroplitə oxuyucusu ilə ölçüldü.

(bax: So et al., 2011)

Hielscher UIP400MTP çoxquyulu lövhələriniz, PCR lövhələriniz və ya nümunə sınaq borularınız üçün ən universal sonikatordur. 400 vatt fasiləsiz ultrasəs çıxış gücü ilə hüceyrə lizisi, emulsiyalaşdırma, zülal ekstraksiyası, DNA / RNA fraqmentasiyası, deaqqlomerasiya, FFPE ekstraksiyası, hüceyrələrin və biofilmlərin səthdən ayrılması və ya emulsiyalaşdırma kimi tətbiqlər üçün nəzərdə tutulmuşdur. UIP400MTP ultrasəs vannası deyil. O, fokuslanmış ultrasəs emalı üçün yüksək intensivlikli kasa tipli sonotroddur. Bu güclü təmassız sonikator standart çoxquyulu lövhənizin bütün quyularında bərabər ultrasəs emalı təmin edir. Amplitudanı, gücü və impuls rejimini dəqiq idarə edə bilərsiniz. Daxili taymer və temperatur zondu nəticələrin sabitliyini təmin edir. UIP400MTP lövhə sonikatoru nümunələri su vannası ilə soyudur (xarici soyuducu əlavə seçim kimi mövcuddur).

Ənənəvi çalxalama ilə müqayisə

Ənənəvi çalxalama üsulları ilə müqayisədə ultrasəs emalı fibrillərin əmələ gəlməsinin gecikmə fazasını kəskin şəkildə azaltdı. Mikroplitənin ənənəvi çalxalanması şəraitində 20 saatdan sonra 10 yuvadan yalnız 1-də ThT flüoressensiyasının artması müşahidə edildi. Bunun əksinə, dövri ultrasəs emalından istifadə edildikdə (15 dəqiqəlik ultrasəs emalından sonra 5 dəqiqəlik sakitlik dövrü) ilk ultrasəs emalından dərhal sonra ThT flüoressensiyasında əhəmiyyətli artım aşkar edildi.

Fibrilləşmə kinetikasının sürətləndirilməsi

So et al. (2011) tərəfindən əldə edilmiş nəticələr göstərdi ki, ultrasəs emalı ilə pH 2,5 şəraitində β2-mikroqlobulinin spontan fibril əmələ gətirmə müddətini bir neçə saatdan cəmi 10–15 dəqiqəyə endirmək mümkündür.
Atom qüvvə mikroskopiyası (AFM) görüntüləri təsdiqlədi ki, hər 15 dəqiqədən bir 10 dəqiqəlik ultrasəs emalı ilə əmələ gətirilən fibrillər morfoloji baxımdan hər 10 dəqiqədən bir 1 dəqiqəlik ultrasəs emalı ilə əmələ gətirilənlərdən fərqlənmirdi. Bu, ultrasəs vasitəsilə induksiya olunan amiloid fibrilləşməsinin təkrarlana bilməsini və etibarlılığını vurğulayır.

UIP400MTP çoxyuvalı plitə sonikatoru ultrasəs nüvələşməsi vasitəsilə amiloid fibrillərinin əmələ gəlməsini sürətləndirir

Hər 10 min-dən bir 1-min ultrasəs emalı (i), hər 15 min-dən bir 10-min ultrasəs emalı (ii) və ultrasəs emalı olmadan toxumlama reaksiyası (iii) ilə alınmış amiloid fibrillərinin AFM görüntüləri. Ağ miqyas xətti 1 μm-i göstərir.
Tədqiqat və görüntülər: ©So et al., 2011

Neytral pH şəraitində fibrilləşmə

Hətta neytral pH şəraitində də 1,5 saatlıq gecikmə müddətindən sonra fibrillərin əmələ gəlməsinə nail olundu. Bu, ultrasəs emalının nüvələşmə və böyümə üçün enerji baryerini əhəmiyyətli dərəcədə aşağı saldığını göstərir. Bu nəticə amiloid fibrilləşməsinin əsasən fiziki reaksiya olması və böyük ölçüdə ultrasəs emalının effektiv şəkildə azaltdığı nüvələşmə enerji baryeri ilə məhdudlaşması fərziyyəsini daha da dəstəkləyir.

Amiloidlə əlaqəli xəstəliklərin tədqiqinə təsir

UIP400MTP mikroplitə sonikatoru ilə amiloid fibrillərinin asan və etibarlı şəkildə əmələ gətirilməsi Alzheimer xəstəliyinin (AD) və Parkinson xəstəliyi, II tip diabet və sistemik amiloidozlar kimi amiloidlə əlaqəli digər xəstəliklərin tədqiqi üçün əhəmiyyətli nəticələrə malikdir. AD zamanı amiloid-β (Aβ) aqreqasiyası əsas patoloji əlamətdir, lakin uzun gecikmə fazaları və ənənəvi üsullardakı dəyişkənlik səbəbindən onun fibrilləşmə kinetikasını öyrənmək çətin olaraq qalır. Ultrasəs emalı ilə fibrillərin əmələ gətirilməsi nüvələşməni sürətləndirir, yüksək təkrarlana bilməni və dəyişkənliyin azalmasını təmin edir. Bu, potensial inhibitorların skrininqi və amiloidogen mexanizmlərin başa düşülməsi üçün mühüm əhəmiyyət daşıyır. Bundan əlavə, UIP400MTP cihazının yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı zülalların yanlış qatlanması və aqreqasiyasının genişmiqyaslı tədqiqinə imkan verir, fibrillərin əmələ gəlməsini tənzimləyə və potensial olaraq neyrodegenerasiyanın irəliləməsini zəiflədə bilən terapevtik vasitələrin kəşfini asanlaşdırır.

