Produktion av kitin och kitosan från svampar

Ultraljudsbehandling är en mycket effektiv metod för att frigöra kitin och kitosan från svampkällor, såsom fruktkroppar. Kitin och kitosan måste depolymeriseras och deacetyleras i efterföljande bearbetningssteg för att erhålla en högkvalitativ biopolymer. Ultraljudsassisterad depolymerisation och deacetylering är en mycket effektiv, enkel och snabb teknik som ger högkvalitativa kitosaner med hög molekylvikt och överlägsen biotillgänglighet.

Kitin och kitosan från svampar genom ultraljudsbehandling

Ätliga svampar och medicinska svampar såsom Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi eller reishi), Inonotus obliquus (sprängticka), Agaricus bisporus (champinjoner), Hericium erinaceus (igelkottstaggsvamp), Cordyceps sinensis (kinesisk larvsvamp), Grifola frondosa (korallticka), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, sidenticka) och många andra svamparter används i stor utsträckning som livsmedel och för extraktion av bioaktiva föreningar. Dessa svampar samt restprodukter från bearbetningen (svampavfall) kan användas för att producera kitosan. Ultraljudsbehandling främjar inte bara frigörandet av kitin från svamparnas cellväggsstruktur, utan driver också omvandlingen av kitin till värdefullt kitosan genom ultraljudsassisterad depolymerisation och deacetylering.

Denna video demonstrerar högeffektiv extraktion av igelkottstaggsvamp med ultraljudshomogenisatorn Hielscher UP200Ht. Ultraljudsextraktion är den perfekta tekniken för att framställa högkvalitativa fullspektrumextrakt som innehåller polysackarider såsom betaglukaner samt hericenoner och erinaciner.

 

Intensiv ultraljudsbehandling med ett ultraljudssystem av sondtyp är en teknik som används för att främja depolymerisation och deacetylering av kitin, vilket leder till bildning av kitosan. Kitin är en naturligt förekommande polysackarid som finns i kräftdjurs och insekters exoskelett samt i cellväggarna hos vissa svampar. Kitosan framställs från kitin genom att acetylgrupperna avlägsnas från kitinmolekylen.

Ultraljudsförfarande för omvandling av svampkitin till kitosan

När intensiv ultraljudsbehandling används för att producera kitosan från kitin behandlas en kitinsuspension med högintensiva, lågfrekventa ultraljudsvågor, vanligen i intervallet 20 kHz till 30 kHz. Processen genererar intensiv akustisk kavitation, vilket innebär att mikroskopiska vakuumbubblor bildas, växer och kollapsar i vätskan. Kavitation genererar lokalt extremt höga skjuvkrafter, höga temperaturer (upp till flera tusen grader Celsius) och höga tryck (upp till flera hundra atmosfärer) i vätskan som omger kavitationsbubblorna. Dessa extrema förhållanden bidrar till nedbrytningen av kitinpolymeren och den efterföljande deacetyleringen.
 

 

Ultraljudsbaserad depolymerisation av kitin

Depolymerisationen av kitin sker genom de kombinerade effekterna av mekaniska krafter, såsom mikroströmning och vätskestrålar, samt genom ultraljudsinitierade kemiska reaktioner som induceras av fria radikaler och andra reaktiva species som bildas under kavitation. Högtrycksvågorna som genereras under kavitation utsätter kitinkedjorna för skjuvspänning, vilket leder till att polymeren klyvs i mindre fragment.

Ultraljudsbaserad deacetylering av kitin

Utöver depolymerisering främjar intensiv ultraljudsbehandling även deacetylering av kitin. Deacetylering innebär att acetylgrupper avlägsnas från kitinmolekylen, vilket leder till att kitosan bildas. Intensiv ultraljudsenergi, särskilt de höga temperaturer och tryck som uppstår under kavitation, påskyndar deacetyleringsreaktionen. De reaktiva förhållanden som kavitationen skapar bidrar till att bryta acetylbindningarna i kitin, vilket resulterar i att ättiksyra frigörs och kitin omvandlas till kitosan.
Sammantaget förbättrar intensiv ultraljudsbehandling både depolymeriserings- och deacetyleringsprocesserna genom att tillföra den mekaniska och kemiska energi som krävs för att bryta ned kitinpolymeren och underlätta omvandlingen till kitosan. Denna teknik erbjuder en snabb och effektiv metod för framställning av kitosan från kitin, med många tillämpningar inom olika branscher, bland annat läkemedel, jordbruk och biomedicinsk teknik.

Industriell framställning av kitosan från svamp med högeffektsultraljud

Kommersiell framställning av kitin och kitosan bygger huvudsakligen på avfall från marina näringar (dvs. fiske, skaldjursfångst osv.). Olika råvarukällor ger olika kvaliteter av kitin och kitosan, vilket medför variationer i produktion och kvalitet på grund av säsongsvariationer i fisket. Dessutom uppges kitosan från svamp ha överlägsna egenskaper, såsom homogen polymerlängd och högre löslighet, jämfört med kitosan från marina källor. (jfr Ghormade et al., 2017) För att kunna tillhandahålla kitosan av jämn kvalitet har extraktion av kitin från svamparter blivit ett stabilt produktionsalternativ. Framställning av kitin och kitosan från svamp kan genomföras enkelt och tillförlitligt med teknik för ultraljudsextraktion och deacetylering. Intensiv ultraljudsbehandling bryter sönder cellstrukturer så att kitin frigörs och främjar massöverföringen i vattenbaserade lösningsmedel för överlägset kitinutbyte och överlägsen extraktionseffektivitet. Efterföljande ultraljudsdeacetylering omvandlar kitinet till värdefullt kitosan. Både ultraljudsextraktion av kitin och deacetylering till kitosan kan skalas upp linjärt till valfri kommersiell produktionsnivå.

Forskningsresultat om ultraljudsdeacetylering av kitin och kitosan

Zhu et al. (2018) drar i sin studie slutsatsen att ultraljudsdeacetylering har visat sig vara ett avgörande genombrott som omvandlar β-kitin till kitosan med en deacetyleringsgrad på 83–94% vid lägre reaktionstemperaturer. Bilden till vänster visar en SEM-bild av ultraljudsdeacetylerat kitosan (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (bild och studie: © Zhu et al., 2018)
I deras protokoll bereddes en NaOH-lösning (20 w/v %) genom att NaOH-flingor löstes i avjoniserat vatten. Alkalilösningen tillsattes sedan till GLSP-sediment (0,5 g) i ett centrifugrör vid ett förhållande mellan fast fas och vätska på 1:20 (g: mL). Kitosan tillsattes till NaCl (40 mL, 0,2 M) och ättiksyra (0,1 M) med ett volymförhållande mellan lösningarna på 1:1. Suspensionen utsattes sedan för ultraljud vid en mild temperatur på 25°C i 60 min med en ultraljudsapparat av sondtyp (250W, 20kHz). (jfr Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) fann att nedbrytningshastigheten för kitosanlösningar sällan påverkas av koncentrationerna av den syra som används för att lösa upp polymeren och till stor del beror på temperaturen, ultraljudsvågornas intensitet och jonstyrkan hos de medier som används för att lösa upp polymeren. (jfr Pandit et al., 2021)
 
I en annan studie använde Zhu et al. (2019) sporpulver från Ganoderma lucidum som svampråvara och undersökte ultraljudsassisterad deacetylering samt effekterna av processparametrar såsom ultraljudsbehandlingstid, förhållandet mellan fast fas och vätska, NaOH-koncentration och bestrålningseffekt på kitosanets deacetyleringsgrad (DD). Det högsta DD-värdet erhölls vid följande ultraljudsparametrar: 20 min ultraljudsbehandling vid 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Ytmorfologin, de kemiska grupperna, den termiska stabiliteten och kristalliniteten hos det kitosan som erhölls med ultraljud undersöktes med SEM, FTIR, TG och XRD. Forskargruppen rapporterar en signifikant ökning av deacetyleringsgraden (DD), den dynamiska viskositeten ([η]) och molekylvikten (Mv¯) hos det ultraljudsframställda kitosanet. Resultaten framhävde tekniken för ultraljudsdeacetylering av svamp som en mycket effektiv metod för framställning av kitosan som är lämpligt för biomedicinska tillämpningar. (jfr Zhu et al., 2019)

Överlägsen kitosankvalitet med ultraljudsdepolymerisering och ultraljudsdeacetylering

Ultraljudsdrivna processer för extraktion och depolymerisering av kitin / kitosan kan styras exakt, och ultraljudsprocessens parametrar kan anpassas till råvarorna och den önskade slutproduktkvaliteten (t.ex. molekylvikt och deacetyleringsgrad). Detta gör det möjligt att anpassa ultraljudsprocessen till yttre faktorer och ställa in optimala parametrar för överlägsna resultat och överlägsen effektivitet.
Ultraljudsdeacetylerat kitosan uppvisar utmärkt biotillgänglighet och biokompatibilitet. När ultraljudsframställda kitosanbiopolymerer jämförs med termiskt framställt kitosan med avseende på biomedicinska egenskaper uppvisar det ultraljudsframställda kitosanet signifikant förbättrad viabilitet hos fibroblaster (L929-celler) och ökad antibakteriell aktivitet mot både Escherichia coli (E. coli) och Staphylococcus aureus (S. aureus).
(jfr Zhu et al., 2018)
 

Högpresterande ultraljudsutrustning för bearbetning av kitin och kitosan

Fragmentering av kitin och deacetylering av kitin till kitosan kräver kraftfull och tillförlitlig ultraljudsutrustning som kan leverera höga amplituder, erbjuder exakt kontroll över processparametrarna och kan användas dygnet runt under hög belastning och i krävande miljöer. Produktsortimentet från Hielscher Ultrasonics uppfyller dessa krav på ett tillförlitligt sätt. Utöver enastående ultraljudsprestanda har Hielschers ultraljudsapparater hög energieffektivitet, vilket är en betydande ekonomisk fördel – särskilt vid kommersiell produktion i stor skala.
Hielschers ultraljudsapparater är högpresterande system som kan utrustas med tillbehör som sonotroder, amplitudförstärkare, reaktorer eller flödesceller för att optimalt uppfylla dina processbehov.
 Med digital färgskärm, möjlighet att förinställa ultraljudsbehandlingar, automatisk datalagring på ett integrerat SD-kort, fjärrstyrning via webbläsare och många fler funktioner säkerställer Hielschers ultraljudsapparater högsta processkontroll och användarvänlighet. I kombination med robusthet och förmåga att tåla hög belastning är Hielschers ultraljudssystem din tillförlitliga arbetshäst i produktionen. 
Fragmentering och deacetylering av kitin kräver kraftfullt ultraljud för att uppnå den avsedda omvandlingen och en slutprodukt av kitosan med hög kvalitet. Särskilt vid fragmentering av kitinflingor och vid depolymeriserings- / deacetyleringsstegen är höga amplituder och förhöjda tryck avgörande. Hielscher Ultrasonics industriella ultraljudsprocessorer levererar enkelt mycket höga amplituder. Amplituder på upp till 200µm kan användas kontinuerligt vid drift dygnet runt. För ännu högre amplituder finns specialanpassade ultraljudssonotroder. Effektkapaciteten hos Hielschers ultraljudssystem möjliggör effektiv och snabb depolymerisering och deacetylering i en säker och användarvänlig process.
 

Tabellen nedan ger en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater:

---

---

Synergistisk kitinbehandling förbättrad med ultraljud

För att övervinna nackdelarna (dvs. låg effektivitet, höga energikostnader, lång bearbetningstid och giftiga lösningsmedel) med traditionell kemisk och enzymatisk deacetylering av kitin har högintensivt ultraljud integrerats i bearbetningen av kitin och kitosan. Högintensiv ultraljudsbehandling och de resulterande effekterna av akustisk kavitation leder till snabb klyvning av polymerkedjor och minskar polydispersiteten, vilket främjar syntesen av kitosan. Dessutom intensifierar ultraljudets skjuvkrafter massöverföringen i lösningen så att kemiska, hydrolytiska eller enzymatiska reaktioner förstärks. Ultraljudsbehandling av kitin kan kombineras med redan befintliga tekniker för kitinbearbetning, såsom kemiska metoder, hydrolys eller enzymatiska förfaranden.

Ultraljudsassisterad kemisk deacetylering och depolymerisering

Eftersom kitin är en icke-reaktiv och olöslig biopolymer måste det genomgå processtegen demineralisering, deproteinisering och depolymerisering / deacetylering för att lösligt och bioåtkomligt kitosan ska erhållas. Dessa processteg omfattar behandlingar med starka syror som HCl och starka baser som NaOH och KOH. Eftersom dessa konventionella processteg är ineffektiva, långsamma och kräver stora mängder energi förbättrar processintensifiering med ultraljudsbehandling kitosanproduktionen avsevärt. Användning av effektultraljud ökar utbytet och kvaliteten på kitosan, förkortar processen från dagar till några timmar, möjliggör mildare lösningsmedel och gör hela processen mer energieffektiv.

Deproteinisering av kitin förbättrad med ultraljud

Vallejo-Dominguez et al. (2021) fann i sin undersökning av deproteinisering av kitin att ”användning av ultraljud för framställning av biopolymerer minskade såväl proteinhalten som kitinets partikelstorlek. Kitosan med hög deacetyleringsgrad och medelhög molekylvikt framställdes med hjälp av ultraljud.”

Ultraljudshydrolys för depolymerisering av kitin

Vid kemisk hydrolys används antingen syror eller alkalier för att deacetylera kitin, men alkalisk deacetylering (t.ex. med natriumhydroxid NaOH) används i större utsträckning. Syrahydrolys är en alternativ metod till traditionell kemisk deacetylering, där organiska syralösningar används för att depolymerisera kitin och kitosan. Syrahydrolys används främst när molekylvikten hos kitin och kitosan måste vara homogen. Denna konventionella hydrolysprocess är känd för att vara långsam samt energi- och kostnadskrävande. Kraven på starka syror, höga temperaturer och höga tryck är faktorer som gör den hydrolytiska kitosanprocessen mycket dyr och tidskrävande. De syror som används kräver efterföljande processer såsom neutralisering och avsaltning.
Genom att integrera högeffektsultraljud i hydrolysprocessen kan temperatur- och tryckkraven för hydrolytisk klyvning av kitin och kitosan sänkas avsevärt. Dessutom möjliggör ultraljudsbehandling lägre syrakoncentrationer eller användning av mildare syror. Detta gör processen mer hållbar, effektiv, kostnadseffektiv och miljövänlig.

Ultraljudsassisterad kemisk deacetylering

Kemisk sönderdelning och deacetylering av kitin och kitosan åstadkoms främst genom att behandla kitin eller kitosan med mineralsyror (t.ex. saltsyra HCl), natriumnitrit (NaNO₂) eller väteperoxid (H₂O₂). Ultraljud ökar deacetyleringshastigheten och förkortar därmed den reaktionstid som krävs för att uppnå den önskade deacetyleringsgraden. Detta innebär att ultraljudsbehandling minskar den erforderliga bearbetningstiden från 12–24 timmar till några få timmar. Dessutom möjliggör ultraljudsbehandling avsevärt lägre kemikaliekoncentrationer, till exempel 40% (w/w) natriumhydroxid vid ultraljudsbehandling, medan 65% (w/w) krävs utan användning av ultraljud.

Ultraljudsenzymatisk deacetylering

Även om enzymatisk deacetylering är en mild och miljövänlig bearbetningsmetod är den oekonomisk med avseende på effektivitet och kostnader. På grund av den komplexa, arbetskrävande och dyra efterföljande isoleringen och reningen av enzymer från slutprodukten används enzymatisk deacetylering av kitin inte i kommersiell produktion, utan endast i vetenskapliga forskningslaboratorier.
Förbehandling med ultraljud före enzymatisk deacetylering fragmenterar kitinmolekylerna, vilket ökar ytarean och gör en större yta tillgänglig för enzymerna. Högpresterande ultraljudsbehandling bidrar till att förbättra enzymatisk deacetylering och gör processen mer ekonomisk.