UIP400MTP Microplate Sonicator istifadə edərək amiloid fibril formalaşması

Amiloid fibrilləri, kristallar kimi, nüvələşmə və sonrakı böyümə prosesi ilə əmələ gəlir. Bununla belə, nüvələşmənin yüksək sərbəst enerji maneəsinə görə, spontan amiloid fibril formalaşması yalnız uzun müddət gecikmə mərhələsindən sonra baş verir. Ultrasonikasiya, amiloid nüvələrinin əmələ gəlməsini stimullaşdırmaq üçün güclü bir vasitə kimi ortaya çıxdı və bununla da fibril formalaşmasını əhəmiyyətli dərəcədə sürətləndirdi. Tioflavin T (ThT) flüoresansından istifadə edən mikroplata oxuyucusu ilə birləşdirildikdə, ultrasəs eyni vaxtda bir neçə nümunədə amiloid fibrillərinin yüksək məhsuldarlıqla aşkarlanmasına imkan verir.

UIP400MTP Mikroplitə Sonicatoru ilə Ultrasəslə İnduksiya Edilmiş Amiloid Fibril Formasiyası

UIP400MTP çox quyulu boşqab sonikatoru ilə böyük miqdarda eyni keyfiyyətli amiloid fibrilləri tədqiqat məqsədləri üçün sürətlə sintez edilə bilər. Bu effektiv yanaşma zülalların amiloidogenliyini öyrənməyə imkan verir. Bu texnika, dializlə əlaqəli amiloidozla əlaqəli amiloidogen zülal olan β2-mikroqlobulin (β2-m) ilə nümayiş etdirildiyi kimi, sürətli və təkrarlana bilən amiloid fibrilasiyasını asanlaşdırır.

Sadə Eksperimental Yanaşma: Ultrasonik Amiloid Fibrilasiyası

Fibril əmələ gəlməsini stimullaşdırmaq üçün UIP400MTP çox quyulu boşqab sonikatorunun mərkəzinə 96 quyulu mikroplata yerləşdirilib ki, bu da bütün quyularda vahid ultrasəs məruz qalmasını təmin edir. Təcrübə şərtləri aşağıdakı kimi idi:

1. Hər quyuda 5 μM ThT ilə əlavə edilmiş 0,2 ml β2-mikroqlobulin məhlulu (0,3 mq/ml, pH 2,5) var idi.
2. Plaka 1 dəqiqəlik ultrasəsləmə və 9 dəqiqəlik fasilə kimi ultrasəs dövrlərinə məruz qaldı.
3. Post-sonikasiya, ThT flüoresansı mikroplate oxuyucusu ilə ölçüldü.

(bax. So et al., 2011)

Adi Ajitasyon ilə Müqayisə

Ənənəvi təşviqat üsulları ilə müqayisədə, ultrasəs fibril formalaşmasının geriləmə mərhələsini kəskin şəkildə azaldır. Adi mikroplatin sarsıntısı şəraitində, 10 quyudan yalnız 1-də 20 saatdan sonra ThT floresansının artması müşahidə edildi. Bunun əksinə olaraq, dövrəli ultrasəsdən istifadə edərək (15 dəqiqə sonikasiya və 5 dəqiqəlik sükunət), ilk sonikasiya müalicəsindən dərhal sonra əhəmiyyətli ThT floresan artımı aşkar edildi.

Fibrilasiya Kinetikasının Sürətli Sürətlənməsi

So et al əldə edilən nəticələr. (2011) göstərdi ki, pH 2.5-də β2-mikroqlobulinin spontan fibril əmələ gəlməsi ultrasəslə bir neçə saatdan cəmi 10-15 dəqiqəyə qədər sürətləndirilə bilər.
Atom qüvvəsi mikroskopiyası (AFM) şəkilləri təsdiqlədi ki, hər 15 dəqiqədən bir 10 dəqiqəlik ultrasəslə əmələ gələn fibrillər hər 10 dəqiqədən bir 1 dəqiqəlik ultrasəslə əmələ gələnlərdən morfoloji cəhətdən fərqlənmir. Bu, ultrasəslə törədilən amiloid fibrilasiyasının təkrar istehsalını və möhkəmliyini vurğulayır.

Hər 10 dəqiqədən bir 1 dəqiqəlik ultrasəslə (i), hər 15 dəqiqədən bir 10 dəqiqəlik sonikasiya ilə (ii) və ultrasəssiz toxumlama reaksiyası ilə (iii) əmələ gələn amiloid fibrillərinin AFM şəkilləri. Ağ miqyas çubuğu 1 μm-i təmsil edir.
Tədqiqat və şəkillər: ©So et al., 2011

Neytral pH Şəraitlərində Fibrilasiya

Neytral pH şəraitində belə, 1,5 saatlıq gecikmədən sonra fibril əmələ gəlməsi əldə edildi, bu ultrasəslənmənin nüvələşmə və böyümə üçün enerji maneəsini əhəmiyyətli dərəcədə aşağı saldığını nümayiş etdirdi. Bu, amiloid fibrilasiyasının əsasən fiziki reaksiya olduğu və ultrasəslənmənin effektiv şəkildə azaldan nüvə enerjisi maneəsi ilə məhdudlaşdığı fərziyyəsini daha da dəstəkləyir.

Amiloidlə əlaqəli Xəstəlik Tədqiqatına Təsir

UIP400MTP mikroplate sonikatorundan istifadə edərək amiloid fibrillərinin asan və etibarlı formalaşması Alzheimer xəstəliyinin (AD) tədqiqatı və Parkinson xəstəliyi, II tip diabet və sistemli amiloidozlar kimi digər amiloidlə əlaqəli xəstəliklər üçün əhəmiyyətli nəticələrə malikdir. AD-də amiloid-β (Aβ) aqreqasiyası əsas patoloji əlamətdir, lakin onun fibrilasiya kinetikasının öyrənilməsi uzun gecikmə fazalarına və ənənəvi metodların dəyişkənliyinə görə çətin olaraq qalır. Ultrasonikasiya ilə idarə olunan fibril formalaşması nüvələşməni sürətləndirir, yüksək reproduktivliyi və azaldılmış dəyişkənliyi təmin edir ki, bu da potensial inhibitorları yoxlamaq və amiloidogen mexanizmləri başa düşmək üçün çox vacibdir. Bundan əlavə, UIP400MTP-nin yüksək məhsuldarlıq qabiliyyəti zülalların yanlış qatlanması və aqreqasiyası ilə bağlı geniş miqyaslı araşdırmalara imkan verir, fibril formalaşmasını modulyasiya edə bilən və neyrodegenerativ inkişafı potensial olaraq azalda bilən terapevtik agentlərin kəşfini asanlaşdırır.

Bu tədqiqat, amiloid fibril əmələ gəlməsini sürətləndirmək üçün yüksək effektiv metod kimi UIP400MTP çox quyulu boşqab sonikatorundan istifadə edərək ultrasəsləşdirmə qurur. Bu yanaşmanın əsas üstünlüklərinə aşağıdakılar daxildir:

• Fibrilasiya üçün gecikmə müddətində dramatik azalma.
• Bütün quyularda vahid ultrasəs məruz qalması, təkrarlana bilən fibril formalaşmasına imkan verir.
• Yüksək məhsuldarlıqlı skrininq qabiliyyəti, onu protein amiloidogenliyinin genom miqyasında axtarışları üçün uyğun edir.

ThT floresan aşkarlanması ilə ultrasəsləşdirməni birləşdirərək, bu üsul amiloid fibrilasiyasını öyrənmək üçün sürətli, genişlənə bilən və etibarlı platforma təmin edir. Səmərəliliyini və yüksək məhsuldarlıq potensialını nəzərə alaraq, bu yanaşma biofiziki və əczaçılıq tədqiqatları üçün amiloid fibrillərinin asan sintezini asanlaşdıra bilər, amiloidlə əlaqəli tədqiqatlar və dərmanların skrininqi üçün perspektivli vasitə təklif edir.