Mitoxondriyal diagnostika uchun yuqori samarali namuna tayyorlash
Tadqiqot va klinikalarda mitoxondriyal diagnostika ketma-ketlik, PCR va biokimyoviy tahlillar kabi turli usullar yordamida amalga oshiriladi. Ushbu usullar DNK mutatsiyalarini aniqlash va mitoxondrial funktsiyani o'lchash uchun ishlatiladi. Sekvensiya genetik mutatsiyalarni aniqlashga yordam beradi, PCR esa o'ziga xos DNK ketma-ketligini aniqlashi mumkin. Biokimyoviy tahlillar mitoxondriyal oqsillar va fermentlarning funksionalligini baholaydi.
Mitoxondriyal kasalliklar diagnostikasi, ayniqsa, ushbu kasalliklarning aniq klinik o'zgaruvchanligi, shuningdek, ikki xil irsiy genomlar: mitoxondriyal DNK (mtDNK) va yadro genomlari o'rtasidagi murakkab o'zaro ta'sir tufayli qiyin.
Sonication yordamida DNKni ajratib olish va parchalanish
Mushak to'qimasidan DNK ekstraktsiyasi, ayniqsa, mtDNKdagi to'qimalarga xos o'zgarishlarga shubha qilinganida foydalidir. Ushbu o'zgarishlar surunkali progressiv tashqi oftalmoplegiya (CPEO) da mtDNKning yo'q qilinishini, mitoxondrial miyopatiyalarda mtDNKning nuqta mutatsiyalarini yoki Alpers sindromida mtDNKning kamayishini o'z ichiga olishi mumkin. Keyin mushak to'qimasidan olingan DNK turli genetik testlar uchun ishlatilishi mumkin, masalan, Southern blot va uzoq masofali o'chirish uchun PCR, tükenme uchun real vaqtda PCR yoki nuqta mutatsiyalari uchun ketma-ketlik.
Kuchli ultratovush to'lqinlaridan foydalangan holda sonikatsiya mitoxondriyal diagnostikada bir nechta ilovalar uchun qo'llaniladi. U mitoxondriya va DNK kabi hujayra ichidagi tarkibni ajratib olish, ketma-ketlik uchun mtDNK va nDNK kabi DNKni kesish va namunalarni bir hil holga keltirish uchun hujayralarni parchalash uchun ishlatiladi.
UIP400MTP plastinka sonikatori yuqori o'tkazuvchanlik namunasini tayyorlash uchun ko'p quduqli va 96 quduqli plitalardagi namunalarni bir xilda sonikatsiya qiladi
Mitoxondriyani hujayralar va to'qimalardan qanday ajratish mumkin
Mitoxondriyal izolyatsiya ikkita muhim bosqichni o'z ichiga oladi: ularning tarkibini chiqarish uchun hujayralarni buzish va mitoxondriyal fraktsiyalarni ajratish va tiklash uchun differentsial santrifüjdan foydalanish.
sonikatsiya
Hielscher sonikatorlari standart lizis tamponlari va to'plamlari bilan mos keladi, bu ularni mitoxondriyalarni izolyatsiya qilish uchun mos qiladi. Sonication ikkita asosiy maqsadga xizmat qiladi:
- Hujayra lizisi: Ultrasonik to'lqinlar hujayra membranalarini buzadi, hujayra ichidagi tarkibni chiqaradi.
- Mitoxondriyal buzilish: Keyingi bosqichda sonikatsiya mitoxondriyal oqsillarni yoki mitoxondriyal DNKni chiqarish uchun mitoxondriyani ochishi mumkin.
- mtDNKning parchalanishi: Sonication - bu mitoxondriyal DNKni ketma-ketlashtirish uchun kesishning ishonchli usuli.
