Transformarea genetică în celulele vegetale folosind ultrasunete

Sonicare-asistată de Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) este o metodă eficientă de a infecta celulele plantelor cu gene străine folosind Agrobacterium ca transportor. Cavitația cu ultrasunete provoacă sonoporație, care poate fi descrisă ca micro-rănire vizată a țesutului vegetal. Prin intermediul acestor ultrasonically creează micro-răni, ADN și ADN vectori pot fi transportate eficient în matricea celulară.

sonoporație – Ultrasonically îmbunătățit transformarea celulelor

Atunci când ultrasunetele de joasă frecvență (aproximativ 20kHz) sunt aplicate suspensiilor celulare, efectele cavitației acustice determină o permeabilizare tranzitorie a membranei asupra țesuturilor celulare. Acest efect cu ultrasunete este cunoscut sub numele de sonoporation și este utilizat pentru transferul de gene în celule sau țesuturi.
Avantajele ultrasonication se bazează pe principiul său de lucru mecanic non-termic, ceea ce face sonicare adesea mai versatil și mai puțin dependent de tipurile de celule. Aplicarea versatilă a sonoporației deschide posibilitatea utilizării plantelor transgenice, care au un potențial semnificativ în bioproducerea proteinelor terapeutice umane complexe. Astfel de bioreactoare pe bază de plante pot fi ușor manipulate genetic, pot preveni contaminarea potențială cu agenți patogeni umani, nu dăunează bacteriilor care mediază transformarea (de exemplu, Agrobacterium) și sunt o metodă ieftină și eficientă de biosinteză.

Transformarea celulelor asistate cu ultrasunete

Sonicare este o tehnică care aplică unde cu ultrasunete de joasă frecvență pentru a agita particulele în soluție, pentru a amesteca soluții, crescând astfel rata de transfer de masă și dizolvare. În același timp, sonicare poate elimina gazele dizolvate din lichide. În transformarea plantelor, sonicare va provoca formarea de microwounds pe tesutul vegetal si de a spori livrarea de ADN gol în protoplast plante.

Pentru transformarea genetică, transformarea mediată de agrobacterie asistată de sonicare (SAAT) este metoda preferată și are o eficiență semnificativ mai mare decât sonicarea utilizată pentru a transfera ADN-ul gol și vectorii ADN direct în protoplast. Numeroase studii au demonstrat că sonicare asistată de Agrobacterium-mediate de transformare (SAAT) poate fi folosit pentru a induce perturbarea mecanică și formarea de răni pe celulele plantelor prin unde cu ultrasunete și cavitație acustică rezultată. Un scurt tratament cu ultrasunete creează micro-răni pe suprafața explantelor. Deoarece celulele rănite vor permite penetrarea Agrobacterium în partea mai profundă a țesuturilor vegetale, crescând astfel probabilitatea infectării celulelor vegetale. În plus, compușii fenolici secretați sporesc transformarea. Micro-rănile generate ultrasonically fac penetrarea explant de bacterii, de asemenea, mai fezabilă. SAAT a fost utilizat cu succes pentru transformarea genetică la speciile de plante considerate în special rezistente la Agrobacterium.
Fiind o metodă foarte simplă și ieftină, precum și îmbunătățirea semnificativă a transferului de gene mediat de Agrobacterium sunt avantajele majore ale SAAT. În afară de aplicarea cu succes a SAAT în transformarea Chenopodium rubrum L. și Beta vulgaris L., această abordare a fost aplicată și în producția de holotoxină labilă termică de tip sălbatic recombinantă Escherichia coli și adjuvanți ai vaccinului LT mutant Escherichia coli în Nicotiana tabacum, în care au fost detectate la păsări cele mai mari titruri sistemice de IgG specifice LT-B.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka și R. Baranski, 2014)

Procedura generală de transfer de gene prin sonoporație în celulele vegetale

1. Prepararea materialului genetic: Începeți prin pregătirea materialului genetic pe care doriți să îl introduceți în celulele plantei. Acesta ar putea fi ADN-ul plasmid, ARN-ul sau alți acizi nucleici.
2. Izolarea celulelor vegetale: Izolați celulele vegetale pe care doriți să le vizați. În funcție de experimentul dvs., aceste celule pot fi izolate din țesuturi sau culturi vegetale.
3. Suspensie celulară: Se suspendă celulele plantei într-un mediu adecvat sau într-un tampon. Acest lucru este esențial pentru a se asigura că celulele sunt sănătoase și într-o stare care să conducă la absorbția genelor.
4. Configurați-vă Sonicator: Pregătiți-vă sonicatorul de tip sondă prin sonicare parametrii de presetare, cum ar fi amplitudinea, timpul, energia și temperatura. Scufundați sonda ultrasonică în suspensia celulară.
5. Sonicare: Începeți procedura de sonicare. Oscilația rapidă a vârfului sondei generează bule de cavitație în lichid. Aceste bule se extind și se prăbușesc datorită undelor ultrasonice, creând forțe mecanice și microstreaming în suspensie.
6. Sonoporație: Forțele mecanice și microstreamingul generate de cavitație creează temporar pori și găuri în membranele celulelor plantei. Materialul genetic prezent în suspensie poate intra în celulele plantei prin acești pori.
7. Incubație: După tratamentul de sonoporație, incubați celulele plantei pentru a le permite să se recupereze și să-și stabilizeze membranele. Acesta este un pas crucial pentru a asigura supraviețuirea celulelor și transferul de gene cu succes.

Transfer de gene prin agrobacterie sau lipozomi

Există două forme comune pentru a transfecta celula vegetală. Ei folosesc fie agrobacterie, un gen de bacterii gram-negative, fie lipozomi ca purtător al materialului genetic.

• Sonoporație mediată de agrobacterii: Agrobacterium tumefaciens este o bacterie frecvent utilizată în ingineria genetică a plantelor. În această metodă, ADN-ul plasmidic care conține gena dorită este introdus în Agrobacterium, care este apoi amestecat cu celule vegetale. Suspensia celulară este supusă sonoporației folosind un sonicator de tip sondă. Energia cu ultrasunete îmbunătățește transferul materialului genetic de la Agrobacterium la celulele vegetale. Această metodă este utilizată pe scară largă pentru modificarea genetică a plantelor.
• Sonoporație mediată de lipozomi: Lipozomii sunt vezicule pe bază de lipide care pot transporta material genetic. În această metodă, lipozomii încărcați cu ADN plasmidic sau alți acizi nucleici sunt amestecați cu celule vegetale. Sonoporarea folosind un sonicator de tip sondă este utilizată pentru a facilita absorbția lipozomilor de către celulele vegetale. Ecografia perturbă bistraturile lipidice ale lipozomilor, eliberând materialul genetic în celulele plantei. Această abordare este utilă pentru studiile tranzitorii de expresie genică în celulele vegetale.

Beneficiile dovedite științific ale transformării mediate de agrobacterie asistată de sonicare (SAAT)

Sonicare-asistate agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) a fost aplicat la numeroase specii de plante. Un tratament cu ultrasunete scurt și relativ ușor al culturilor de celule vegetale provoacă sonoporație, care permite ulterior o penetrare profundă a Agrobacterium ca transportor de gene. Mai jos puteți citi studii exemplare care demonstrează efectele benefice ale SAAT.

Ultrasonically-asistate de transformare de ashwagandha

Pentru a îmbunătăți eficiența transformării în W. somnifera (cunoscută sub numele de ashwagandha sau cireș de iarnă), Dehdashti și colegii (2016) au investigat utilizarea acetosyringonei (AS) și sonicare.
Acetosiringonul (AS) a fost adăugat în trei etape: cultura lichidă Agrobacterium, infecția cu Agrobacterium și co-cultura explantelor cu Agrobacterium. Adăugarea a 75 μM AS la cultura lichidă Agrobacterium s-a dovedit a fi optimă pentru inducerea genelor vir.
Aplicarea suplimentară a sonicare (SAAT) a dus la cea mai mare expresie genică. Expresia genei gusA în rădăcinile păroase sa dovedit a fi cea mai bună atunci când frunzele și vârfurile de tragere au fost sonicate pentru 10 și, respectiv, 20 de ani. Eficiența de transformare a protocolului îmbunătățit a fost înregistrată la 66,5% și 59,5% în cazul explantelor frunzelor și, respectiv, vârfurilor lăstarilor. În comparație cu alte protocoale, eficiența de transformare a acestui protocol îmbunătățit s-a dovedit a fi de 2,5 ori mai mare pentru frunze și de 3,7 ori mai mare pentru vârfurile de tragere. Analizele southern blot au confirmat 1-2 copii ale transgenei gusA în liniile W1-W4, în timp ce 1-4 copii transgene au fost detectate în linia W5 generată de protocolul îmbunătățit.

Efectul duratei de sonicare-asistată de Agrobacterium- medierea transformării (SAAT) pe frecvența de transformare a frunzei W. somnifera (a) și vârful trage (b) explante
(studiu și grafic: © Dehdashti et al., 2016)

Transformarea ultrasonically asistată de bumbac

Hussain et al. (2007) demonstrează efectele benefice ale transformării bumbacului asistat de sonicare. Cavitația acustică cauzată de ultrasunetele de joasă frecvență creează micro-răni pe și sub suprafața țesutului vegetal (sonoporație) și permite Agrobacterium să călătorească mai adânc și complet în țesutul vegetal. Acest mod de rănire crește probabilitatea infectării celulelor vegetale situate mai adânc în țesut. Pentru a evalua eficiența transformării SAAT, a fost măsurată expresia genei GUS. Sistemul reporter GUS este un sistem genetic reporter, deosebit de util în biologia moleculară a plantelor și microbiologie. Ajustarea diferiților parametri SAAT, expresia tranzitorie GUS în bumbac folosind embrioni maturi ca explant a fost îmbunătățită semnificativ. GUS a fost detectat pentru prima dată la 24 de ore după incubarea explantelor și la 48 de ore, expresia GUS a fost foarte intensă, ceea ce a servit ca un indicator util al transformării cu succes a explantei de bumbac după transformarea mediată de Agrobacterium asistată de sonicare (SAAT). Compararea diferitelor tehnici de transformare (și anume biolistice, Agro, BAAT, SAAT), transformarea mediată de Agrobacterium asistată sonicare (SAAT) a arătat de departe cele mai bune rezultate ale transformării.

Alegerea procedurii de transformare pe baza exprimării tranzitorii a GUS. Transformarea mediată de Agrobacterium asistată de sonicare (SAAT) arată o expresie tranzitorie semnificativ mai mare.
(studiu și grafic: © Hussain et al., 2007)

Soluții cu ultrasunete de înaltă performanță pentru sonoporație și SAAT

Hielscher Ultrasonics este cu experiență îndelungată în dezvoltarea și fabricarea ultrasonicators de înaltă performanță pentru laboratoare, facilități de cercetare, precum și producția industrială cu randamente foarte mari. Pentru microbiologie și știința vieții, Hielscher oferă diverse soluții pentru a satisface diferite cerințe necesare pentru țesuturi specifice și tratamentele lor. Pentru ultrasonication simultană a numeroase probe Hielscher oferă UIP400MTP pentru plăci multiwell, VialTweeter pentru sonicare de până la 10 flacoane (de exemplu, tuburi Eppendorf) sau cu ultrasunete CupHorn. Ultrasonicators tip sondă sunt disponibile de la 50 la 400 wați ca omogenizatoare de laborator, în timp ce sistemele industriale acoperă gama de putere de la 500 wați la 16kW.
Vă rugăm să luați legătura cu noi și să ne informați despre cerințele dvs. de aplicare și proces. Personalul nostru bine experimentat va fi bucuros să recomande cel mai potrivit ultrasonicator pentru procesul biologic.
Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității aproximative de procesare a ultrasonicators noastre: