Producția cu ultrasunete de beta-glucani schizofilan foarte purificat

Schizophyallan este un β-glucan fungic cu proprietăți imunomodulatoare. Pentru efecte medicinale foarte active, schizofilanul trebuie să aibă o greutate moleculară mică pentru a demonstra o biodisponibilitate îmbunătățită. Ultrasonication sa dovedit a reduce greutatea moleculară a schizofilanului. Ca metodă fiabilă și eficace, sonicare poate fi ușor aplicată pentru producerea de schizofilan cu greutate moleculară mică.

Schizophyllum ciuperci și extracție cu ultrasunete beta-glucan

Speciile ciupercii Schizophyllum cresc în natură pe copacii decăzuți după anotimpurile ploioase. Corpurile de fructe sunt colectate în următorul sezon uscat. Speciile Schizophyllum sunt bogate în compuși biochimici, cum ar fi glucanii și, prin urmare, sunt consumate în special în țările tropicale ca hrană și medicament. Datorită proprietăților sale imunomodulatoare, antifungice, antineoplazice și antivirale, comuna Schizophyllum, cunoscută și sub numele de ciuperca Splitgill, a atras companii biotehnologice și farmaceutice.
Schizofilanul polizaharid, cunoscut și sub numele de sizofiran, sonifilan sau sizofilan, este principalul β-glucan găsit în ciupercile Schizophyllum, care oferă schizofilanul bioactiv β-glucan extrem de eficient.
Ciupercile de comună Schizophyllum cresc în natură pe copaci, miceliul poate fi cultivat și în bulion de fermentație. Pentru aplicații farmaceutice și cosmetice, schizofilanul cu greutate moleculară mică este mult mai eficace decât schizofilanul cu greutate moleculară mare. Acest lucru se datorează faptului că schizofilanul cu greutate moleculară mică prezintă rate de biodisponibilitate și absorbție semnificativ mai bune. În plus, schizofilanul cu greutate moleculară mare este adesea problematic în aplicații, deoarece are ca rezultat o vâscozitate ridicată a soluțiilor sale apoase.
Reducerea dimensiunii cu ultrasunete este o tehnică extrem de eficientă și fiabilă pentru a reduce greutatea moleculară a schizofilanului, crescând astfel calitatea moleculei de β-glucan.

Protocol pentru producerea schizofilanului cu greutate moleculară mică

Deoarece schizofilanul cu greutate moleculară demonstrează biodisponibilitatea drastic mai bună și proprietățile de aplicare, echipa de cercetare a lui Smirnou a investigat ultrasonication pentru scindarea și reducerea dimensiunii moleculei de β-glucan schizophyllan.

Ultrasonication de Schizophyllan

β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) a fost produs prin cultivarea submersă a ciupercii S. commune în bioreactor folosind zaharoză ca substrat.
După terminarea cultivării, bulionul de cultură a fost diluat cu apă demineralizată până la concentrația de schizofilan 2 g / L și ultrasonicated cu procesor ultrasonic UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Germania) în modul de reciclare la următorii parametri și condiții: debit mediu 50 ml / s, frecvență 20 kHz, ieșire 2000 W, sonotrode tip BS2d22, tip booster B2-1.4 și amplitudine 100%. Temperatura bulionului de cultură la începutul sonicare a fost de 25 ° C. Bulionul de cultură ultrasonicated (intrare specifică de energie 100 Ws / ml) a fost filtrat prin filtrul de adâncime Seitz HS800 sub presiune de 1,5 bar la 40 ° C. Schizofilanul ultrasonicated (uSPG) pentru caracterizarea chimică a fost precipitat din filtrat cu o cantitate triplă de alcool izopropilic la temperatura laboratorului și uscat la 60 ° C timp de 12 ore Soluțiile uSPG pentru studii imunologice au fost preparate după cum urmează: (1) filtratul de bulion de cultură ultrasonicated a fost diafiltrat prin caseta PES Pall Centramate din seria T Pall (100 kDa cut-off) la 0,8 bar și diafiltrarea a continuat până când conductivitatea retentatului a fost de 20 μS / cm; (2) soluția a fost concentrată prin diafiltrare la concentrație uSPG 1 g/L și sterilizată prin autoclavizare la 120°C/20 min. USPG denaturat a fost preparat într-un mod similar, cu excepția faptului că NaOH a fost adăugat la filtratul bulionului de cultură în concentrație 0,2 M și soluția alcalinizată a fost incubată timp de 30 de minute la temperatura laboratorului înainte de diafiltrare.

Metode analitice

Producția de miceliu a fost estimată gravimetric: bulionul de cultură a fost diluat cu apă 1:4, centrifugat 10000 × g la 25 ° C timp de 20 min, precipitatul a fost spălat cu o cantitate triplă de apă, uscat la 60 ° C și cântărit. Schizofilanul a fost precipitat din supernatant cu o cantitate triplă de alcool izopropilic, uscat la 60°C timp de 24 de ore, iar randamentul său a fost determinat gravimetric. pO2 din bulionul de cultură a fost măsurat cu sonda optică Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Elveția).
Vâscozitatea dinamică a bulionului de cultură a fost măsurată pe testerul HAAKE Visco 6L cu arbori principali 1L și 2L la 4°C și viteză de rotație de 30 rpm. Viteza de filtrare a fost calculată din timpul de filtrare a bulionului de cultură de 500 ml prin filtrul de adâncime Seitz HS800 × 200 mm (Pall, SUA) la presiune de 1,5 bar și 40 ° C.
Masa moleculară uSPG a fost măsurată de SEC-MALLS pe sistemul HPLC Alliance (Waters) cu coloane PL aquagel OH60 și PL aquagel OH40 conectate în serie, iar detectorul miniDAWN TREOS (Wyatt) a fost concentrat prin diafiltrare la concentrația uSPG 1 g / L și sterilizat prin autoclavare la 120 ° C / 20 min. USPG denaturat a fost preparat într-un mod similar, cu excepția faptului că NaOH a fost adăugat la filtratul bulionului de cultură în concentrație 0,2 M și soluția alcalinizată a fost incubată timp de 30 de minute la temperatura laboratorului înainte de diafiltrare.

Rezultatele:
Tratamentul cu ultrasunete a fost aplicat direct la S. comuna 144-h bulion de cultură cu miceliu pentru a facilita prelucrarea SPG în aval.
 
Caracteristicile Schizophyllan sonicated: Schizophyllan ultrasonicated (uSPG) a fost precipitat din filtratul de bulion de cultură de alcool și caracterizat. SEC-MALLS a estimat că Mw de uSPG este de aproximativ 1 MDa. Greutatea moleculară medie a schizofilanului din fermentația lichidă este de aproximativ 5 MDa, în timp ce în cultivarea în stare solidă poate ajunge până la 10 MDa. Comparând greutatea moleculară a schizofilanului ultrasonicated cu greutățile moleculare ale schizofilanului nativ netratat, se poate observa o greutate moleculară redusă de 5 până la 10 ori datorită ultrasonication.
Polizaharida sonicată uSPG conținea 0.7% g / w proteine și 1.0% g / w reziduuri după aprindere. Hidrolizatul uSPG a constat din glucoză cu mai mult de 99%. Rezultatele analitice indică faptul că sonicare scindează coloana vertebrală β-glucan aleatoriu și ramurile laterale rămân intacte, reducând astfel dimensiunea și greutatea moleculară a schizofilanului. Studiile imunologice privind uSPG fără proteine și endotoxine au arătat, că schizofilanul ultrasonicated low-Mw are o activitate imunomodulatoare pronunțată.

 
Vâscozitate redusă: Ultrasonication a dus la o scădere semnificativă a vâscozității bulionului de cultură. În timpul ultrasonication, vâscozitatea bulionului de cultură sa schimbat neliniar: scăderea vâscozității a fost rapidă la începutul ultra-sonicare, dar mai târziu a încetinit. Aportul specific de energie de 100 Ws / ml a fost suficient pentru a reduce vâscozitatea bulionului de cultură de aproape 7 ori.

