Vysokovýkonná príprava vzoriek pre mitochondriálnu diagnostiku
Mitochondriálna diagnostika vo výskume a na klinikách sa vykonáva pomocou rôznych techník, ako je sekvenovanie, PCR a biochemické testy. Tieto metódy sa používajú na identifikáciu mutácií DNA a meranie mitochondriálnej funkcie. Sekvenovanie pomáha odhaliť genetické mutácie, zatiaľ čo PCR dokáže kvantifikovať špecifické sekvencie DNA. Biochemické testy hodnotia funkčnosť mitochondriálnych proteínov a enzýmov.
Diagnostika mitochondriálnych ochorení je obzvlášť náročná kvôli výraznej klinickej variabilite týchto ochorení, ako aj kvôli zložitej interakcii medzi dvoma rôzne dedičnými genómami: mitochondriálnou DNA (mtDNA) a jadrovým genómom.
Extrakcia a fragmentácia DNA pomocou sonikácie
Extrakcia DNA zo svalového tkaniva je obzvlášť užitočná pri podozrení na tkanivovo špecifické zmeny v mtDNA. Tieto zmeny môžu zahŕňať delécie mtDNA pri chronickej progresívnej vonkajšej oftalmoplégii (CPEO), bodové mutácie mtDNA v mitochondriálnych myopatiách alebo depléciu mtDNA pri Alpersovom syndróme. DNA extrahovaná zo svalového tkaniva sa potom môže použiť na rôzne genetické testy, ako je Southern blot a PCR s dlhým dosahom na delécie, PCR v reálnom čase na vyčerpanie alebo sekvenovanie pre bodové mutácie.
Sonikácia pomocou intenzívnych ultrazvukových vĺn sa používa na niekoľko aplikácií v mitochondriálnej diagnostike. Používa sa na lýzu buniek na extrakciu intracelulárneho obsahu, ako sú mitochondrie a DNA, na strihanie DNA, ako sú mtDNA a nDNA na sekvenovanie, a na homogenizáciu vzoriek.
UIP400MTP Plate Sonicator na vysokovýkonnú prípravu vzoriek rovnomerne sonikuje vzorky vo viacjamkových a 96-jamkových platniach
Ako izolovať mitochondrie z buniek a tkanív
Mitochondriálna izolácia pozostáva z dvoch základných krokov: narušenie buniek, aby uvoľnili svoj obsah, a použitie diferenciálnej centrifugácie na oddelenie a obnovu mitochondriálnych frakcií.
Ultrazvukom
Hielscherove sonikátory sú kompatibilné so štandardnými lyznými pufrmi a súpravami, vďaka čomu sú vhodné na izoláciu mitochondrií. Sonikácia slúži na dva hlavné účely:
- Lýza buniek: Ultrazvukové vlny narúšajú bunkové membrány a uvoľňujú intracelulárny obsah.
- Narušenie mitochondrií: Sonikacia v nasledujúcom kroku môže rozbiť mitochondrie a uvoľniť mitochondriálne proteíny alebo mitochondriálnu DNA.
- Fragmentácia mtDNA: Sonikácia je spoľahlivá technika na strihanie mitochondriálnej DNA na sekvenovanie.
Viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP umožňuje vysokovýkonnú prípravu vzoriek mitochondriálnych vzoriek. V spojení s diferenciálnou centrifugáciou sonikácia zvyšuje účinnosť mitochondriálnej izolácie a zaisťuje vysoké výťažky neporušených mitochondrií vhodných pre rôzne následné aplikácie.
Hielscher UIP400MTP viacjamkový doštičkový sonikátor Funguje s akoukoľvek štandardnou platňou
Viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP ponúka množstvo výhod pre vysokovýkonnú prípravu vzoriek, napr. v mitochondriálnej diagnostike.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator na vysokovýkonnú prípravu vzoriek v diagnostike biomarkerov.
Príkladné pokyny pre ultrazvukovú fragmentáciu mtDNA
Príprava a extrakcia:
- Myši C57BL/6 boli zabité vykĺbením krčka maternice.
- Pečeň bola rýchlo extrahovaná a umytá v ľadovo studenom sterilnom PBS.
