Transformarea genetică a celulelor vegetale cu ajutorul ultrasunetelor

Transformarea mediată de Agrobacterium asistată de sonicare (SAAT) este o metodă eficientă de a infecta celulele vegetale cu gene străine folosind Agrobacterium ca transportor. Cavitația ultrasonică provoacă sonoporarea, care poate fi descrisă ca o microrănire țintită a țesutului vegetal. Prin aceste microrăni create cu ultrasunete, ADN-ul și vectorii de ADN pot fi transportați eficient în matricea celulară.

Sonoporarea – transformarea celulară îmbunătățită cu ultrasunete

Atunci când ultrasunetele de joasă frecvență (aprox. 20kHz) sunt aplicate suspensiilor celulare, efectele cavitației acustice provoacă o permeabilizare tranzitorie a membranei țesuturilor celulare. Acest efect ultrasonic este cunoscut sub numele de sonoporare și este folosit pentru transferul de gene în celule sau țesuturi.
Avantajele ultrasonării se bazează pe principiul său de funcționare mecanic, netermic, care face ca sonicarea să fie adesea mai versatilă și mai puțin dependentă de tipurile de celule. Aplicarea versatilă a sonoporării deschide posibilitatea utilizării plantelor transgenice, care au un potențial semnificativ în bioproducția de proteine terapeutice umane complexe. Astfel de bioreactoare pe bază de plante pot fi manipulate genetic cu ușurință, previn contaminarea potențială cu agenți patogeni umani, nu dăunează bacteriilor care mediază transformarea (de ex. Agrobacterium) și reprezintă o metodă de biosinteză ieftină și eficace.

Transformarea celulară asistată de ultrasunete

Sonicarea este o tehnică ce aplică unde ultrasonice de joasă frecvență pentru a agita particulele dintr-o soluție, pentru a amesteca soluțiile, mărind astfel rata de transfer de masă și de dizolvare. Simultan, sonicarea poate elimina gazele dizolvate din lichide. În transformarea plantelor, sonicarea va provoca formarea de microrăni pe țesutul vegetal și va îmbunătăți livrarea ADN-ului liber în protoplastul vegetal.

Pentru transformarea genetică, Transformarea mediată de Agrobacterium asistată de sonicare (SAAT) este metoda preferată și are o eficiență semnificativ mai mare decât sonicarea folosită pentru a transfera ADN liber și vectori de ADN direct în protoplast. Numeroase studii au demonstrat că transformarea mediată de Agrobacterium asistată de sonicare (SAAT) poate fi folosită pentru a induce dezintegrarea mecanică și formarea de răni pe celulele vegetale prin undele ultrasonice și cavitația acustică rezultată. Un tratament ultrasonic scurt creează microrăni pe suprafața explantelor. Deoarece celulele rănite vor permite pătrunderea Agrobacterium în partea mai profundă a țesuturilor vegetale, crescând astfel probabilitatea ca celulele vegetale să fie infectate. În plus, compușii fenolici secretați îmbunătățesc transformarea. Microrănile generate cu ultrasunete fac, de asemenea, mai fezabilă pătrunderea bacteriilor în explante. SAAT a fost folosită cu succes pentru transformarea genetică la specii de plante considerate în special rezistente la Agrobacterium.
Faptul că este o metodă foarte simplă și ieftină, precum și îmbunătățirea semnificativă a transferului de gene mediat de Agrobacterium reprezintă principalele avantaje ale SAAT. În afară de aplicarea cu succes a SAAT în transformarea Chenopodium rubrum L. și Beta vulgaris L., această abordare a fost aplicată și în producția de holotoxină termolabilă recombinantă de tip sălbatic de Escherichia coli și de adjuvanți vaccinali LT mutanți de Escherichia coli în Nicotiana tabacum, la care cele mai mari titruri sistemice de IgG specifice LT-B au fost detectate la păsări.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

Procedura generală pentru transferul de gene prin sonoporare în celulele vegetale

