Augstas caurlaidspējas parauga sagatavošana mitohondriju diagnostikai
Mitohondriju diagnostika pētniecībā un klīnikās tiek veikta, izmantojot dažādas metodes, piemēram, sekvencēšanu, PCR un bioķīmiskos testus. Šīs metodes izmanto, lai identificētu DNS mutācijas un izmērītu mitohondriju funkciju. Sekvencēšana palīdz noteikt ģenētiskās mutācijas, savukārt PCR var kvantificēt specifiskas DNS sekvences. Bioķīmiskie testi novērtē mitohondriju proteīnu un fermentu funkcionalitāti.
Mitohondriju slimību diagnostika ir īpaši sarežģīta šo slimību izteiktās klīniskās mainības dēļ, kā arī sarežģītās mijiedarbības dēļ starp diviem atšķirīgi iedzimtiem genomiem: mitohondriju DNS (mtDNS) un kodola genomu.
DNS ekstrakcija un sadrumstalotība, izmantojot ultraskaņu
DNS ekstrakcija no muskuļu audiem ir īpaši noderīga, ja ir aizdomas par audiem specifiskām mtDNS izmaiņām. Šīs izmaiņas var ietvert mtDNS delēcijas hroniskas progresējošas ārējas oftalmoplēģijas (CPEO) gadījumā, mtDNS punktveida mutācijas mitohondriju miopātijās vai mtDNS izsīkumu Alpersa sindroma gadījumā. DNS, kas iegūta no muskuļu audiem, pēc tam var izmantot dažādiem ģenētiskiem testiem, piemēram, dienvidu plankumainībai un liela attāluma PCR delēcijām, reāllaika PCR izsīkumam vai punktu mutāciju sekvencēšanai.
Ultraskaņas apstrāde, izmantojot intensīvus ultraskaņas viļņus, tiek izmantota vairākiem lietojumiem mitohondriju diagnostikā. To lieto, lai lizētu šūnas, lai ekstrahētu intracelulāro saturu, piemēram, mitohondrijus un DNS, lai nobīdītu DNS, piemēram, mtDNS un nDNS sekvencēšanai, un homogenizētu paraugus.
UIP400MTP Plate Sonicator augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošanai vienmērīgi apstrādā paraugus vairāku iedobju un 96 urbumu plāksnēs
Kā izolēt mitohondrijus no šūnām un audiem
Mitohondriju izolācija sastāv no diviem būtiskiem soļiem: šūnu izjaukšanas, lai atbrīvotu to saturu, un diferenciālās centrifugēšanas izmantošana, lai atdalītu un atgūtu mitohondriju frakcijas.
Ultraskaņas apstrāde
Hielscher ultraskaņas aparāti ir saderīgi ar standarta līzes buferiem un komplektiem, padarot tos piemērotus mitohondriju izolācijai. Ultraskaņas apstrāde kalpo diviem galvenajiem mērķiem:
- Šūnu līze: Ultraskaņas viļņi traucē šūnu membrānas, atbrīvojot intracelulāro saturu.
- Mitohondriju traucējumi: Ultraskaņas apstrāde nākamajā solī var atvērt mitohondrijus, lai atbrīvotu mitohondriju proteīnus vai mitohondriju DNS.
- mtDNS fragmentācija: Ultraskaņas apstrāde ir uzticama metode mitohondriju DNS bīdīšanai sekvencēšanai.
Vairāku urbumu plāksnes ultraskaņas UIP400MTP ļauj sagatavot augstas caurlaidspējas paraugu mitohondriju paraugus. Kopā ar diferenciālo centrifugēšanu ultraskaņas apstrāde uzlabo mitohondriju izolācijas efektivitāti, nodrošinot augstu neskartu mitohondriju ražu, kas piemērota dažādiem pakārtotiem lietojumiem.
Hielscher UIP400MTP daudzviet plāksnes sonikators Darbojas ar jebkuru standarta plāksni
Vairāku urbumu plates ultraskaņas UIP400MTP piedāvā daudzas priekšrocības augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošanai, piemēram, mitohondriju diagnostikā.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošanai biomarķieru diagnostikā.
Parauga instrukcijas ultraskaņas mtDNS fragmentācijai
Sagatavošana un ekstrakcija:
- C57BL/6 peles tika nogalinātas dzemdes kakla dislokācijas dēļ.
- Aknas tika ātri ekstrahētas un mazgātas ledusaukstā sterilā PBS.
Mitohondriju izolācija:
- Mitohondriji tika izolēti, izmantojot 2 ml Dounce audu dzirnaviņas un mitohondriju izolācijas komplektu audiem.