Ko'p quduqli plastinka sonikatori UIP400MTP mitoxondriyal namunalarning yuqori o'tkazuvchanlik namunalarini tayyorlashga imkon beradi. Differensial santrifüjlash bilan birgalikda sonikatsiya mitoxondriyal izolyatsiya samaradorligini oshiradi, bu esa turli xil quyi oqim ilovalari uchun mos bo'lgan buzilmagan mitoxondriyalarning yuqori hosildorligini ta'minlaydi.
Hielscher UIP400MTP ko'p quduqli plastinka sonikatori har qanday standart plastinka bilan ishlaydi
Ko'p quduqli plastinka sonikatori UIP400MTP yuqori o'tkazuvchanlik namunalarini tayyorlash uchun ko'plab afzalliklarni taklif etadi, masalan, mitoxondriyal diagnostikada.
Biomarker diagnostikasida yuqori o'tkazuvchanlik namunalarini tayyorlash uchun UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator.
Ultrasonik mtDNK fragmentatsiyasi bo'yicha namunali ko'rsatmalar
Tayyorlash va olish:
- C57BL / 6 sichqonlari bachadon bo'yni dislokatsiyasi bilan o'ldirilgan.
- Jigarlar tezda ekstraksiya qilindi va muzli steril PBSda yuvildi.
Mitoxondriya izolyatsiyasi:
- Mitoxondriyalar 2 ml Dounce to'qima maydalagich va to'qimalar uchun mitoxondriya izolyatsiyasi to'plami yordamida ajratilgan.
- 700× g va 3000× g da dastlabki sentrifugalash.
- Bufer C bilan ikkita qo'shimcha yuvish qadamini bajaring.
DNK izolyatsiyasi:
- 700 × g da birinchi santrifüjdan olingan granula yadroviy DNKni (nDNK) ajratish uchun ishlatilgan.
- DNK spin ustunlari yordamida ajratilgan.
- Mitoxondriyal DNK (mtDNK) izolyatsiya qilingan mitoxondriyadan olingan.
- Yadro DNKsi (nDNK) sichqonchaning jigar to'qimasidan xom yadro ekstraktidan olingan.
DNKning parchalanishi:
- DNK 2 × 30 soniya davomida 14 mkm da 0,5 mm mikro uchli sonotrod bilan 30 kHz/50 Vt ultratovushli sonikator UP50H yordamida muz ustida parchalangan.
Fragmentatsiyani vizuallashtirish va miqdorni aniqlash:
- Ultrasonifikatsiyadan so'ng parchalanish SYBR xavfsiz DNK bo'yog'i bilan 1% agaroz jelida tasvirlangan.
- MtDNK va nDNKning nisbiy ko'pligi qPCR tomonidan aniqlandi.
(qarang. Mariero va boshqalar, 2019)
Yuqori mahsuldorlikka ega bo'lgan namunani tayyorlash uchun ko'p quduqli plastinka sonikatori UIP400MTP standart 96 quduqli, ko'p quduqli va mikrotitrli plitalarda katta namunalar sonini tayyorlashni osonlashtiradi.
UIP400MTP yordamida yuqori samarali namunani tayyorlashning afzalliklari haqida ko'proq o'qing!
Sonication yordamida mitoxondriyani optimal izolyatsiya qilish bo'yicha maslahatlar:
- Harorat nazorati: Barcha bosqichlarni 0 ° C dan 4 ° C gacha bo'lgan harorat oralig'ida bajaring. Bu mitoxondriyaning yaxlitligi va funksionalligini saqlab qolish uchun juda muhimdir.
- Tezlik va samaradorlik: Tez ishlang va mitoxondriyalarni faqat sizning maxsus dasturingiz uchun zarur bo'lgan darajada tozalang. Haddan tashqari manipulyatsiya mitoxondrial tarkibning sezilarli yo'qotilishiga olib kelishi mumkin.
- Suspenziyalarni suyultirish: Izolyatsiya jarayonida hujayra va organoid suspenziyalarining past konsentratsiyasini saqlang. Bu tuzoqqa tushish va aglutinatsiya xavfini kamaytirishga yordam beradi va shu bilan izolyatsiya qilingan mitoxondriyalarning tozaligini yaxshilaydi.