1. Pregătirea materialului genetic: Începeți prin a pregăti materialul genetic pe care doriți să îl introduceți în celulele vegetale. Acesta poate fi ADN plasmidic, ARN sau alți acizi nucleici.
2. Izolarea celulelor vegetale: Izolați celulele vegetale pe care doriți să le vizați. În funcție de experimentul dumneavoastră, aceste celule pot fi izolate din țesuturi sau culturi vegetale.
3. Suspensie celulară: Suspendați celulele vegetale într-un mediu sau tampon adecvat. Acest lucru este esențial pentru a vă asigura că celulele sunt sănătoase și într-o stare propice preluării genelor.
4. Configurați-vă sonicatorul: Pregătiți-vă sonicatorul cu sondă presetând parametri de sonicare precum amplitudinea, timpul, energia și temperatura. Scufundați sonda ultrasonică în suspensia celulară.
5. Sonicare: Începeți procedura de sonicare. Oscilația rapidă a vârfului sondei generează bule de cavitație în lichid. Aceste bule se dilată și se prăbușesc din cauza undelor ultrasonice, creând forțe mecanice și microcurenți în suspensie.
6. Sonoporare: Forțele mecanice și microcurenții generați de cavitație creează temporar pori și orificii în membranele celulelor vegetale. Materialul genetic prezent în suspensie poate pătrunde în celulele vegetale prin acești pori.
7. Incubare: După tratamentul de sonoporare, incubați celulele vegetale pentru a le permite să se refacă și să își stabilizeze membranele. Acesta este un pas crucial pentru a asigura supraviețuirea celulelor și transferul de gene reușit.

Transferul de gene prin Agrobacterium sau lipozomi

Există două forme comune de a transfecta celula vegetală. Acestea folosesc fie agrobacterium, un gen de bacterii Gram-negative, fie lipozomi ca purtător al materialului genetic.

• Sonoporare mediată de Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens este o bacterie folosită frecvent în ingineria genetică a plantelor. În această metodă, ADN-ul plasmidic care conține gena dorită este introdus în Agrobacterium, care este apoi amestecat cu celule vegetale. Suspensia celulară este supusă sonoporării folosind un sonicator cu sondă. Energia ultrasonică îmbunătățește transferul materialului genetic de la Agrobacterium la celulele vegetale. Această metodă este folosită pe scară largă pentru modificarea genetică a plantelor.
• Sonoporare mediată de lipozomi: Lipozomii sunt vezicule pe bază de lipide care pot transporta material genetic. În această metodă, lipozomii încărcați cu ADN plasmidic sau alți acizi nucleici sunt amestecați cu celule vegetale. Sonoporarea folosind un sonicator cu sondă este utilizată pentru a facilita preluarea lipozomilor de către celulele vegetale. Ultrasunetele dezintegrează bistraturile lipidice ale lipozomilor, eliberând materialul genetic în celulele vegetale. Această abordare este utilă pentru studiile de expresie genică tranzitorie în celulele vegetale.

Beneficii dovedite științific ale transformării mediate de Agrobacterium asistate de sonicare (SAAT)

Transformarea mediată de Agrobacterium asistată de sonicare (SAAT) a fost aplicată la numeroase specii de plante. Un tratament ultrasonic scurt și relativ blând al culturilor de celule vegetale provoacă sonoporarea, care permite ulterior o pătrundere profundă a Agrobacterium ca transportor de gene. Mai jos puteți citi studii exemplificative care demonstrează efectele benefice ale SAAT.

