Mitoxondrial diagnostika uchun namunalarni yuqori unumdorlikda tayyorlash

Tadqiqotlarda va klinikalarda mitoxondrial diagnostika sekvenslash, PCR va biokimyoviy tahlillar kabi turli usullar yordamida amalga oshiriladi. Bu usullar DNA mutatsiyalarini aniqlash va mitoxondriyalarning funksiyasini oʻlchash uchun qoʻllaniladi. Sekvenslash genetik mutatsiyalarni aniqlashga yordam beradi, PCR esa muayyan DNA ketma-ketliklarining miqdorini aniqlashi mumkin. Biokimyoviy tahlillar mitoxondrial oqsillar va fermentlarning funksional faolligini baholaydi.

Mitoxondrial kasalliklarni tashxislash bu kasalliklarning yaqqol klinik oʻzgaruvchanligi, shuningdek, ikki xil tarzda irsiylanadigan genom – mitoxondrial DNA (mtDNA) va yadro genomi – oʻrtasidagi murakkab oʻzaro taʼsir tufayli ayniqsa qiyin.

Ultratovush bilan ishlov berish yordamida DNAni ajratib olish va fragmentlash

Mushak toʻqimasidan DNA ajratib olish mtDNAda toʻqimaga xos oʻzgarishlar gumon qilinganda ayniqsa foydalidir. Bu oʻzgarishlar surunkali progressiv tashqi oftalmoplegiyada (CPEO) mtDNA deletsiyalarini, mitoxondrial miopatiyalarda mtDNAning nuqtaviy mutatsiyalarini yoki Alpers sindromida mtDNA miqdorining kamayishini oʻz ichiga olishi mumkin. Keyin mushak toʻqimasidan ajratib olingan DNAdan turli genetik tekshiruvlarda, masalan, deletsiyalarni aniqlash uchun Southern blot va uzun fragmentli PCR, mtDNA miqdorining kamayishini aniqlash uchun real vaqt rejimidagi PCR yoki nuqtaviy mutatsiyalarni aniqlash uchun sekvenslashda foydalanish mumkin.
Yuqori intensivlikdagi ultratovush toʻlqinlari yordamida ishlov berish mitoxondrial diagnostikada bir necha maqsadda qoʻllaniladi. U mitoxondriyalar va DNA kabi hujayra ichidagi tarkibiy qismlarni ajratib olish uchun hujayralarni lizis qilish, sekvenslash uchun mtDNA va nDNA kabi DNAni siljish kuchlari taʼsirida fragmentlash hamda namunalarni gomogenizatsiya qilish uchun ishlatiladi.

Namunalarni yuqori unumdorlikda tayyorlash uchun UIP400MTP planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi: UIP400MTP koʻp quduqli, mikrotitr va 96 quduqli planshetlardagi namunalarga bir tekis ultratovush bilan ishlov berib, hujayralarni parchalaydi, oqsillarni ajratib oladi va mtDNA hamda nDNA kabi DNAni fragmentlaydi.

Namunalarni yuqori unumdorlikda tayyorlash uchun UIP400MTP planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi koʻp quduqli va 96 quduqli planshetlardagi namunalarga bir tekis ultratovush bilan ishlov beradi

Hujayralar va toʻqimalardan mitoxondriyalarni qanday ajratib olish mumkin

Mitoxondriyalarni ajratib olish ikkita asosiy bosqichni oʻz ichiga oladi: hujayra tarkibini chiqarish uchun hujayralarni parchalash va mitoxondrial fraksiyalarni ajratish hamda yigʻib olish uchun differensial sentrifugalashdan foydalanish.

Ultratovush bilan ishlov berish
Hielscher ultratovush bilan ishlov berish qurilmalari standart lizis buferlari va toʻplamlari bilan mos keladi, shu sababli ular mitoxondriyalarni ajratib olish uchun mosdir. Ultratovush bilan ishlov berish ikkita asosiy maqsadga xizmat qiladi:

Hujayra lizisi: Ultratovush toʻlqinlari hujayra membranalarini parchalab, hujayra ichidagi tarkibiy qismlarni chiqaradi.
Mitoxondriyalarni parchalash: Keyingi bosqichda ultratovush bilan ishlov berish mitoxondrial oqsillar yoki mitoxondrial DNAni chiqarish uchun mitoxondriyalarni yorib ochishi mumkin.
mtDNAni fragmentlash: Ultratovush bilan ishlov berish sekvenslash uchun mitoxondrial DNAni siljish kuchlari taʼsirida fragmentlashning ishonchli usulidir.

Koʻp quduqli planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi UIP400MTP mitoxondrial namunalarni yuqori unumdorlikda tayyorlash imkonini beradi. Differensial sentrifugalash bilan birgalikda ultratovush bilan ishlov berish mitoxondriyalarni ajratib olish samaradorligini oshirib, keyingi turli qoʻllanishlar uchun mos boʻlgan butun mitoxondriyalarning yuqori miqdorda olinishini taʼminlaydi.

PCR plansheti bilan Hielscher UIP400MTP koʻp quduqli planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi

Hielscher UIP400MTP koʻp quduqli planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi har qanday standart planshet bilan ishlaydi

Hujayralarni yuzadan ajratish, bioplyonkani koʻchirish, hujayralarni eritish, lizis va DNAni siljish kuchlari taʼsirida fragmentlash kabi namunalarni yuqori unumdorlikda tayyorlash jarayonlari uchun koʻp quduqli planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasining afzalliklari.

Koʻp quduqli planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi UIP400MTP namunalarni yuqori unumdorlikda tayyorlash, masalan, mitoxondrial diagnostika uchun koʻplab afzalliklarni taqdim etadi.

Biomarker diagnostikasida namunalarni yuqori unumdorlikda tayyorlash uchun UIP400MTP koʻp quduqli planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi.

mtDNAni ultratovush yordamida fragmentlash boʻyicha namunaviy koʻrsatmalar

Tayyorlash va ajratib olish:

C57BL/6 sichqonlari boʻyin umurtqalarini dislokatsiya qilish orqali oʻldirildi.
Jigarlar tezda ajratib olinib, muzdek sovuq steril PBSda yuvildi.

Mitoxondriyalarni ajratib olish:

Mitoxondriyalar 2-mL Dounce toʻqima maydalagichi va toʻqimadan mitoxondriyalarni ajratib olish toʻplami yordamida ajratib olindi.
700× g va 3 000× g da dastlabki sentrifugalash.
C buferi bilan ikkita qoʻshimcha yuvish bosqichini bajaring.

DNAni ajratib olish:

700× g da birinchi sentrifugalashdan olingan choʻkma yadro DNAsini (nDNA) ajratib olish uchun ishlatildi.
DNA sentrifugalash kolonkalari yordamida ajratib olindi.
Mitoxondrial DNA (mtDNA) ajratilgan mitoxondriyalardan olindi.
Yadro DNAsi (nDNA) tozalanmagan yadro ekstraktlaridan ajratib olindi; ikkala DNA turi ham sichqon jigari toʻqimasidan olindi.

DNAni fragmentlash:

DNA muz ustida 0,5-mm mikro-uchli sonotrod oʻrnatilgan 30-kHz/50-W ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi UP50H yordamida 14 μm da 2 × 30 soniya davomida fragmentlandi.

Fragmentlanishni vizualizatsiya qilish va miqdoriy baholash:

Ultratovush bilan ishlov berishdan keyingi fragmentlanish SYBR safe DNA boʻyogʻi bilan 1% agaroza gelida vizualizatsiya qilindi.
mtDNA va nDNAning nisbiy miqdori qPCR yordamida aniqlandi.

(cf. Mariero et al., 2019)

Namunalarni yuqori unumdorlikda tayyorlash uchun koʻp quduqli planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi UIP400MTP standart 96 quduqli, koʻp quduqli va mikrotitr planshetlarida koʻp sonli namunalarni tayyorlashni osonlashtiradi.
UIP400MTP yordamida namunalarni yuqori unumdorlikda tayyorlashning afzalliklari haqida batafsil oʻqing!

Videoda istalgan standart ko‘p quduqchali planshetdagi namunalarni yuqori intensivlikdagi ultratovush yordamida ishonchli tayyorlash imkonini beruvchi UIP400MTP tizimi ko‘rsatilgan. UIP400MTP odatda hujayra lizisi, DNK, RNK va xromatinni parchalash hamda oqsillarni ekstraksiya qilish uchun qo‘llaniladi.

Ultratovush bilan ishlov berish yordamida mitoxondriyalarni eng maqbul tarzda ajratib olish boʻyicha maslahatlar:

Haroratni nazorat qilish: Barcha bosqichlarni 0°C dan 4°C gacha boʻlgan harorat oraligʻida bajaring. Bu mitoxondriyalarning butunligi va funksional faolligini saqlash uchun juda muhim.
Samaradorlik va tezlik: Tez ishlang va mitoxondriyalarni faqat muayyan qoʻllanishingiz uchun zarur darajada tozalang. Haddan tashqari koʻp ishlov berish mitoxondrial tarkibiy qismlarning sezilarli yoʻqotilishiga olib kelishi mumkin.
Suspenziyalarni suyultirish: Ajratib olish jarayoni davomida hujayra va organella suspenziyalarining konsentratsiyasini past darajada saqlang. Bu tutib qolinish va agglutinatsiya xavfini minimallashtirishga yordam beradi va shu orqali ajratib olingan mitoxondriyalarning tozaligini yaxshilaydi.
Namuna hajmi: Bitta katta hajmli tayyorlash oʻrniga bir nechta kichik hajmli tayyorlashni tanlang. Bu yondashuv odatda yaxshiroq chiqim beradi, chunki koʻlamni oshirish ajratib olinishi mumkin boʻlgan mitoxondriyalar miqdorini mutanosib ravishda oshirmaydi. Koʻp quduqli planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi UIP400MTP mitoxondriyalarni ajratib olish uchun hujayralarning tez va ishonchli lizisini hamda mitoxondriyalardan oqsillarni ajratib olishni osonlashtiradi.

Ushbu koʻrsatmalar ultratovushli lizis va sentrifugalash yordamida ajratib olish jarayonini yanada samarali qilib, keyingi qoʻllanishlar uchun mos yuqori sifatli mitoxondrial preparatlar olishni taʼminlaydi.

Hielscher ultratovush bilan ishlov berish qurilmalari – Germaniyada yaratilgan sifat

Hielscher ultratovush bilan ishlov berish qurilmalari eng yuqori sifat va loyihalash standartlari bilan mashhur. Mustahkamlik va boshqarishning osonligi ultratovush bilan ishlov berish qurilmalarimizni sanoat obyektlariga muammosiz integratsiya qilish imkonini beradi. Hielscher ultratovush bilan ishlov berish qurilmalari ogʻir sharoitlar va yuqori talab qoʻyiladigan muhitlarda bemalol ishlaydi.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatiga ega kompaniya boʻlib, eng zamonaviy texnologiyalar va foydalanish qulayligini oʻzida mujassam etgan yuqori unumdor ultratovush bilan ishlov berish qurilmalariga alohida eʼtibor qaratadi. Albatta, Hielscher ultratovush bilan ishlov berish qurilmalari CE talablariga mos keladi hamda UL, CSA va RoHs talablarini bajaradi.

Hujayralarni yuzadan ajratish, hujayra lizisi, DNAni ajratib olish, DNAni fragmentlash, hujayralarni eritish va oqsillarni tozalash uchun UIP400MTP 96 quduqli planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi.

Mikrotitr va koʻp quduqli planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish uchun UIP400MTP 96 quduqli planshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi

Tegishli mavzular

Adabiyotlar / Manbalar

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.

Mitoxondriyalar va mitoxondrial diagnostika haqida tez-tez beriladigan savollar

Mitoxondriyalar nima?

Mitoxondriyalar koʻpchilik eukariot organizmlar hujayralarida uchraydigan, membrana bilan oʻralgan organellalardir. Ular hujayraning energiya markazlari sifatida tanilgan, chunki hujayra nafas olishi jarayonida adenozin trifosfat (ATP) shaklida energiya ishlab chiqaradi. Bundan tashqari, mitoxondriyalar oʻz DNAsiga ega va boshqa hujayraviy jarayonlarda, jumladan, hujayra sikli va hujayra oʻlimini boshqarishda muhim rol oʻynaydi.

mtDNA genomik DNAdan nimasi bilan farq qiladi?

Mitoxondrial DNA (mtDNA) genomik DNAdan (gDNA) bir necha muhim jihatlari bilan farq qiladi. MtDNA mitoxondriyalarda joylashgan, halqasimon shaklga ega va ona orqali irsiylanadi, gDNA esa hujayra yadrosida joylashgan, chiziqli shaklga ega va ikkala ota-onadan irsiylanadi. MtDNA ancha kichik boʻlib, faqat 37 ta genni kodlaydi, gDNA esa taxminan 20 000–25 000 ta genni oʻz ichiga oladi. MtDNA har bir hujayrada bir nechta nusxada mavjud, mutatsiya chastotasi yuqoriroq va asosan mitoxondriyalarning funksiyasida ishtirok etadigan oqsillarni kodlaydi. Aksincha, gDNA odatda diploid boʻladi, mutatsiya chastotasi pastroq va organizmning rivojlanishi hamda faoliyati uchun zarur boʻlgan juda koʻp turli genlarni kodlaydi. Bundan tashqari, mtDNA transkripsiyasi va translyatsiyasi mitoxondriyalar ichida sodir boʻladi, gDNA transkripsiyasi esa yadroda, translyatsiyasi esa sitoplazmada sodir boʻladi. Bu farqlar ularning oʻziga xos vazifalari va evolyutsion kelib chiqishini aks ettiradi.

