Producția cu ultrasunete a beta-glucanilor schizophyllan de înaltă puritate

Schizophyllanul este un β-glucan fungic cu proprietăți imunomodulatoare. Pentru efecte medicinale foarte active, schizophyllanul trebuie să aibă o masă moleculară mică, astfel încât să prezinte o biodisponibilitate îmbunătățită. S-a demonstrat că ultrasonicarea reduce masa moleculară a schizophyllanului. Ca metodă fiabilă și eficace, sonicarea poate fi aplicată cu ușurință pentru producția de schizophyllan cu masă moleculară mică.

Ciupercile Schizophyllum și extracția cu ultrasunete a beta-glucanilor

Speciile de ciuperci Schizophyllum cresc în natură pe arbori în descompunere după anotimpurile ploioase. Corpurile fructifere sunt colectate în următorul anotimp secetos. Speciile de Schizophyllum sunt bogate în compuși biochimici precum glucanii și, prin urmare, sunt consumate în special în țările tropicale ca aliment și medicament. Datorită proprietăților sale imunomodulatoare, antifungice, antineoplazice și antivirale, Schizophyllum commune, cunoscută și sub numele de ciuperca Splitgill, a atras atenția companiilor de biotehnologie și a celor farmaceutice.
Polizaharidul schizophyllan, cunoscut și sub denumirile de sizofiran, sonifilan sau sizofilan, este principalul β-glucan prezent în ciupercile Schizophyllum, care oferă β-glucanul bioactiv foarte eficient schizophyllan.
Ciupercile Schizophyllum commune cresc în natură pe arbori, iar miceliul poate fi cultivat și în mediu de fermentație. Pentru aplicațiile farmaceutice și cosmetice, schizophyllanul cu masă moleculară mică este mult mai eficace decât schizophyllanul cu masă moleculară mare. Acest lucru se datorează faptului că schizophyllanul cu masă moleculară mică prezintă o biodisponibilitate și rate de absorbție semnificativ mai bune. În plus, schizophyllanul cu masă moleculară mare este adesea problematic în aplicații, deoarece conferă soluțiilor sale apoase o vâscozitate ridicată.
Reducerea dimensiunii cu ultrasunete este o tehnică foarte eficientă și fiabilă pentru scăderea masei moleculare a schizophyllanului, crescând astfel calitatea moleculei de β-glucan.

Protocol pentru producția de schizophyllan cu masă moleculară mică

Deoarece schizophyllanul cu masă moleculară demonstrează o biodisponibilitate și proprietăți de aplicare drastic mai bune, echipa de cercetare a lui Smirnou a investigat ultrasonicarea pentru scindarea și reducerea dimensiunii moleculei de β-glucan schizophyllan.

Ultrasonicarea schizophyllanului

β-1.3(1.6)-Glucanul schizophyllan (SPG) a fost produs prin cultivarea submersă a ciupercii S. commune în bioreactor, utilizând zaharoza ca substrat.
După încheierea cultivării, mediul de cultură a fost diluat cu apă demineralizată până la o concentrație de schizophyllan de 2 g/L și ultrasonicat cu procesorul cu ultrasunete UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Germania) în mod de recirculare, la următorii parametri și condiții: debitul mediului 50 mL/s, frecvență 20 kHz, putere 2000 W, sonotrodă de tip BS2d22, booster de tip B2-1.4 și amplitudine 100%. Temperatura mediului de cultură la începutul sonicării a fost de 25°C. Mediul de cultură ultrasonicat (aport specific de energie 100 Ws/mL) a fost filtrat printr-un filtru de adâncime Seitz HS800 la o presiune de 1,5 bar, la 40°C. Schizophyllanul ultrasonicat (uSPG) destinat caracterizării chimice a fost precipitat din filtrat cu o cantitate triplă de alcool izopropilic la temperatura laboratorului și uscat la 60°C timp de 12h. Soluțiile de uSPG pentru studiile imunologice au fost preparate după cum urmează: (1) filtratul mediului de cultură ultrasonicat a fost diafiltrat printr-o casetă PES Pall Centramate seria T de 0,1m2 (prag de separare 100 kDa) la 0,8 bar, iar diafiltrarea a continuat până când conductivitatea retentatului a ajuns la 20 μS/cm; (2) soluția a fost concentrată prin diafiltrare până la o concentrație de uSPG de 1 g/L și sterilizată prin autoclavare la 120°C/20 min. uSPG-ul denaturat a fost preparat în mod similar, cu excepția faptului că s-a adăugat NaOH în filtratul mediului de cultură în concentrație de 0,2 M, iar soluția alcalinizată a fost incubată timp de 30 min la temperatura laboratorului înainte de diafiltrare.