Transformarea asistată de ultrasunete a Ashwagandha

Pentru a îmbunătăți eficiența transformării la W. somnifera (cunoscută ca ashwagandha sau vișin de iarnă), Dehdashti și colegii (2016) au investigat utilizarea acetosiringonei (AS) și a sonicării.
Acetosiringona (AS) a fost adăugată în trei etape: cultura lichidă de Agrobacterium, infecția cu Agrobacterium și co-cultura explantelor cu Agrobacterium. Adăugarea a 75 μM AS la cultura lichidă de Agrobacterium s-a dovedit a fi optimă pentru inducerea genelor vir.
Aplicarea suplimentară a sonicării (SAAT) a dus la cea mai mare expresie genică. S-a constatat că expresia genei gusA în rădăcinile păroase a fost cea mai bună atunci când frunzele și vârfurile lăstarilor au fost sonicate timp de 10 și, respectiv, 20s. Eficiența transformării protocolului îmbunătățit a fost înregistrată la 66,5 și, respectiv, 59,5% în cazul explantelor de frunze și de vârfuri de lăstari. În comparație cu alte protocoale, eficiența transformării acestui protocol îmbunătățit s-a dovedit a fi de 2,5 ori mai mare pentru frunze și de 3,7 ori mai mare pentru vârfurile lăstarilor. Analizele Southern blot au confirmat 1–2 copii ale transgenei gusA în liniile W1-W4, în timp ce 1–4 copii ale transgenei au fost detectate în linia W5 generată de protocolul îmbunătățit.

Efectul duratei transformării mediate de Agrobacterium asistate de sonicare (SAAT) asupra frecvenței de transformare a explantelor de frunze (a) și vârfuri de lăstari (b) de W. somnifera
(studiu și grafic: © Dehdashti et al., 2016)

Transformarea asistată de ultrasunete a bumbacului

Hussain et al. (2007) demonstrează efectele benefice ale transformării bumbacului asistate de sonicare. Cavitația acustică provocată de ultrasunetele de joasă frecvență creează microrăni pe și sub suprafața țesutului vegetal (sonoporare) și permite Agrobacterium să pătrundă mai adânc și complet în tot țesutul vegetal. Acest mod de rănire crește probabilitatea de infectare a celulelor vegetale situate mai adânc în țesut. Pentru a evalua eficiența transformării SAAT, s-a măsurat expresia genei GUS. Sistemul raportor GUS este un sistem de gene raportoare, deosebit de util în biologia moleculară a plantelor și în microbiologie. Prin ajustarea diferiților parametri SAAT, expresia tranzitorie GUS în bumbac folosind embrioni maturi ca explant a fost îmbunătățită semnificativ. GUS a fost detectat pentru prima dată la 24h după incubarea explantelor, iar la 48h expresia GUS era foarte intensă, ceea ce a servit ca indicator util al transformării reușite a explantului de bumbac în urma transformării mediate de Agrobacterium asistate de sonicare (SAAT). Comparația diferitelor tehnici de transformare (și anume biolistică, Agro, BAAT, SAAT), transformarea mediată de Agrobacterium asistată de sonicare (SAAT) a arătat de departe cele mai bune rezultate ale transformării.

Alegerea procedurii de transformare pe baza expresiei tranzitorii a GUS. Transformarea mediată de Agrobacterium asistată de sonicare (SAAT) prezintă o expresie tranzitorie semnificativ mai mare.
(studiu și grafic: © Hussain et al., 2007)

Soluții ultrasonice de înaltă performanță pentru sonoporare și SAAT

Hielscher Ultrasonics are o experiență îndelungată în dezvoltarea și fabricarea de ultrasonicatoare de înaltă performanță pentru laboratoare, unități de cercetare, precum și pentru producție industrială cu capacități de procesare foarte mari. Pentru microbiologie și științele vieții, Hielscher oferă diverse soluții care să răspundă diferitelor cerințe necesare pentru țesuturi specifice și tratamentele acestora. Pentru ultrasonarea simultană a numeroase probe, Hielscher oferă UIP400MTP pentru plăci cu godeuri multiple, VialTweeter pentru sonicarea a până la 10 flacoane (de ex. tuburi Eppendorf) sau CupHorn ultrasonic. Ultrasonicatoarele cu sondă sunt disponibile de la 50 la 400 wați ca omogenizatoare de laborator, în timp ce sistemele industriale acoperă intervalul de putere de la 500 wați la 16kW.
Vă rugăm să ne contactați și să ne comunicați aplicația și cerințele dumneavoastră de proces. Personalul nostru cu experiență vă va recomanda cu plăcere cel mai potrivit ultrasonicator pentru procesul dumneavoastră biologic.
Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a ultrasonicatoarelor noastre: