UIP400MTP Sonicator istifadə edərək Prionların Yüksək Ötürmə qabiliyyətinin aşkarlanması üçün PMCA

UIP400MTP çox quyulu boşqab sonikatoru zülalın səhv qatlanan siklik gücləndirmə (PMCA) prosesində yüksək məhsuldarlıqlı nümunənin hazırlanması üçün güclü həll təklif edir. Birdən çox quyu arasında vahid enerji paylanmasını təmin etməklə və dəqiq sonikasiya parametrlərini saxlamaqla, bu sistem müstəsna təkrarlanma qabiliyyəti ilə çoxsaylı nümunələrin eyni vaxtda işlənməsinə imkan verir. Bu imkanlar, analiz inhibitorlarının nəticələri gizlədə bildiyi tüpürcək kimi çətin bioloji nümunələrdə aşağı konsentrasiyalarda prionları aşkar etmək üçün PMCA-nın optimallaşdırılması üçün çox vacibdir.

Servidlərdə xroniki zəifləmə xəstəliyi (CWD) və insanlarda Creutzfeldt-Jakob xəstəliyi (CJD) kimi prion xəstəlikləri səhv qatlanmış prion zülallarının (PrP) səbəb olduğu neyrodegenerativ xəstəliklərdir.^Sc). Bu xəstəliklər tez-tez tüpürcək, qan və sidik kimi bədən mayelərində yoluxucu prionların aşağı səviyyəsini əhatə edir, bu da diaqnoz və tədqiqatı çətinləşdirir. Ətraf mühit matrislərində tökülən prionlar vasitəsilə ƏU-nun üfüqi ötürülməsi vəhşi təbiətin idarə edilməsi və ekoloji sağlamlıq üçün xüsusilə əhəmiyyətli təsirlərə malikdir. Eynilə, Creutzfeldt-Jakob xəstəliyi kimi xəstəliklərdə insan nümunələrindən yanlış qatlanmış prion zülallarının etibarlı gücləndirilməsi diaqnostikanın inkişafı və xəstəliyin gedişatını başa düşmək üçün çox vacibdir.

Dəyişdirilmiş PMCA protokolunun tətbiqi ümumi analiz inhibitorlarını (məsələn, tüpürcəkdəki musinlər) yan keçməyə və real vaxt zəlzələ ilə induksiya edilmiş çevrilmə (RT-QuIC) kimi üsullardan istifadə etməklə aşkar edilməyən və ya qeyri-müəyyən olan prionların aşkarlanmasında yüksək həssaslığa nail olmağa imkan verir. Bu irəliləyişlər müxtəlif xəstəliklər üçün prion aşkarlamasını gücləndirərək, PMCA-nı prion tədqiqatı və diaqnostikası üçün əvəzsiz alətə çevirir. Çox quyulu boşqab sonikatoru UIP400MTP, mikroplitələrdə (məsələn, 6-, 24- və ya 96-quyulu lövhələr) və ya boru rəfindəki flakonlarda çoxsaylı nümunələri sonikasiya edən yüksək məhsuldarlıqlı PMCA-nı asanlaşdırır.

Yüksək məhsuldarlıqlı zülalların səhv qatlanan siklik gücləndirilməsi üçün protokol (PMCA)

Aşağıdakı protokol güclü tədqiqat nəticələri üçün eyni şərtlər altında yüksək nümunə sayının səmərəli işlənməsinə imkan verir.

nümunənin hazırlanması

Başlanğıc materialı:
Nümunələri hazırlayın:

• PMCA substratında sarkosil ekstraksiya qranullarının yenidən dayandırılması.
• Prion toxumları ilə birbaşa beyin homojenatları və ya qan nümunələri.

Substrat:

• PrP-ni həddindən artıq ifadə edən transgen siçanlardan hazırlanmış 10% (ağırlıq/həcm) beyin homogenatı istifadə edin.^C (məsələn, Tg siçanları).
• Beyin toxumasını homogenləşdirin:
  – 1 × PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• İstifadə olunana qədər substratı -80ºC-də saxlayın.

Microplate və ya Borularda Nümunə Quraşdırması:
Borular:

• 90 μL beyin homogenat substratı və 10 μL nümunə ilə toxum əlavə edin (məsələn, qan, beyin homogenatı və ya sarkosil qranul).
• Hər 0,2 ml boruya 3 teflon muncuq (1,59 mm və ya 2,38 mm diametr) qoyun.
• Boruları UIP400MTP sonikatoru ilə uyğun bir rafa quraşdırın.

6-Quyu Mikroplastinka:

• 5 ml beyin homogenat substratı və quyuya 500 μL nümunə ilə toxum əlavə edin.
• Hər quyuya 3 teflon boncuk əlavə edin.

PMCA Proseduru

Yerləşdirmə:
İstehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq boru rəfini və ya 6 quyulu mikroplitəni UIP400MTP sonikatoruna yerləşdirin.

Velosiped proqramı:
144 PMCA dövrünü aşağıdakı kimi yerinə yetirin:

• İnkubasiya: 37°C-də 29 dəqiqə 30 saniyə.
• Sonikasiya: 60% amplituda 30 saniyə.
• Temperaturun monitorinqi: Nümunə istiliyinə nəzarət etmək və UIP400MTP-ni maks. temperatur 48-50 ° C.

Sonrakı turlar:
144 dövrənin birinci dövrəsini tamamladıqdan sonra gücləndirilmiş materialın bir hissəsini köçürün:

• Təzə transgenik siçan beyin homogenat substratına 10 qat sulandırın.
• Eyni sonikasiya parametrlərini saxlayaraq, sonrakı turlar üçün 96 PMCA dövrünü yerinə yetirin.
• İstədiyiniz sayda dövrəyə (adətən 5-ə qədər) davam edin.

PrP-nin aşkarlanması^Sc

1. Proteinaz K həzmi:
   – Nümunələri 1 saat ərzində 37°C-də Proteinaz K (50 μq/mL) ilə müalicə edin.
   – SDS-nümunə tamponunu əlavə edərək və 10 dəqiqə qaynatmaqla həzmi dayandırın.
2. Western Blot Təhlili:
   – Həzm olunan nümunələri istifadə edərək təhlil edin:
   – 6H4 və ya PRC1 anti-PrP antikorları.
   – SDS-PAGE yerinə yetirin və aşkarlanması üçün PVDF membranlarına köçürün.

 

 

Daha Güclü Nəticələr üçün Daha çox Nümunələri emal edin

UIP400MTP çox quyulu boşqab sonikatoru, prosedurun ənənəvi olaraq vaxt aparan xarakterini nəzərə alaraq, zülalın yanlış qatlanan siklik gücləndirilməsinin (PMCA) səmərəliliyini və miqyasını əhəmiyyətli dərəcədə artırır. 96 quyu boşqabında 96 nümunəyə qədər eyni vaxtda emal etməyə imkan verməklə, sistem bütün quyularda dəqiq və vahid sonikasiya şəraitini qoruyarkən PMCA iş axınlarını asanlaşdırır. Bu yüksək məhsuldarlıq qabiliyyəti əl ilə işləməni minimuma endirir, əmək tutumlu addımları azaldır və təkrar istehsal qabiliyyətini təmin edərək, onu prion tədqiqatı üçün əvəzsiz alətə çevirir. İstər xroniki arıqlama xəstəliyinin, istərsə də Creutzfeldt-Jakob xəstəliyinin araşdırılmasından asılı olmayaraq, UIP400MTP tədqiqatçılara müasir diaqnostik və elmi tətbiqlərin tələblərinə cavab verməyə imkan verən geniş miqyaslı tədqiqatları daha səmərəli şəkildə asanlaşdırır.

---

---

Ədəbiyyat / İstinadlar

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.