Bu tədqiqat UIP400MTP çoxyuvalı plitə sonikatoru ilə ultrasəs emalının amiloid fibrillərinin əmələ gəlməsini sürətləndirmək üçün yüksək səmərəli üsul olduğunu göstərir. Bu yanaşmanın əsas üstünlüklərinə aşağıdakılar daxildir:

Fibrilləşmənin gecikmə müddətinin kəskin azalması.
Bütün yuvalarda bərabər ultrasəs təsiri nəticəsində fibrillərin təkrarlana bilən şəkildə əmələ gəlməsi.
Yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı ilə skrininq aparmaq imkanı sayəsində zülalların amiloid əmələ gətirmə qabiliyyətinin genom miqyasında axtarışları üçün uyğunluq.

Ultrasəs emalını ThT flüoressensiyasının aşkarlanması ilə birləşdirən bu üsul amiloid fibrilləşməsini öyrənmək üçün sürətli, miqyası artırıla bilən və etibarlı platforma təqdim edir. Səmərəliliyi və yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı potensialı nəzərə alındıqda, bu yanaşma biofiziki və əczaçılıq tədqiqatları üçün amiloid fibrillərinin asan sintezini asanlaşdıra bilər və amiloidlə əlaqəli tədqiqatlar və dərman skrininqi üçün perspektivli vasitə təqdim edir.

Əlaqəli mövzular

Ədəbiyyat / İstinadlar

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Masatomo So, Hisashi Yagi, Kazumasa Sakurai, Hirotsugu Ogi, Hironobu Naiki, Yuji Goto (2011): Ultrasonication-Dependent Acceleration of Amyloid Fibril Formation. Journal of Molecular Biology, Volume 412, Issue 4, 2011. 568-577.
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.

Tez-tez verilən suallar

Amiloidin ilkin nüvələşməsi nədir?

Amiloidin ilkin nüvələşməsi amiloid fibrillərinin əmələ gəlməsində sürəti məhdudlaşdıran ilkin mərhələdir. Bu mərhələdə monomer zülallar konformasiya dəyişikliklərinə məruz qalır və öz-özünə birləşərək kritik nüvə əmələ gətirir. Bu nüvə sonrakı aqreqasiya üçün qəlib rolunu oynayır.

Amiloidoz zamanı fibril necə əmələ gəlir?

Amiloidoz zamanı yanlış qatlanmış zülallar nüvələşmədən asılı polimerləşmə yolu ilə aqreqasiya edir. Nüvə əmələ gəldikdən sonra monomerlər ikincili nüvələşmə və qəlib əsasında böyümə yolu ilə sürətlə uzanaraq β-təbəqələrlə zəngin fibrillərə çevrilir və amiloid çöküntülərinin yaranmasına səbəb olur.

Amiloid fibrillərinin polimorfizmi nədir?

Amiloid fibrillərinin polimorfizmi eyni zülalın əmələ gətirdiyi fibrillərdəki struktur müxtəlifliyini ifadə edir. Fibrillərin morfologiyası, protofilamentlərin düzülüşü və molekulların qablaşmasındakı fərqlər mühit şəraiti, mutasiyalar və ya fərqli aqreqasiya yolları səbəbindən yaranır.

Amiloid fibrilləri ilə lövhəciklər arasındakı fərq nədir?

Amiloid fibrilləri xətti, β-təbəqələrlə zəngin zülal aqreqatlarıdır. Amiloid lövhəcikləri isə Alzheimer kimi neyrodegenerativ xəstəliklərdə müşahidə olunduğu kimi, çox vaxt lipidlər, metallar və hüceyrə qalıqları ilə qarışmış aqreqasiya etmiş fibrillərin hüceyrədənkənar çöküntüləridir.

Alfa-sinuklein ilə amiloid arasındakı fərq nədir?

Alfa-sinuklein sinaptik funksiyada iştirak edən neyron zülalıdır, lakin patoloji şəraitdə yanlış qatlanır və amiloidəbənzər fibrillər əmələ gətirir. “Amiloid” yanlış qatlanmış fibrilyar zülal aqreqatları üçün ümumi termindir, alfa-sinuklein fibrilləri isə Parkinson kimi xəstəliklərə xasdır.

Zülal fibrili nədir?

Zülal fibrili yanlış qatlanmış və ya qismən açılmış zülalların əmələ gətirdiyi yüksək dərəcədə nizamlanmış, β-təbəqələrlə zəngin, sapşəkilli aqreqatdır. Bu fibrillər adətən həll olmur və nüvələşmədən asılı polimerləşmə yolu ilə yaranır. Onlar amiloidozlar və neyrodegenerativ xəstəliklər (məsələn, Alzheimer, Parkinson) daxil olmaqla müxtəlif patoloji vəziyyətlərlə əlaqəlidir. Lakin bioloji sistemlərdə bəzi funksional zülal fibrilləri də mövcuddur, məsələn, bakteriyalarda curli lifləri və hörümçəklərdə ipək fibrilləri.