Transformarea genetică în celulele plantelor folosind Ultrasonics

Transformarea mediată a agrobacteriei asistate de sonicare (SAAT) este o metodă eficientă de a infecta celulele plantelor cu gene străine folosind Agrobacterium ca transportator. Cavitația cu ultrasunete provoacă sonoporație, care poate fi descrisă ca micro-rănire țintită a țesutului vegetal. Prin intermediul acestor ultrasonically creează micro-răni, ADN-ul și vectorii ADN-ului pot fi transportate eficient în matricea celulară.

sonoporation – Ultrasonically îmbunătățită transformarea celulelor

Ultrasonicator UP100H este un omogenizator de laborator adesea folosit pentru pregătirea probei de plăci de cultură celulară.Când ultrasunetele de joasă frecvență (aproximativ 20kHz) sunt aplicate suspensiilor celulare, efectele cavitației acustice determină o permeabilizare tranzitorie a membranei asupra țesuturilor celulare. Acest efect cu ultrasunete este cunoscut sub numele de sonoporation și este utilizat pentru transferul de gene în celule sau țesuturi.
Avantajele ultrasonication se bazează pe principiul său de lucru mecanic non-termic, ceea ce face sonicare adesea mai versatil și mai puțin dependente de tipurile de celule. Aplicarea versatilă a sonoporației deschide posibilitatea utilizării plantelor transgenice, care au un potențial semnificativ în bioproducția proteinelor terapeutice umane complexe. Astfel de bioreactoare pe bază de plante pot fi ușor manipulate genetic, pot preveni contaminarea potențială cu agenți patogeni umani, nu dăunează transformării bacteriilor care mediază (de exemplu Agrobacterium) și sunt o metodă ieftină și eficace de bio-sinteză.

Cerere de informatie





Videoclipul arată sistemul de pregătire a probelor cu ultrasunete UIP400MTP, care permite pregătirea fiabilă a probelor de orice plăci standard multi-bine folosind ultrasunete de mare intensitate. Aplicațiile tipice ale UIP400MTP includ liza celulară, ADN-ul, ARN-ul și forfecarea cromatinei, precum și extracția proteinelor.

Ultrasonicator UIP400MTP pentru sonicare placă multi-bine

Miniatură video

Transformarea celulelor ultrasonic-assisted

Ultrasonicators de tip sondă, cum ar fi UP200St sunt omogenizatoare de țesut fiabile și utilizate pe scară largă pentru pregătirea probei în genetică, de exemplu, pentru Sonicare-Asistată Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT).Sonicare este o tehnică care aplică undele cu ultrasunete de joasă frecvență pentru a agita particulele în soluție, pentru a amesteca soluții, crescând astfel rata de transfer de masă și dizolvare. Simultan, sonicare poate elimina gazele dizolvate din lichide. În transformarea plantelor, sonicare va provoca formarea de microwounds pe țesutul vegetal și de a spori livrarea de ADN gol în protoplastul plantei.

Pentru transformarea genetică, transformarea mediată de Agrobacterium asistată de Sonicare (SAAT) este metoda preferată și are o eficiență semnificativ mai mare decât sonicare utilizate pentru a transfera ADN-ul gol și vectorii ADN-ului direct în protoplast. Numeroase studii au demonstrat că sonicare asistată Agrobacterium-mediate de transformare (SAAT) poate fi folosit pentru a induce întreruperea mecanică și formarea rănilor pe celulele plantelor prin undele cu ultrasunete și cavitația acustică rezultată. Un scurt tratament cu ultrasunete creează micro-răni pe suprafața explantelor. Deoarece celulele rănite vor permite penetrarea Agrobacterium în partea mai profundă a țesuturilor plantelor, crescând astfel probabilitatea ca celulele plantelor să fie infectate. În plus, compușii fenolici secretați sporesc transformarea. Micro-rănile generate cu ultrasunete fac ca penetrarea explantelor de către bacterii să fie, de asemenea, mai fezabilă. SAAT a fost utilizat cu succes pentru transformarea genetică la speciile de plante considerate în special ca fiind rezistente la Agrobacterium.
Fiind o metodă foarte simplă și ieftină, precum și îmbunătățirea semnificativă a transferului de gene mediate de Agrobacterium sunt avantajele majore ale SAAT. În afară de aplicarea cu succes a SAAT în transformarea Chenopodium rubrum L. și Beta vulgaris L., această abordare a fost aplicată și în producția de holotoxine labile de căldură-labile de tip sălbatic Escherichia coli recombinante și adjuvanți ai vaccinului LT mutant Escherichia coli în Nicotiana tabacum, în care au fost detectate cele mai mari titruri igG sistemice specifice LT-B la păsări.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka și R. Baranski, 2014)

VialTweeter poate fi utilizat pentru infecția cu ADN a celulelor planului, de exemplu, folosind Agrobacterium asistată de sonicare- transformare mediată (SAAT)

VialTweeter pentru sonicarea simultană a mai multor tuburi de probă, de exemplu, pentru agrobacterie asistată de sonicare- transformare mediată (SAAT)

Procedura generală de transfer de gene prin sonoporație în celulele vegetale

  1. Prepararea materialului genetic: Începeți prin pregătirea materialului genetic pe care doriți să îl introduceți în celulele plantei. Acesta ar putea fi ADN-ul plasmid, ARN-ul sau alți acizi nucleici.
  2. Izolarea celulelor vegetale: Izolați celulele vegetale pe care doriți să le vizați. În funcție de experimentul dvs., aceste celule pot fi izolate din țesuturi sau culturi vegetale.
  3. Suspensie celulară: Se suspendă celulele plantei într-un mediu adecvat sau într-un tampon. Acest lucru este esențial pentru a se asigura că celulele sunt sănătoase și într-o stare care să conducă la absorbția genelor.
  4. Configurați-vă Sonicator: Pregătiți-vă sonicatorul de tip sondă prin sonicare parametrii de presetare, cum ar fi amplitudinea, timpul, energia și temperatura. Scufundați sonda ultrasonică în suspensia celulară.
  5. sonicare: Începeți procedura de sonicare. Oscilația rapidă a vârfului sondei generează bule de cavitație în lichid. Aceste bule se extind și se prăbușesc datorită undelor ultrasonice, creând forțe mecanice și microstreaming în suspensie.
  6. Sonoporație: Forțele mecanice și microstreamingul generate de cavitație creează temporar pori și găuri în membranele celulelor plantei. Materialul genetic prezent în suspensie poate intra în celulele plantei prin acești pori.
  7. Incubație: După tratamentul de sonoporație, incubați celulele plantei pentru a le permite să se recupereze și să-și stabilizeze membranele. Acesta este un pas crucial pentru a asigura supraviețuirea celulelor și transferul de gene cu succes.

Transfer de gene prin agrobacterie sau lipozomi

Există două forme comune pentru a transfect celula vegetală. Ei folosesc fie agrobacterie, un gen de bacterii gram-negative, fie lipozomi ca purtător al materialului genetic.

  • Sonoporație mediată de agrobacterii: Agrobacterium tumefaciens este o bacterie frecvent utilizată în ingineria genetică a plantelor. În această metodă, ADN-ul plasmidic care conține gena dorită este introdus în Agrobacterium, care este apoi amestecat cu celule vegetale. Suspensia celulară este supusă sonoporației folosind un sonicator de tip sondă. Energia cu ultrasunete îmbunătățește transferul materialului genetic de la Agrobacterium la celulele vegetale. Această metodă este utilizată pe scară largă pentru modificarea genetică a plantelor.
  • Sonoporație mediată de lipozomi: Lipozomii sunt vezicule pe bază de lipide care pot transporta material genetic. În această metodă, lipozomii încărcați cu ADN plasmidic sau alți acizi nucleici sunt amestecați cu celule vegetale. Sonoporarea folosind un sonicator de tip sondă este utilizată pentru a facilita absorbția lipozomilor de către celulele vegetale. Ecografia perturbă bistraturile lipidice ale lipozomilor, eliberând materialul genetic în celulele plantei. Această abordare este utilă pentru studiile tranzitorii de expresie genică în celulele vegetale.

Beneficiile dovedite științific ale transformării agrobacterii asistate de sonicare (SAAT)

Sonicare-asistate Agrobacterium-mediate transformare (SAAT) a fost aplicat la numeroase specii de plante. Un tratament cu ultrasunete scurt și relativ ușor al culturilor de celule vegetale provoacă sonoporare, care permite ulterior o penetrare profundă a Agrobacterium ca transportator de gene. Mai jos puteți citi studii exemplare care demonstrează efectele benefice ale SAAT.

Sonicator UP200Ht cu micro-vârf pentru transfecția celulelor vegetale cu gene prin sonoporație

Sonicator UP200Ht pentru transfecția genică prin sonoporație

Cerere de informatie





Transformarea ultrasonically asistată de Ashwagandha

Pentru a îmbunătăți eficiența transformării în W. somnifera (cunoscut sub numele de ashwagandha sau cireșe de iarnă), Dehdashti și colegii (2016) au investigat utilizarea acetosiringonei (AS) și sonicare.
Acetosiringona (AS) a fost adăugată în trei etape: cultura lichidă Agrobacterium, infecția cu Agrobacterium și co-cultura explantelor cu Agrobacterium. Adăugarea a 75 μM AS la cultura lichidă Agrobacterium s-a dovedit a fi optimă pentru inducerea genelor vir.
Aplicarea suplimentară a sonicare (SAAT) a dus la cea mai mare expresie genică. Expresia genei gusA în rădăcini păroase s-a dovedit a fi cea mai bună atunci când frunzele și vârfurile de lăstari au fost sonicate timp de 10 și, respectiv, 20 de ani. Eficiența de transformare a protocolului îmbunătățit a fost înregistrată de 66,5, respectiv 59,5% în cazul explantelor cu frunze și vârfuri de lăstari. În comparație cu alte protocoale, eficiența de transformare a acestui protocol îmbunătățit s-a dovedit a fi de 2,5 ori mai mare pentru frunze și de 3,7 ori mai mult pentru vârfurile de tragere. Analizele southern blot au confirmat 1-2 copii ale transgenei gusA în liniile W1-W4, în timp ce 1-4 copii transgene au fost detectate în linia W5 generată de protocolul îmbunătățit.

Durata sonicare (timpul expus la ultrasunete) afectează Agrobacterium asistat de sonicare- transformare mediată (SAAT) privind transformarea în W. somnifera

Efectul duratei de sonicare asistată Agrobacterium- transformare mediată (SAAT) asupra frecvenței de transformare a frunzei W. somnifera (a) și trage vârful (b) explante
(studiu și grafic: © Dehdashti et al., 2016)

Sonicatorii ca UP200St sunt utilizați pentru a pregăti material genetic, cum ar fi ADN, ARN, miARN și transfecția genică ulterioară prin sonoporație. Sonoporația permite transfecția celulelor vegetale cu material genetic folosind agrobacterie.

Omogenizator de tip sondă UP200St pentru sonoporație și transfecție genică

Transformarea ultrasonically asistată de bumbac

Hussain et al. (2007) demonstrează efectele benefice ale transformării bumbacului asistat de sonicare. Cavitația acustică cauzată de ultrasunetele de joasă frecvență creează micro-răni pe și sub suprafața țesutului vegetal (sonoporație) și permite Agrobacterium să călătorească mai adânc și complet în întregul țesut al plantei. Acest mod de rănire crește probabilitatea de a infecta celulele plantelor situate mai adânc în țesut. Pentru a evalua eficiența transformării SAAT, a fost măsurată expresia genei GUS. Sistemul de raportare GUS este un sistem genetic reporter, deosebit de util în biologia moleculară a plantelor și microbiologie. Ajustând diferiți parametri SAAT, expresia tranzitorie GUS în bumbac folosind embrioni maturi ca explant a fost îmbunătățită semnificativ. GUS a fost detectat pentru prima dată 24h după incubarea explantelor și de 48h, expresia GUS a fost foarte intensă, ceea ce a servit ca un indicator util al transformării cu succes a explantului de bumbac în urma transformării mediate agrobacterium asistate de sonicare (SAAT). Comparația diferitelor tehnici de transformare (și anume biolistică, Agro, BAAT, SAAT), transformarea agrobacterie asistată de sonicare (SAAT) a arătat de departe cele mai bune rezultate ale transformării.

Transformarea mediată de Agrobacterium asistată de sonicare (SAAT) arată o expresie tranzitorie semnificativ mai mare în comparație cu metodele alternative de infecție.

Alegerea procedurii de transformare pe baza expresiei tranzitorii a GUS. Transformarea mediată agrobacterie asistată de sonicare (SAAT) arată o expresie tranzitorie semnificativ mai mare.
(studiu și grafic: © Hussain et al., 2007)

 

Acest tutorial explică ce tip de sonicator este cel mai bun pentru sarcinile de pregătire a probei, cum ar fi liza, întreruperea celulelor, izolarea proteinelor, fragmentarea ADN-ului și ARN în laboratoare, analiză și cercetare. Alegeți tipul sonicator ideal pentru aplicația dvs., volumul eșantionului, numărul eșantionului și debitul. Hielscher Ultrasonics are omogenizatorul cu ultrasunete ideal pentru tine!

Cum să găsiți sonicatorul perfect pentru întreruperea celulelor și extracția proteinelor în știință și analiză

Miniatură video

 

Soluții cu ultrasunete de înaltă performanță pentru sonoporare și SAAT

Hielscher Ultrasonics este mult timp cu experiență în dezvoltarea și fabricarea de ultrasonicators de înaltă performanță pentru laboratoare, facilități de cercetare, precum și producția industrială cu debite foarte mari. Pentru microbiologie și știința vieții, Hielscher oferă diverse soluții pentru a se potrivi diferitelor cerințe necesare pentru țesuturi specifice și tratamentele lor. Pentru ultrasonication simultană a numeroase probe Hielscher oferă UIP400MTP pentru plăci multiwell, VialTweeter pentru sonicare de până la 10 flacoane (de exemplu, tuburi Eppendorf) sau CupHorn cu ultrasunete. Ultrasonicators de tip sondă sunt disponibile de la 50 la 400 wați ca omogenizatoare de laborator, în timp ce sistemele industriale acoperă gama de putere de la 500 wați la 16kW.
Vă rugăm să luați legătura cu noi și să ne informați despre cerințele dumneavoastră de aplicare și proces. Personalul nostru bine-experimentat va fi bucuros să recomande ultrasonicator cel mai potrivit pentru procesul dumneavoastră biologic.
Tabelul de mai jos vă oferă o indicație a capacității de procesare aproximativă a ultrasonicators noastre:

volum lot Debit Aparate recomandate
plăci multiwell / microtiter N / A. UIP400MTP
până la 10 flacoane N / A. VialTweeter
până la 5 flacoane/tuburi sau 1 vas mai mare N / A. CupHorn
1 la 500mL 10 până la 200 ml / min UP100H
10 la 2000ml 20 până la 400ml / min Uf200 ः t. UP400St
0.1 la 20L 0.2 4L / min UIP2000hdT
10 100L 2 până la 10L / min UIP4000hdT
N / A. 10 la 100L / min UIP16000
N / A. mai mare grup de UIP16000

Contacteaza-ne! / Intreaba-ne!

Cere mai multe informații

Vă rugăm să completați formularul de mai jos pentru a solicita informații suplimentare despre ultrasonicators noastre, aplicațiile lor și prețul. Vom fi bucuroși să discutăm procesul cu tine și să vă oferim un sistem cu ultrasunete care îndeplinește cerințele dvs.!









Vă rugăm să rețineți Politica de confidentialitate.



Omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă forfecare sunt utilizate în laborator, banc-top, pilot și prelucrare industrială.

Hielscher Ultrasonics produce omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă performanță pentru amestecarea aplicațiilor, dispersie, emulsificare și extracție pe scară de laborator, pilot și industrial.



Literatură / Referințe


Ultrasunete de înaltă performanță! Gama de produse Hielscher acoperă întregul spectru de la ultrasonicator de laborator compact peste unități de banc-top la sisteme cu ultrasunete complet industriale.

Hielscher Ultrasonics produce omogenizatoare cu ultrasunete de înaltă performanță de la laborator la dimensiunea industrială.


Vom fi bucuroși să discutăm despre procesul dvs.

Să intrăm în contact.