Izolácia mitochondrií:
- Mitochondrie boli izolované pomocou 2-ml mlynčeka na tkanivo Dounce a súpravy na izoláciu mitochondrií pre tkanivo.
- Počiatočné odstredenie pri 700× g a 3 000× g.
- Vykonajte dva ďalšie kroky prania s nárazníkom C.
Izolácia DNA:
- Peleta z prvej centrifugácie pri 700× g bola použitá na izoláciu jadrovej DNA (nDNA).
- DNA bola izolovaná pomocou spinových stĺpcov.
- Mitochondriálna DNA (mtDNA) bola extrahovaná z izolovaných mitochondrií.
- Jadrová DNA (nDNA) bola extrahovaná zo surových jadrových extraktov, oba z tkaniva pečene myší.
Fragmentácia DNA:
- DNA bola fragmentovaná na ľade pomocou 30-kHz/50-W ultrazvukového sonikátora UP50H s 0,5 mm mikrohrotovou sonotródou pri 14 μm na 2 × 30 sekúnd.
Vizualizácia a kvantifikácia fragmentácie:
- Fragmentácia po ultrasonifikácii bola vizualizovaná na 1% agarózovom géli s SYBR bezpečným DNA farbivom.
- Relatívna hojnosť mtDNA a nDNA bola stanovená pomocou qPCR.
(porovnaj Mariero a kol., 2019)
Na prípravu vzoriek s vysokým výkonom uľahčuje viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP prípravu veľkého počtu vzoriek v štandardných 96-jamkových, viacjamkových a mikrotitračných platniach.
Prečítajte si viac o výhodách vysokovýkonnej prípravy vzoriek pomocou UIP400MTP!
Tipy na optimálnu izoláciu mitochondrií pomocou sonikácie:
- Regulácia teploty: Všetky kroky vykonávajte pri teplotnom rozsahu 0 °C až 4 °C. To je rozhodujúce pre udržanie integrity a funkčnosti mitochondrií.
- Účinnosť a rýchlosť: Pracujte rýchlo a vyčistite mitochondrie len v rozsahu potrebnom pre vašu konkrétnu aplikáciu. Nadmerná manipulácia môže viesť k značným stratám mitochondriálneho obsahu.
- Riedenie suspenzií: Počas procesu izolácie udržujte nízke koncentrácie suspenzií buniek a organel. To pomáha minimalizovať riziko zachytenia a aglutinácie, čím sa zlepšuje čistota izolovaných mitochondrií.
- Objem vzorky: Rozhodnite sa pre viacero prípravkov v malom meradle namiesto jedného veľkého. Tento prístup zvyčajne vedie k lepším výnosom, pretože zväčšovanie úmerne nezvyšuje množstvo obnoviteľných mitochondrií. Viacjamkový sonikátor UIP400MTP uľahčuje rýchlu a spoľahlivú lýzu buniek na izoláciu mitochondrií, ako aj extrakciu proteínov z mitochondrií.
Tieto pokyny zefektívnia proces izolácie pomocou ultrazvukovej lýzy a centrifugácie, čím sa získajú vysokokvalitné mitochondriálne prípravky vhodné pre následné aplikácie.
Hielscher Sonicators – Kvalita vyrobená v Nemecku
Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojou najvyššou kvalitou a dizajnovými štandardmi. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných zariadení. Drsné podmienky a náročné prostredie ľahko zvládnu ultrazvukové prístroje Hielscher.
Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a užívateľskou prívetivosťou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.
96-jamkový sonikátor UIP400MTP na sonikáciu mikrotitrových a viacjamkových platničiek
Literatúra / Referencie
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Často kladené otázky o mitochondriách a mitochondriálnej diagnostike
Čo sú mitochondrie?
Mitochondrie sú membránovo viazané organely, ktoré sa nachádzajú v bunkách väčšiny eukaryotických organizmov. Sú známe ako elektrárne bunky, pretože produkujú energiu vo forme adenozíntrifosfátu (ATP) prostredníctvom procesu bunkového dýchania. Okrem toho majú mitochondrie svoju vlastnú DNA a zohrávajú kľúčovú úlohu v iných bunkových procesoch vrátane regulácie bunkového cyklu a bunkovej smrti.