- Sākotnējā centrifugēšana pie 700× g un 3 000× g.
- Veiciet divas papildu mazgāšanas darbības ar C buferi.
DNS izolācija:
- Granulas no pirmās centrifugēšanas pie 700× g tika izmantotas, lai izolētu kodola DNS (nDNS).
- DNS tika izolēta, izmantojot centrifūgas kolonnas.
- Mitohondriju DNS (mtDNS) tika iegūta no izolētiem mitohondrijiem.
- Kodola DNS (nDNS) tika iegūta no neapstrādātiem kodola ekstraktiem, gan no peļu aknu audiem.
DNS fragmentācija:
- DNS tika sadrumstalota uz ledus, izmantojot 30 kHz / 50 W ultraskaņas sonikatoru UP50H ar 0,5 mm mikro galu sonotrodu pie 14 μm 2 × 30 sekundes.
Fragmentācijas vizualizācija un kvantificēšana:
- Fragmentācija pēc ultrasonifikācijas tika vizualizēta uz 1% agarozes gēla ar SYBR drošu DNS krāsvielu.
- MtDNS un nDNS relatīvo daudzumu noteica ar qPCR.
(sal.: Mariero et al., 2019)
Augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošanai vairāku urbumu plāksnes ultraskaņas UIP400MTP atvieglo lielu paraugu skaitu sagatavošanu standarta 96 urbumu, vairāku urbumu un mikrotitru plāksnēs.
Lasiet vairāk par augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošanas priekšrocībām, izmantojot UIP400MTP!
Padomi optimālai mitohondriju izolācijai, izmantojot ultraskaņu:
- Temperatūras kontrole: Veiciet visas darbības temperatūras diapazonā no 0 ° C līdz 4 ° C. Tas ir ļoti svarīgi, lai saglabātu mitohondriju integritāti un funkcionalitāti.
- Efektivitāte un ātrums: Strādājiet ātri un attīriet mitohondrijus tikai tiktāl, ciktāl tas nepieciešams jūsu konkrētajam lietojumam. Pārmērīga manipulācija var izraisīt ievērojamus mitohondriju satura zudumus.
- Suspensiju atšķaidīšana: Uzturēt zemu šūnu un organellu suspensiju koncentrāciju visā izolācijas procesā. Tas palīdz samazināt slazdošanas un aglutinācijas risku, tādējādi uzlabojot izolēto mitohondriju tīrību.
- Parauga tilpums: Izvēlieties vairākus maza mēroga preparātus, nevis vienu lielu. Šī pieeja parasti nodrošina labāku ražu, jo palielināšana proporcionāli nepalielina atgūstamo mitohondriju daudzumu. Vairāku urbumu plāksnes ultraskaņas UIP400MTP atvieglo ātru un uzticamu šūnu līzi mitohondriju izolācijai, kā arī olbaltumvielu ekstrakciju no mitohondrijiem.
Šīs vadlīnijas padarīs izolācijas procesu, izmantojot ultraskaņas līzi un centrifugēšanu, efektīvāku, iegūstot augstas kvalitātes mitohondriju preparātus, kas piemēroti pakārtotiem lietojumiem.
Hielscher Sonicators – Kvalitāte ražots Vācijā
Hielscher ultrasonikatori ir labi pazīstami ar saviem augstākajiem kvalitātes un dizaina standartiem. Robustums un viegla darbība ļauj vienmērīgi integrēt mūsu ultrasonikatorus rūpnieciskajās iekārtās. Hielscher ultrasonikatori viegli apstrādā neapstrādātus apstākļus un prasīgu vidi.
Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums un īpašu uzsvaru liek uz augstas veiktspējas ultrasonikatoriem, kas piedāvā vismodernākās tehnoloģijas un lietotājdraudzīgumu. Protams, Hielscher ultrasonikatori atbilst CE prasībām un atbilst UL, CSA un RoHs prasībām.
96 urbumu plāksnes ultraskaņas UIP400MTP mikrotitru un multiwell plākšņu apstrādei ar ultraskaņu
Literatūra / Atsauces
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Bieži uzdotie jautājumi par mitohondrijiem un mitohondriju diagnostiku
Kas ir mitohondriji?
Mitohondriji ir ar membrānu saistīti organellas, kas atrodamas vairuma eikariotu organismu šūnās. Tās ir pazīstamas kā šūnas spēkstacijas, jo tās ražo enerģiju adenozīna trifosfāta (ATP) veidā, izmantojot šūnu elpošanas procesu. Turklāt mitohondrijiem ir sava DNS, un tiem ir galvenā loma citos šūnu procesos, tostarp šūnu cikla regulēšanā un šūnu nāvē.
Kas atšķir mtDNS no genoma DNS?
Mitohondriju DNS (mtDNS) atšķiras no genoma DNS (gDNS) vairākos galvenajos veidos. MtDNS atrodas mitohondrijos, ir apļveida un ir mātes iedzimta, savukārt gDNS atrodas šūnas kodolā, ir lineāra un tiek mantota no abiem vecākiem. MtDNS ir daudz mazāka, kodējot tikai 37 gēnus, bet gDNS satur aptuveni 20 000-25 000 gēnu. MtDNS ir vairākās kopijās uz vienu šūnu, tai ir augstāks mutāciju ātrums un galvenokārt kodi proteīniem, kas iesaistīti mitohondriju funkcijā. Turpretī gDNS parasti ir diploīds, tam ir zemāks mutāciju ātrums, un tas kodē plašu gēnu klāstu, kas nepieciešams organisma attīstībai un funkcijai. Turklāt mtDNS transkripcija un translācija notiek mitohondrijos, bet gDNS transkripcija notiek kodolā, un translācija notiek citoplazmā. Šīs atšķirības atspoguļo to atšķirīgās lomas un evolūcijas izcelsmi.
Kas ir bezšūnu ekstrakts?
Bezšūnu ekstrakts ir šķīdums, kas satur lizētu šūnu saturu, ieskaitot olbaltumvielas, nukleīnskābes un citus šūnu komponentus, bet bez neskartām šūnu membrānām. Šo ekstraktu izmanto bioķīmiskajos un molekulārās bioloģijas pētījumos, lai pētītu šūnu procesus in vitro, ļaujot pētniekiem analizēt reakcijas un mehānismus ārpus dzīvām šūnām.
Kāda loma spēlē PCR testiem mitohondriju diagnostikā?
PCR testiem ir izšķiroša loma mitohondriju diagnostikā, ļaujot noteikt mutācijas, delēcijas vai kopiju skaita variācijas mitohondriju DNS (mtDNS). Tie ļauj pastiprināt specifiskus mtDNS reģionus, lai identificētu patogēnus variantus, kas saistīti ar mitohondriju traucējumiem. Uz PCR balstītas metodes, piemēram, kvantitatīvs PCR (qPCR) un liela attāluma PCR, tiek izmantotas arī, lai novērtētu mtDNS integritāti, heteroplazmas līmeni un mtDNS izsīkumu, sniedzot būtisku ieskatu mitohondriju funkcijās un slimībās.
Uzziniet, kā UIP400MTP Microplate Sonicator atvieglo PCR testus un testus!
Kas ir diferenciālā centrifugēšana?
Diferenciālā centrifugēšana ir plaši izmantota metode šūnu frakcionēšanai un mitohondriju izolācijai. Šī metode atdala šūnu struktūras, pamatojoties uz to sedimentācijas koeficientu, kas ir atkarīgs gan no blīvuma, gan formas. Process ietver dažāda līmeņa centrbēdzes spēka piemērošanu paraugiem sāls buferšķīdumos ar noteiktu blīvumu. Struktūras ar līdzīgiem sedimentācijas koeficientiem vienlaicīgi nosēdīsies savākšanas caurules apakšā, ļaujot tām atgūties.
Kā diferenciālo centrifugēšanu izmanto mitohondriju izolācijai?
Diferenciālā centrifugēšana ļauj pētniekiem efektīvi atdalīt mitohondriju frakcijas no citiem šūnu komponentiem. Mitohondriju izolēšana ietver vairākus centrifugēšanas posmus un sekojošu izolāta atjaunošanos.
Sākotnējā centrifugēšana: Uzklājiet zemu centrbēdzes spēku, lai nogulsnētu lielus šūnu atkritumus un kodolus.
turpmākās centrifugēšanas: Pakāpeniski palielina centrbēdzes spēku līdz granulu frakcijām, kas bagātinātas ar mitohondrijiem. Katrā centrifugēšanas posmā tiek noņemtas struktūras ar pakāpeniski augstākiem sedimentācijas koeficientiem.
Frakcijas atgūšana: Pēc katras centrifugēšanas granulveida nogulšņu savāc, un centrifugātu pakļauj lielākiem g-spēkiem, lai izolētu nākamo frakciju. To atkārto, līdz tiek sasniegta vēlamā mitohondriju tīrība.