Metode analitice

Randamentul de miceliu a fost estimat gravimetric: mediul de cultură a fost diluat cu apă 1:4, centrifugat la 10.000 × g la 25°C timp de 20 min, precipitatul a fost spălat cu o cantitate triplă de apă, uscat la 60°C și cântărit. Schizophyllanul a fost precipitat din supernatant cu o cantitate triplă de alcool izopropilic, uscat la 60°C timp de 24h, iar randamentul său a fost determinat gravimetric. pO2 în mediul de cultură a fost măsurat cu sonda optică Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Elveția).
Vâscozitatea dinamică a mediului de cultură a fost măsurată cu HAAKE Visco Tester 6L, cu spindle-urile 1L și 2L, la 4°C și o viteză de rotație de 30 rpm. Viteza de filtrare a fost calculată din timpul de filtrare a 500 mL de mediu de cultură printr-un filtru de adâncime Seitz HS800 (Pall, SUA) de 200 × 200 mm, la o presiune de 1,5 bar și 40°C.
Masa moleculară a uSPG a fost măsurată prin SEC-MALLS pe sistemul HPLC Alliance (Waters), cu coloanele PL aquagel OH60 și PL aquagel OH40 conectate în serie, iar detectorul miniDAWN TREOS (Wyatt) a fost concentrat prin diafiltrare până la o concentrație de uSPG de 1 g/L și sterilizat prin autoclavare la 120°C/20 min. uSPG-ul denaturat a fost preparat în mod similar, cu excepția faptului că s-a adăugat NaOH în filtratul mediului de cultură în concentrație de 0,2 M, iar soluția alcalinizată a fost incubată timp de 30 min la temperatura laboratorului înainte de diafiltrare.

Rezultate:
Tratamentul cu ultrasunete a fost aplicat direct mediului de cultură S. commune de 144 h, cu miceliu, pentru a facilita procesarea în aval a SPG.

Caracteristicile schizophyllanului sonicat: Schizophyllanul ultrasonicat (uSPG) a fost precipitat cu alcool din filtratul mediului de cultură și caracterizat. Prin SEC-MALLS, Mw a uSPG a fost estimată la aproximativ 1 MDa. Masa moleculară medie a schizophyllanului obținut prin fermentație lichidă este de aproximativ 5 MDa, în timp ce în cultivarea în stare solidă poate atinge până la 10 MDa. Comparând masa moleculară a schizophyllanului ultrasonicat cu masele moleculare ale schizophyllanului nativ netratat, se poate observa o masă moleculară redusă de 5 până la 10 ori ca urmare a ultrasonicării.
Polizaharidul sonicat uSPG a conținut 0,7%w/w proteine și 1,0%w/w reziduu după calcinare. Hidrolizatul de uSPG a constat în proporție de peste 99% din glucoză. Rezultatele analitice indică faptul că sonicarea scindează aleatoriu scheletul β-glucanului, iar ramificațiile laterale rămân intacte, reducând astfel dimensiunea și masa moleculară a schizophyllanului. Studiile imunologice asupra uSPG practic lipsit de proteine și endotoxine au arătat că schizophyllanul ultrasonicat cu Mw mică are o activitate imunomodulatoare pronunțată.

 
Vâscozitate redusă: Ultrasonicarea a dus la o scădere semnificativă a vâscozității mediului de cultură. În timpul ultrasonicării, vâscozitatea mediului de cultură s-a modificat neliniar: scăderea vâscozității a fost rapidă la începutul ultrasonicării, dar ulterior a încetinit. Un aport specific de energie de 100 Ws/mL a fost suficient pentru a reduce vâscozitatea mediului de cultură de aproape 7 ori.