Čo odlišuje mtDNA od genómovej DNA?
Mitochondriálna DNA (mtDNA) sa líši od genómovej DNA (gDNA) niekoľkými kľúčovými spôsobmi. MtDNA sa nachádza v mitochondriách, je kruhová a dedí sa matkou, zatiaľ čo gDNA sa nachádza v bunkovom jadre, je lineárna a dedí sa od oboch rodičov. MtDNA je oveľa menšia, kóduje iba 37 génov, zatiaľ čo gDNA obsahuje asi 20 000 až 25 000 génov. MtDNA je prítomná vo viacerých kópiách na bunku, má vyššiu rýchlosť mutácií a primárne kóduje proteíny zapojené do mitochondriálnej funkcie. Naproti tomu gDNA je typicky diploidní, má nižšiu mieru mutácií a kóduje širokú škálu génov potrebných pre vývoj a funkciu organizmu. Okrem toho sa transkripcia a translácia mtDNA vyskytujú v mitochondriách, zatiaľ čo transkripcia gDNA prebieha v jadre a translácia sa vyskytuje v cytoplazme. Tieto rozdiely odrážajú ich odlišné úlohy a evolučný pôvod.
Čo je bezbunkový extrakt?
Bezbunkový extrakt je roztok obsahujúci obsah lyzovaných buniek vrátane bielkovín, nukleových kyselín a iných bunkových zložiek, ale bez neporušených bunkových membrán. Tento extrakt sa používa v biochemickom a molekulárnobiologickom výskume na štúdium bunkových procesov in vitro, čo umožňuje výskumníkom analyzovať reakcie a mechanizmy mimo živých buniek.
Akú úlohu zohrávajú PCR testy v mitochondriálnej diagnostike?
PCR testy zohrávajú kľúčovú úlohu v mitochondriálnej diagnostike tým, že umožňujú detekciu mutácií, delécií alebo variácií počtu kópií v mitochondriálnej DNA (mtDNA). Umožňujú amplifikáciu špecifických oblastí mtDNA na identifikáciu patogénnych variantov spojených s mitochondriálnymi poruchami. Techniky založené na PCR, ako je kvantitatívna PCR (qPCR) a PCR s dlhým dosahom, sa tiež používajú na hodnotenie integrity mtDNA, úrovní heteroplazmy a vyčerpania mtDNA, čo poskytuje základné poznatky o mitochondriálnej funkcii a chorobe.
Zistite, ako UIP400MTP Microplate Sonicator uľahčuje PCR testy a testy!
Čo je diferenciálna centrifugácia?
Diferenciálna centrifugácia je široko používaná technika na frakcionáciu buniek a mitochondriálnu izoláciu. Táto metóda oddeľuje bunkové štruktúry na základe ich sedimentačného koeficientu, ktorý závisí od hustoty aj tvaru. Tento proces zahŕňa aplikáciu rôznych úrovní odstredivej sily na vzorky v pufrovaných soľných roztokoch so špecifickou hustotou. Štruktúry s podobnými sedimentačnými koeficientmi sa súčasne usadia na dne zbernej trubice, čo umožní ich obnovenie.
Ako sa diferenciálna centrifugácia používa na izoláciu mitochondrií?
Diferenciálna centrifugácia umožňuje výskumníkom efektívne oddeľovať mitochondriálne frakcie od iných bunkových zložiek. Izolácia mitochondrií zahŕňa niekoľko krokov centrifugácie a následné zotavenie izolátu.
Počiatočné odstreďovanie: Použite nízku odstredivú silu na sediment veľkých bunkových zvyškov a jadier.
Následné centrifugácie: Postupne zvyšujte odstredivú silu na frakcie peliet obohatené mitochondriami. Každý krok centrifugácie odstraňuje štruktúry s postupne zvyšujúcimi sa sedimentačnými koeficientmi.
Regenerácia frakcií: Po každom odstreďovaní sa peleta zhromaždí a supernatant sa podrobí vyšším g-silám, aby sa izolovala ďalšia frakcia. Toto sa opakuje, kým sa nedosiahne požadovaná čistota mitochondrií.