Hujayrasiz ekstrakt nima?

Hujayrasiz ekstrakt lizis qilingan hujayralarning tarkibiy qismlarini, jumladan, oqsillar, nuklein kislotalar va boshqa hujayraviy komponentlarni oʻz ichiga olgan, ammo butun hujayra membranalari boʻlmagan eritmadir. Bu ekstrakt biokimyoviy va molekulyar biologiya tadqiqotlarida hujayraviy jarayonlarni in vitro oʻrganish uchun qoʻllanilib, tadqiqotchilarga reaksiyalar va mexanizmlarni tirik hujayralardan tashqarida tahlil qilish imkonini beradi.

Mitoxondrial diagnostikada PCR testlari qanday rol oʻynaydi?

PCR testlari mitoxondrial DNAda (mtDNA) mutatsiyalar, deletsiyalar yoki nusxalar sonidagi oʻzgarishlarni aniqlash imkonini berib, mitoxondrial diagnostikada juda muhim rol oʻynaydi. Ular mitoxondrial kasalliklar bilan bogʻliq patogen variantlarni aniqlash uchun mtDNAning muayyan hududlarini amplifikatsiya qilish imkonini beradi. Miqdoriy PCR (qPCR) va uzun fragmentli PCR kabi PCRga asoslangan usullar mtDNAning butunligi, geteroplazmiya darajalari va mtDNA miqdorining kamayishini baholash uchun ham qoʻllanilib, mitoxondriyalarning funksiyasi va kasalliklar haqida muhim maʼlumot beradi.
UIP400MTP mikroplanshetlarga ultratovush bilan ishlov berish qurilmasi PCR testlari va tahlillarini qanday osonlashtirishini bilib oling!

Differensial sentrifugalash nima?

Differensial sentrifugalash hujayralarni fraksiyalarga ajratish va mitoxondriyalarni ajratib olish uchun keng qoʻllaniladigan usuldir. Bu usul hujayraviy tuzilmalarni ularning zichligi va shakliga bogʻliq boʻlgan sedimentatsiya koeffitsiyenti asosida ajratadi. Jarayon muayyan zichlikdagi buferlangan tuz eritmalaridagi namunalarga turli darajadagi markazdan qochma kuchni qoʻllashni oʻz ichiga oladi. Sedimentatsiya koeffitsiyentlari oʻxshash boʻlgan tuzilmalar yigʻish probirkasining tubiga bir vaqtda choʻkadi, bu esa ularni yigʻib olish imkonini beradi.

Mitoxondriyalarni ajratib olish uchun differensial sentrifugalash qanday qoʻllaniladi?

Differensial sentrifugalash tadqiqotchilarga mitoxondrial fraksiyalarni boshqa hujayraviy komponentlardan samarali ajratish imkonini beradi. Mitoxondriyalarni ajratib olish bir necha sentrifugalash bosqichini va keyinchalik ajratilgan materialni yigʻib olishni oʻz ichiga oladi.
Dastlabki sentrifugalash: Yirik hujayra qoldiqlari va yadrolarni choʻktirish uchun past markazdan qochma kuchni qoʻllang.
Keyingi sentrifugalashlar: Mitoxondriyalar bilan boyitilgan fraksiyalarni choʻktirish uchun markazdan qochma kuchni bosqichma-bosqich oshiring. Har bir sentrifugalash bosqichi sedimentatsiya koeffitsiyentlari tobora yuqoriroq boʻlgan tuzilmalarni olib tashlaydi.
Fraksiyani yigʻib olish: Har bir sentrifugalashdan soʻng choʻkma yigʻib olinadi, keyingi fraksiyani ajratish uchun esa choʻkma ustidagi suyuqlikka yuqoriroq g-kuchlari qoʻllaniladi. Bu mitoxondriyalarning kerakli tozalik darajasiga erishilguncha takrorlanadi.