Filtrare îmbunătățită: Mediul de cultură tratat cu ultrasunete a trecut prin filtru mai repede decât mediul de cultură netratat (aport specific de energie 0 Ws/mL) cu SPG cu masă moleculară mare. În plus, ultrasonicarea a redus semnificativ pierderile de produs în timpul filtrării. Filtratul mediului de cultură netratat cu SPG cu masă moleculară mare (aport specific de energie 0 Ws/mL) a conținut 0,3 ± 0,07 g/L SPG, în timp ce concentrația de SPG înainte de filtrarea în adâncime era de 2 g/L. În schimb, filtratul mediului de cultură ultrasonicat cu 100 Ws/mL a conținut SPG în concentrație de 2,2 ± 0,2 g/L, ceea ce corespunde unei pierderi de produs aproape nule.

Concluzie: În concluzia lor, echipa de cercetare rezumă că procesarea cu ultrasunete este o tehnologie eficientă pentru fabricarea schizophyllanului cu masă moleculară mică, care poate fi apoi utilizat în cosmetică și medicină. Ultrasonicarea, atunci când este aplicată întregului mediu de cultură cu miceliu, aduce anumite avantaje producției de schizophyllan. Aceasta reduce pierderile de produs în timpul procesării în aval și face posibilă producția de polizaharid de înaltă puritate datorită utilizării eficiente a ultrafiltrării.
În plus, cercetătorii au constatat că procesarea cu ultrasunete a schizophyllanului este ușor de extins la scară. O unitate a dezintegratorului cu ultrasunete la scară pilot UIP2000hdT a procesat 1 litru de mediu de cultură în 110 s în mod de flux. Productivitatea sistemului poate fi crescută cu ușurință prin conectarea secvențială a unor unități suplimentare cu ultrasunete.

Citiți mai multe despre extinderea simplă la scară a extracției din ciuperci!
 

Echipamente cu ultrasunete de înaltă performanță pentru procesarea glucanilor fungici

Fragmentarea polizaharidelor precum glucanii, precum și a altor compuși bioactivi precum chitina și chitosanul, poate fi realizată în mod fiabil cu echipamentele cu ultrasunete de înaltă performanță Hielscher. Ultrasonicatoarele noastre pot furniza amplitudini mari, oferă o controlabilitate precisă a parametrilor de proces și pot fi operate 24/7 la sarcină mare și în medii solicitante. Gama de echipamente Hielscher Ultrasonics îndeplinește aceste cerințe în mod fiabil. Pe lângă performanța ultrasonică remarcabilă, ultrasonicatoarele Hielscher se remarcă prin eficiențe energetice ridicate, ceea ce reprezintă un avantaj economic semnificativ – mai ales atunci când sunt utilizate în producția comercială la scară largă.
Ultrasonicatoarele Hielscher sunt sisteme de înaltă performanță care pot fi echipate cu accesorii precum sonotrode, boostere, reactoare sau celule de flux, pentru a corespunde în mod optim nevoilor procesului dumneavoastră. Cu afișaj digital color, opțiunea de presetare a ciclurilor de sonicare, înregistrarea automată a datelor pe un card SD integrat, control de la distanță prin browser și multe alte funcții, sunt asigurate cel mai înalt control al procesului și ușurința în utilizare. Împreună cu robustețea și capacitatea de a suporta sarcini mari, sistemele cu ultrasunete Hielscher sunt calul de povară fiabil din producția dumneavoastră. Reducerea masei moleculare a β-glucanilor precum schizophyllanul necesită ultrasunete puternice pentru a obține scindarea vizată și un produs final de schizophyllan de înaltă calitate, care poate fi utilizat în aplicații farmaceutice.

Găsiți aici mai multe informații despre extracția cu ultrasunete a beta-glucanilor din ciuperci, inclusiv instrucțiuni pas cu pas!

Tabelul de mai jos vă oferă o indicație privind capacitatea aproximativă de procesare a ultrasonicatoarelor noastre: