UIP400MTP Sonikatorundan İstifadə Edərək Prionların Yüksək Məhsuldarlıqlı Aşkarlanması üçün PMCA

UIP400MTP çoxquyulu lövhə sonikatoru zülalların yanlış qatlanmasının dövri amplifikasiyası (PMCA) üçün yüksək məhsuldarlıqlı nümunə hazırlığında güclü bir həll təklif edir. Çoxsaylı quyular arasında vahid enerji paylanması təmin etməklə və dəqiq sonikasiya parametrlərini qorumaqla, bu sistem çoxsaylı nümunələrin müstəsna təkrarlanabilirliklə eyni vaxtda işlənməsinə imkan verir. Bu imkanlar, analiz inhibitorlarının nəticələri gizlədə bildiyi tüpürcək kimi çətin bioloji nümunələrdə aşağı konsentrasiyalarda prionları aşkar etmək üçün PMCA-nın optimallaşdırılması baxımından mühüm əhəmiyyət daşıyır.

Maralkimilərdə xroniki arıqlama xəstəliyi (CWD) və insanlarda Creutzfeldt-Jakob xəstəliyi (CJD) kimi prion xəstəlikləri, yanlış qatlanmış prion zülallarının (PrP^Sc) törətdiyi neyrodegenerativ pozğunluqlardır. Bu xəstəliklər çox vaxt tüpürcək, qan və sidik kimi bədən mayelərində yoluxucu prionların aşağı səviyyələrdə olması ilə müşayiət olunur ki, bu da diaqnostika və tədqiqatı çətinləşdirir. Ətraf mühit matrislərinə ifraz olunan prionlar vasitəsilə CWD-nin üfüqi ötürülməsi vəhşi təbiətin idarə olunması və ekoloji sağlamlıq üçün xüsusilə əhəmiyyətli nəticələrə malikdir. Eynilə, Creutzfeldt-Jakob xəstəliyi kimi xəstəliklərdə insan nümunələrindən yanlış qatlanmış prion zülallarının etibarlı amplifikasiyası diaqnostikanın inkişafı və xəstəliyin irəliləməsinin başa düşülməsi üçün vacibdir.

Modifikasiya olunmuş PMCA protokolunun tətbiqi ümumi analiz inhibitorlarının (məsələn, tüpürcəkdəki musinlərin) təsirini aradan qaldırmağa və real vaxtda çalxalanma ilə induksiya olunan çevrilmə (RT-QuIC) kimi üsullarla başqa halda aşkarlanmayan və ya aşkarlanma nəticələri qeyri-müəyyən olan prionların aşkarlanmasında yüksək həssaslıq əldə etməyə imkan verir. Bu irəliləyişlər müxtəlif xəstəliklər üçün prionların aşkarlanmasını yaxşılaşdırır və PMCA-nı prion tədqiqatı və diaqnostikası üçün əvəzolunmaz vasitəyə çevirir. UIP400MTP çoxquyulu lövhə sonikatoru mikrolövhələrdə (məsələn, 6-, 24- və ya 96-quyulu lövhələrdə) və ya borucuq ştativindəki flakonlarda çoxsaylı nümunələri sonikasiya edərək yüksək məhsuldarlıqlı PMCA-nı asanlaşdırır.

Zülalların Yanlış Qatlanmasının Yüksək Məhsuldarlıqlı Dövri Amplifikasiyası (PMCA) üçün Protokol

Aşağıdakı protokol etibarlı tədqiqat nəticələri əldə etmək üçün çoxsaylı nümunələrin tamamilə eyni şəraitdə səmərəli işlənməsinə imkan verir.

Nümunələrin Hazırlanması

Başlanğıc Material:
Prepare samples by:

• Resuspending sarkosyl extraction pellets in PMCA substrate.
• Prion toxumları ilə birbaşa beyin homojenatları və ya qan nümunələri.

Substrat:

• PrP-ni həddindən artıq ifadə edən transgen siçanlardan hazırlanmış 10% (ağırlıq/həcm) beyin homogenatı istifadə edin.^C (e.g., Tg mice).
• Homogenize the brain tissue in:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Store the substrate at -80ºC until use.

Nümunələrin Mikrolövhədə və ya Borucuqlarda Yerləşdirilməsi:
Borucuqlar:

• 90 μL beyin homogenat substratı və 10 μL nümunə ilə toxum əlavə edin (məsələn, qan, beyin homogenatı və ya sarkosil qranul).
• Place 3 Teflon beads (1,59-mm or 2,38-mm diameter) in each 0,2 mL tube.
• Boruları UIP400MTP sonikatoru ilə uyğun bir rafa quraşdırın.

6-Quyulu Mikrolövhə:

• Hər yuvaya 5 mL beyin homogenatı substratı əlavə edin və 500 μL nümunə ilə inokulyasiya edin.
• Add 3 Teflon beads to each well.

PMCA Proseduru

Yerləşdirmə:
İstehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq boru rəfini və ya 6 quyulu mikroplitəni UIP400MTP sonikatoruna yerləşdirin.

Dövr Proqramı:
Perform 144 PMCA cycles as follows:

• İnkubasiya: 37°C-də 29 dəqiqə 30 saniyə.
• Sonication: 30 seconds at 60% amplitude.
• Temperaturun monitorinqi: Nümunə istiliyinə nəzarət etmək və UIP400MTP-ni maks. temperatur 48-50 ° C.

Sonrakı Raundlar:
144 dövrənin birinci dövrəsini tamamladıqdan sonra gücləndirilmiş materialın bir hissəsini köçürün:

• Təzə transgenik siçan beyin homogenat substratına 10 qat sulandırın.
• Eyni sonikasiya parametrlərini saxlayaraq, sonrakı turlar üçün 96 PMCA dövrünü yerinə yetirin.
• İstədiyiniz sayda dövrəyə (adətən 5-ə qədər) davam edin.

PrP-nin Aşkarlanması^Sc

1. Proteinaza K ilə Parçalanma:
   – Nümunələri 37°C temperaturda 1 saat ərzində Proteinase K (50 μg/mL) ilə işləyin.
   – SDS nümunə buferi əlavə edərək və 10 dəqiqə qaynadaraq proteolitik parçalanmanı dayandırın.
2. Western Blot Analizi:
   – Analyze digested samples using:
   – 6H4 or PRC1 anti-PrP antibodies.
   – SDS-PAGE aparın və aşkarlama üçün PVDF membranlarına köçürün.

 

Hielscher UIP400MTP çoxquyulu lövhələriniz, PCR lövhələriniz və ya nümunə sınaq borularınız üçün ən universal sonikatordur. 400 vatt fasiləsiz ultrasəs çıxış gücü ilə hüceyrə lizisi, emulsiyalaşdırma, zülal ekstraksiyası, DNA / RNA fraqmentasiyası, deaqqlomerasiya, FFPE ekstraksiyası, hüceyrələrin və biofilmlərin səthdən ayrılması və ya emulsiyalaşdırma kimi tətbiqlər üçün nəzərdə tutulmuşdur. UIP400MTP ultrasəs vannası deyil. O, fokuslanmış ultrasəs emalı üçün yüksək intensivlikli kasa tipli sonotroddur. Bu güclü təmassız sonikator standart çoxquyulu lövhənizin bütün quyularında bərabər ultrasəs emalı təmin edir. Amplitudanı, gücü və impuls rejimini dəqiq idarə edə bilərsiniz. Daxili taymer və temperatur zondu nəticələrin sabitliyini təmin edir. UIP400MTP lövhə sonikatoru nümunələri su vannası ilə soyudur (xarici soyuducu əlavə seçim kimi mövcuddur).

 

Daha Etibarlı Nəticələr üçün Daha Çox Nümunə İşləyin

UIP400MTP çoxquyulu lövhə sonikatoru zülalların yanlış qatlanmasının dövri amplifikasiyasının (PMCA) səmərəliliyini və miqyaslandırılmasını əhəmiyyətli dərəcədə artıraraq, prosedurun ənənəvi olaraq çox vaxt tələb etməsi problemini həll edir. 96-quyulu lövhədə 96-ya qədər nümunənin eyni vaxtda işlənməsinə imkan verməklə sistem bütün quyularda dəqiq və vahid sonikasiya şəraitini qoruyarkən PMCA iş axınlarını sadələşdirir. Bu yüksək məhsuldarlıq imkanı əl ilə işləməni minimuma endirir, çox əmək tələb edən mərhələləri azaldır və təkrarlanabilirliyi təmin edir, onu prion tədqiqatı üçün əvəzolunmaz vasitəyə çevirir. Xroniki arıqlama xəstəliyi və ya Creutzfeldt-Jakob xəstəliyi araşdırıldıqda, UIP400MTP daha yüksək səmərəliliklə genişmiqyaslı tədqiqatları asanlaşdıraraq tədqiqatçılara müasir diaqnostik və elmi tətbiqlərin tələblərini qarşılamağa imkan verir.

---

---

Ədəbiyyat / İstinadlar

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.