- Namuna hajmi: Bitta katta emas, balki bir nechta kichik o'lchamdagi preparatlarni tanlang. Ushbu yondashuv odatda yaxshi hosil beradi, chunki masshtabni oshirish tiklanadigan mitoxondriyalar miqdorini mutanosib ravishda oshirmaydi. Ko'p quduqli plastinka sonikatori UIP400MTP mitoxondriyalarni izolyatsiya qilish uchun hujayraning tez va ishonchli lizisini, shuningdek, mitoxondriyadan oqsillarni ajratib olishni osonlashtiradi.
Ushbu ko'rsatmalar ultratovushli liziz va santrifüjlash yordamida izolyatsiyalash jarayonini yanada samaraliroq qiladi va quyi oqim uchun mos keladigan yuqori sifatli mitoxondriyal preparatlarni beradi.
Hielscher sonikatorlari – Germaniyada ishlab chiqarilgan sifat
Hielscher ultrasonikatorlari eng yuqori sifat va dizayn standartlari bilan mashhur. Mustahkamlik va qulay foydalanish ultratovush qurilmalarimizni sanoat ob'ektlariga silliq integratsiya qilish imkonini beradi. Qo'pol sharoitlar va talabchan muhit Hielscher ultrasonikatorlari tomonidan osonlik bilan hal qilinadi.
Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatiga ega kompaniya bo'lib, eng zamonaviy texnologiya va foydalanuvchilarga qulaylik bilan ajralib turadigan yuqori samarali ultratovush apparatlariga alohida e'tibor beradi. Albatta, Hielscher ultrasonikatorlari Idoralar talablariga javob beradi va UL, CSA va RoHs talablariga javob beradi.
96-quduqli plastinali sonikator UIP400MTP mikrotitr va ko'p quduqli plitalarning sonikatsiyasi uchun
Adabiyot / Adabiyotlar
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mitoxondriya va mitoxondrial diagnostika haqida tez-tez so'raladigan savollar
Mitoxondriya nima?
Mitoxondriyalar ko'pchilik eukaryotik organizmlarning hujayralarida joylashgan membrana bilan bog'langan organellalardir. Ular hujayraning quvvat manbai sifatida tanilgan, chunki ular hujayrali nafas olish jarayonida adenozin trifosfat (ATP) shaklida energiya ishlab chiqaradilar. Bundan tashqari, mitoxondriyalar o'zlarining DNKlariga ega va boshqa hujayra jarayonlarida, jumladan hujayra siklini va hujayra o'limini tartibga solishda muhim rol o'ynaydi.
MtDNK ni genomik DNKdan nimasi bilan farq qiladi?
Mitoxondrial DNK (mtDNK) genomik DNKdan (gDNK) bir necha asosiy jihatlari bilan farq qiladi. MtDNK mitoxondriyada joylashgan bo'lib, dumaloq shaklga ega va ona tomonidan meros bo'lib o'tadi, gDNK esa hujayra yadrosida joylashgan bo'lib, chiziqli va ikkala ota-onadan meros bo'lib o'tadi. MtDNK ancha kichik bo'lib, faqat 37 genni kodlaydi, gDNK esa 20-25 000 ga yaqin genlarni o'z ichiga oladi. MtDNK har bir hujayrada bir nechta nusxada mavjud, yuqori mutatsiya tezligiga ega va birinchi navbatda mitoxondrial funktsiyada ishtirok etadigan oqsillarni kodlaydi. Bundan farqli o'laroq, gDNK odatda diploid bo'lib, kamroq mutatsiya tezligiga ega va organizmning rivojlanishi va faoliyati uchun zarur bo'lgan juda ko'p genlarni kodlaydi. Bundan tashqari, mtDNK transkripsiyasi va tarjimasi mitoxondriya ichida sodir bo'ladi, gDNK transkripsiyasi esa yadroda, translatsiya esa sitoplazmada sodir bo'ladi. Bu farqlar ularning alohida rollari va evolyutsion kelib chiqishini aks ettiradi.
Hujayrasiz ekstrakt nima?
Hujayrasiz ekstrakt - bu parchalangan hujayralar tarkibini, shu jumladan oqsillar, nuklein kislotalar va boshqa hujayra komponentlarini o'z ichiga olgan, ammo buzilmagan hujayra membranalari bo'lmagan eritma. Ushbu ekstrakt biokimyoviy va molekulyar biologiya tadqiqotlarida hujayra jarayonlarini in vitro o'rganish uchun ishlatiladi, bu tadqiqotchilarga tirik hujayralar tashqarisidagi reaktsiyalar va mexanizmlarni tahlil qilish imkonini beradi.
Mitoxondrial diagnostikada PCR testlari qanday rol o'ynaydi?
PCR testlari mitoxondriyal DNKda (mtDNK) mutatsiyalar, o'chirishlar yoki nusxa ko'chirish sonining o'zgarishini aniqlashga imkon berish orqali mitoxondriyal diagnostikada muhim rol o'ynaydi. Ular mitoxondriyal kasalliklar bilan bog'liq patogen variantlarni aniqlash uchun o'ziga xos mtDNK hududlarini kuchaytirishga imkon beradi. Kantitativ PCR (qPCR) va uzoq muddatli PCR kabi PCRga asoslangan usullar, shuningdek, mtDNKning yaxlitligini, geteroplazma darajasini va mtDNKning kamayishini baholash uchun ishlatiladi, bu mitoxondriyal funktsiya va kasallik haqida muhim tushunchalarni beradi.
UIP400MTP Microplate Sonicator PCR testlari va tahlillarini qanday osonlashtirishini bilib oling!
Differensial sentrifugalash nima?
Differensial santrifüjlash hujayralarni fraksiyalash va mitoxondriyal izolyatsiyalash uchun keng qo'llaniladigan usuldir. Bu usul uyali tuzilmalarni ularning zichligi va shakliga bog'liq bo'lgan cho'kindi koeffitsienti asosida ajratadi. Jarayon o'ziga xos zichlikka ega buferlangan tuz eritmalaridagi namunalarga turli darajadagi markazdan qochma kuchni qo'llashni o'z ichiga oladi. Xuddi shunday sedimentatsiya koeffitsientlariga ega bo'lgan tuzilmalar bir vaqtning o'zida yig'ish trubasining pastki qismida joylashadi va ularni qayta tiklashga imkon beradi.
Mitoxondriyalarni izolyatsiya qilish uchun differentsial santrifüj qanday qo'llaniladi?
Differensial santrifüj tadqiqotchilarga mitoxondriyal fraktsiyalarni boshqa hujayra komponentlaridan samarali ajratish imkonini beradi. Mitoxondriyalarni izolyatsiya qilish bir necha santrifüj bosqichlarini va keyinchalik izolyatsiyani tiklashni o'z ichiga oladi.
Dastlabki santrifüjlash: Katta hujayrali qoldiqlarni va yadrolarni cho'ktirish uchun past markazdan qochma kuchni qo'llang.
Keyingi santrifüjlar: Mitoxondriyalar bilan boyitilgan pellet fraksiyalariga markazdan qochma kuchni bosqichma-bosqich oshiring. Har bir santrifüj bosqichi cho'kindilanish koeffitsienti tobora yuqori bo'lgan tuzilmalarni olib tashlaydi.
Fraksiyani tiklash: Har bir santrifüjdan so'ng pellet yig'iladi va supernatant keyingi fraktsiyani ajratish uchun yuqori g-kuchlariga ta'sir qiladi. Bu mitoxondriyaning kerakli tozaligiga erishilgunga qadar takrorlanadi.