Vysokokapacitná príprava vzoriek na mitochondriálnu diagnostiku
Mitochondriálna diagnostika vo výskume a klinickej praxi sa vykonáva pomocou rôznych techník, ako sú sekvenovanie, PCR a biochemické analýzy. Tieto metódy sa používajú na identifikáciu mutácií DNA a meranie funkcie mitochondrií. Sekvenovanie pomáha zisťovať genetické mutácie, zatiaľ čo PCR umožňuje kvantifikovať špecifické sekvencie DNA. Biochemické analýzy hodnotia funkčnosť mitochondriálnych proteínov a enzýmov.
Diagnostika mitochondriálnych ochorení je obzvlášť náročná pre výraznú klinickú variabilitu týchto ochorení, ako aj pre komplexnú interakciu medzi dvoma genómami s odlišným spôsobom dedičnosti: mitochondriálnou DNA (mtDNA) a jadrovým genómom.
Extrakcia a fragmentácia DNA pomocou sonikácie
Extrakcia DNA zo svalového tkaniva je obzvlášť užitočná pri podozrení na tkanivovo špecifické zmeny mtDNA. Tieto zmeny môžu zahŕňať delécie mtDNA pri chronickej progresívnej externej oftalmoplégii (CPEO), bodové mutácie mtDNA pri mitochondriálnych myopatiách alebo depléciu mtDNA pri Alpersovom syndróme. DNA extrahovaná zo svalového tkaniva sa potom môže použiť na rôzne genetické testy, napríklad Southern blot a PCR dlhých úsekov na zisťovanie delécií, PCR v reálnom čase na zisťovanie deplécie alebo sekvenovanie na zisťovanie bodových mutácií.
Sonikácia využívajúca intenzívne ultrazvukové vlny sa používa pri viacerých aplikáciách v mitochondriálnej diagnostike. Používa sa na lýzu buniek s cieľom extrahovať vnútrobunkový obsah, ako sú mitochondrie a DNA, na fragmentáciu DNA, napríklad mtDNA a nDNA, šmykovými silami na účely sekvenovania a na homogenizáciu vzoriek.
Sonikátor doštičiek UIP400MTP na vysokokapacitnú prípravu vzoriek rovnomerne sonikuje vzorky vo viacjamkových a 96-jamkových doštičkách
Ako izolovať mitochondrie z buniek a tkanív
Izolácia mitochondrií zahŕňa dva základné kroky: narušenie buniek na uvoľnenie ich obsahu a použitie diferenciálnej centrifugácie na oddelenie a získanie mitochondriálnych frakcií.
Sonikácia
Sonikátory Hielscher sú kompatibilné so štandardnými lyzačnými puframi a súpravami, vďaka čomu sú vhodné na izoláciu mitochondrií. Sonikácia slúži na dva hlavné účely:
- Lýza buniek: Ultrazvukové vlny narúšajú bunkové membrány a uvoľňujú vnútrobunkový obsah.
- Narušenie mitochondrií: Sonikácia v následnom kroku môže narušiť mitochondrie a uvoľniť mitochondriálne proteíny alebo mitochondriálnu DNA.
- Fragmentácia mtDNA: Sonikácia je spoľahlivá technika fragmentácie mitochondriálnej DNA šmykovými silami na účely sekvenovania.
Sonikátor viacjamkových doštičiek UIP400MTP umožňuje vysokokapacitnú prípravu mitochondriálnych vzoriek. V spojení s diferenciálnou centrifugáciou sonikácia zvyšuje účinnosť izolácie mitochondrií a zabezpečuje vysoké výťažky neporušených mitochondrií vhodných na rôzne následné aplikácie.
Sonikátor viacjamkových doštičiek Hielscher UIP400MTP pracuje s akoukoľvek štandardnou doštičkou
Sonikátor viacjamkových doštičiek UIP400MTP ponúka množstvo výhod pri vysokokapacitnej príprave vzoriek, napr. v mitochondriálnej diagnostike.
Sonikátor viacjamkových doštičiek UIP400MTP na vysokokapacitnú prípravu vzoriek v diagnostike biomarkerov.
Príklad postupu ultrazvukovej fragmentácie mtDNA
Príprava a extrakcia:
- Myši C57BL/6 boli usmrtené cervikálnou dislokáciou.
- Pečene boli rýchlo odobraté a premyté v ľadovo chladnom sterilnom PBS.
Izolácia mitochondrií:
- Mitochondrie boli izolované pomocou 2-mL Dounceovho tkanivového homogenizátora a súpravy Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Počiatočná centrifugácia pri 700× g a 3 000× g.
- Vykonajte dva ďalšie kroky premývania pufrom C.
Izolácia DNA:
- Sediment z prvej centrifugácie pri 700× g sa použil na izoláciu jadrovej DNA (nDNA).
- DNA bola izolovaná pomocou centrifugačných kolónok.
- Mitochondriálna DNA (mtDNA) bola extrahovaná z izolovaných mitochondrií.
- Jadrová DNA (nDNA) bola extrahovaná zo surových jadrových extraktov, pričom oba typy DNA pochádzali z tkaniva myšacej pečene.
Fragmentácia DNA:
- DNA bola fragmentovaná na ľade pomocou ultrazvukového sonikátora UP50H (30-kHz/50-W) s 0,5-mm mikrohrotovou sonotródou pri 14 μm počas 2 × 30 sekúnd.
Vizualizácia a kvantifikácia fragmentácie:
- Fragmentácia po pôsobení ultrazvuku sa vizualizovala na 1% agarózovom géli pomocou farbiva na DNA SYBR safe.
- Relatívne zastúpenie mtDNA a nDNA sa stanovilo pomocou qPCR.
(porov. Mariero et al., 2019)
Pri vysokokapacitnej príprave vzoriek umožňuje sonikátor pre viacjamkové platničky UIP400MTP prípravu veľkého počtu vzoriek v štandardných 96-jamkových, viacjamkových a mikrotitračných platničkách.
Prečítajte si viac o výhodách vysokokapacitnej prípravy vzoriek pomocou UIP400MTP!
Tipy na optimálnu izoláciu mitochondrií pomocou sonikácie:
- Regulácia teploty: Všetky kroky vykonávajte pri teplote v rozsahu od 0°C do 4°C. Je to rozhodujúce pre zachovanie integrity a funkčnosti mitochondrií.
- Účinnosť a rýchlosť: Pracujte rýchlo a mitochondrie čistite len do takej miery, akú vyžaduje vaša konkrétna aplikácia. Nadmerná manipulácia môže viesť k významným stratám mitochondriálneho obsahu.
- Riedenie suspenzií: Počas celého procesu izolácie udržiavajte nízke koncentrácie suspenzií buniek a organel. Pomáha to minimalizovať riziká zachytávania a aglutinácie, čím sa zvyšuje čistota izolovaných mitochondrií.
- Objem vzorky: Uprednostnite viacero príprav v malom rozsahu pred jednou prípravou vo veľkom rozsahu. Tento prístup zvyčajne prináša vyššie výťažky, pretože zväčšenie rozsahu nevedie k úmernému zvýšeniu množstva mitochondrií, ktoré možno získať. Sonikátor pre viacjamkové platničky UIP400MTP uľahčuje rýchlu a spoľahlivú lýzu buniek na izoláciu mitochondrií, ako aj extrakciu proteínov z mitochondrií.
Tieto odporúčania zefektívnia proces izolácie pomocou ultrazvukovej lýzy a centrifugácie a umožnia získať vysokokvalitné mitochondriálne preparáty vhodné na následné aplikácie.
Sonikátory Hielscher – kvalita vyrobená v Nemecku
Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojimi najvyššími štandardmi kvality a konštrukčného riešenia. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných prevádzok. Ultrazvukové prístroje Hielscher ľahko zvládajú drsné podmienky a náročné prostredia.
Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a jednoduchou obsluhou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v zhode s požiadavkami CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.
Sonikátor pre 96-jamkové platničky UIP400MTP na sonikáciu mikrotitračných a viacjamkových platničiek
Literatúra / Referencie
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Často kladené otázky o mitochondriách a mitochondriálnej diagnostike
Čo sú mitochondrie?
Mitochondrie sú organely ohraničené membránou, ktoré sa nachádzajú v bunkách väčšiny eukaryotických organizmov. Sú známe ako elektrárne bunky, pretože prostredníctvom bunkového dýchania produkujú energiu vo forme adenozíntrifosfátu (ATP). Mitochondrie majú navyše vlastnú DNA a zohrávajú kľúčové úlohy v ďalších bunkových procesoch vrátane regulácie bunkového cyklu a bunkovej smrti.
Čím sa mtDNA líši od genómovej DNA?
Mitochondriálna DNA (mtDNA) sa od genómovej DNA (gDNA) líši v niekoľkých kľúčových aspektoch. MtDNA sa nachádza v mitochondriách, je kruhová a dedí sa po matke, zatiaľ čo gDNA sa nachádza v bunkovom jadre, je lineárna a dedí sa po oboch rodičoch. MtDNA je oveľa menšia a kóduje len 37 génov, zatiaľ čo gDNA obsahuje približne 20 000–25 000 génov. MtDNA je v každej bunke prítomná vo viacerých kópiách, má vyššiu mieru mutácií a kóduje predovšetkým proteíny zapojené do funkcie mitochondrií. Naproti tomu je gDNA zvyčajne diploidná, má nižšiu mieru mutácií a kóduje rozsiahly súbor génov potrebných na vývoj a fungovanie organizmu. Okrem toho transkripcia a translácia mtDNA prebiehajú v mitochondriách, zatiaľ čo transkripcia gDNA prebieha v jadre a translácia v cytoplazme. Tieto rozdiely odrážajú ich odlišné úlohy a evolučný pôvod.
Čo je bezbunkový extrakt?
Bezbunkový extrakt je roztok obsahujúci obsah lyzovaných buniek vrátane proteínov, nukleových kyselín a ďalších bunkových zložiek, ale bez neporušených bunkových membrán. Tento extrakt sa používa v biochemickom a molekulárnobiologickom výskume na štúdium bunkových procesov in vitro, čo výskumníkom umožňuje analyzovať reakcie a mechanizmy mimo živých buniek.
Akú úlohu zohrávajú PCR testy v mitochondriálnej diagnostike?
PCR testy zohrávajú kľúčovú úlohu v mitochondriálnej diagnostike tým, že umožňujú detekciu mutácií, delécií alebo variácií počtu kópií mitochondriálnej DNA (mtDNA). Umožňujú amplifikáciu špecifických oblastí mtDNA na identifikáciu patogénnych variantov spojených s mitochondriálnymi poruchami. Techniky založené na PCR, ako sú kvantitatívna PCR (qPCR) a PCR dlhých úsekov, sa používajú aj na posúdenie integrity mtDNA, úrovní heteroplazmie a deplécie mtDNA, čím poskytujú zásadné poznatky o funkcii mitochondrií a mitochondriálnych ochoreniach.
Zistite, ako sonikátor mikrotitračných doštičiek UIP400MTP uľahčuje PCR testy a analýzy!
Čo je diferenciálna centrifugácia?
Diferenciálna centrifugácia je široko používaná technika na frakcionáciu buniek a izoláciu mitochondrií. Táto metóda oddeľuje bunkové štruktúry na základe ich sedimentačného koeficientu, ktorý závisí od hustoty aj tvaru. Proces zahŕňa pôsobenie rôzne veľkých odstredivých síl na vzorky v pufrovaných soľných roztokoch so špecifickými hustotami. Štruktúry s podobnými sedimentačnými koeficientmi sa usadia na dne zbernej skúmavky v rovnakom čase, čo umožňuje ich získanie.
Ako sa diferenciálna centrifugácia používa na izoláciu mitochondrií?
Diferenciálna centrifugácia umožňuje výskumníkom účinne oddeliť mitochondriálne frakcie od ostatných bunkových zložiek. Izolácia mitochondrií zahŕňa niekoľko centrifugačných krokov a následné získanie izolátu.
Úvodná centrifugácia: Použite nízku odstredivú silu na sedimentáciu veľkých bunkových zvyškov a jadier.
Následné centrifugácie: Postupne zvyšujte odstredivú silu, aby sa frakcie obohatené o mitochondrie usadili vo forme pelety. Každý centrifugačný krok odstraňuje štruktúry s postupne vyššími sedimentačnými koeficientmi.
Získanie frakcií: Po každej centrifugácii sa odoberie peleta a supernatant sa vystaví vyšším násobkom gravitačného zrýchlenia g, aby sa izolovala ďalšia frakcia. Tento postup sa opakuje, kým sa nedosiahne požadovaná čistota mitochondrií.