Filtrare îmbunătățită: Supa de cultură tratată cu ultrasunete curgea prin filtru mai repede decât bulionul de cultură netratat (consum specific de energie 0 Ws / ml) cu SPG moleculară înaltă. În plus, ultrasonication a redus semnificativ pierderea produsului în timpul filtrării. Filtratul bulionului de cultură netratat cu SPG molecular ridicat (intrare specifică de energie 0 Ws / ml) conținea 0,3 ± 0,07 g / L SPG, în timp ce concentrația SPG înainte de filtrarea în adâncime era de 2 g / L. În schimb, filtratul de cultură ultrasonicated 100 Ws / ml conținea SPG în concentrație de 2,2 ± 0,2 g / L, ceea ce corespunde pierderii aproape zero a produsului.

Concluzie: În concluzia lor, echipa de cercetare reia faptul că prelucrarea cu ultrasunete este o tehnologie eficientă pentru fabricarea schizofilanului cu greutate moleculară mică, care poate fi apoi utilizat în cosmetică și medicină. Ultrasonication, atunci când este aplicat pe bulion de cultură completă cu miceliu, aduce anumite avantaje producției de schizofilan. Reduce pierderile de produse în timpul procesării în aval și face posibilă producția de polizaharidă înalt purificată datorită utilizării eficiente a ultrafiltrării.
În plus, cercetătorii au descoperit că prelucrarea cu ultrasunete a schizofilanului este ușor scalabilă. O unitate a instalației pilot dezintegrator cu ultrasunete UIP2000hdT procesat 1 litru de bulion de cultură în 110 s în modul de curgere. Productivitatea sistemului poate fi ușor crescută prin conectarea secvențială a unităților suplimentare cu ultrasunete.

 
Citiți mai multe despre extinderea simplă a extracției ciupercilor!
 

Echipamente cu ultrasunete de înaltă performanță pentru prelucrarea glucanului fungic

Fragmentarea polizaharidelor, ar fi glucanii, precum și alți compuși bioactivi, ar fi chitina și chitosanul, pot fi prelucrate în mod fiabil cu echipamente cu ultrasunete de înaltă performanță Hielscher. Ultrasonicators noastre pot livra amplitudini mari, oferă un control precis asupra parametrilor procesului și pot fi operate 24/7 sub sarcină grea și în medii solicitante. Hielscher Ultrasonics gama de echipamente îndeplinește aceste cerințe în mod fiabil. Pe lângă performanța remarcabilă cu ultrasunete, ultrasonicators Hielscher se mândresc cu eficiență energetică ridicată, ceea ce reprezintă un avantaj economic semnificativ – mai ales atunci când este angajat în producția comercială pe scară largă.
Hielscher ultrasonicators sunt sisteme de înaltă performanță, care pot fi echipate cu accesorii, ar fi sonotrodes, boostere, reactoare sau celule de flux, în scopul de a se potrivi nevoilor procesului într-un mod optim. Cu afișaj color digital, opțiunea de a preseta sonicare rulează, înregistrarea automată a datelor pe un card SD integrat, controlul de la distanță al browserului și multe alte caracteristici, cel mai înalt control al procesului și ușurința în utilizare sunt asigurate. Împreună cu robustețea și capacitatea portantă grea, sistemele cu ultrasunete Hielscher sunt calul de lucru de încredere în producție. Reducerea greutății moleculare a β-glucanilor, cum ar fi schizofilanul, necesită ultrasunete puternice pentru a obține scindarea vizată și un produs final schizofilan de înaltă calitate, care poate fi utilizat pentru aplicații farmaceutice.
 
Găsiți mai multe informații despre extracția cu ultrasunete beta-glucan din ciuperci, inclusiv instrucțiuni pas cu pas aici!
 
Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a ultrasonicators noastre: