Paraugu sagatavošana ar augstu caurlaidspēju mitohondriju diagnostikai
Mitohondriju diagnostiku pētniecībā un klīnikās veic, izmantojot dažādas metodes, piemēram, sekvenēšanu, PCR un bioķīmiskās analīzes. Šīs metodes izmanto, lai identificētu DNS mutācijas un novērtētu mitohondriju darbību. Sekvenēšana palīdz noteikt ģenētiskās mutācijas, savukārt PCR ļauj kvantitatīvi noteikt specifiskas DNS sekvences. Bioķīmiskās analīzes ļauj novērtēt mitohondriju olbaltumvielu un enzīmu funkcionalitāti.
Mitohondriālo slimību diagnostika ir īpaši sarežģīta šo slimību izteiktās klīniskās mainības, kā arī sarežģītās mijiedarbības dēļ starp diviem atšķirīgi pārmantotiem genomiem: mitohondriju DNS (mtDNA) un kodola genomu.
DNS ekstrakcija un fragmentēšana, izmantojot apstrādi ar ultraskaņu
DNS ekstrakcija no muskuļaudiem ir īpaši noderīga, ja ir aizdomas par audiem specifiskām mtDNA izmaiņām. Šīs izmaiņas var ietvert mtDNA delēcijas hroniskas progresējošas ārējas oftalmoplēģijas (CPEO) gadījumā, mtDNA punktmutācijas mitohondriālo miopātiju gadījumā vai mtDNA daudzuma samazināšanos Alpersa sindroma gadījumā. No muskuļaudiem ekstrahēto DNS pēc tam var izmantot dažādiem ģenētiskajiem testiem, piemēram, Sauterna blotēšanai un garo fragmentu PCR delēciju noteikšanai, reāllaika PCR mtDNA daudzuma samazināšanās noteikšanai vai sekvenēšanai punktmutāciju noteikšanai.
Apstrādi ar ultraskaņu, izmantojot intensīvus ultraskaņas viļņus, mitohondriju diagnostikā lieto vairākiem mērķiem. To izmanto šūnu lizēšanai, lai iegūtu to iekšējo saturu, piemēram, mitohondrijus un DNS, DNS, piemēram, mtDNA un nDNA, fragmentēšanai ar bīdes spēkiem sekvenēšanas vajadzībām un paraugu homogenizēšanai.
Plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP paraugu sagatavošanai ar augstu caurlaidspēju vienmērīgi apstrādā paraugus ar ultraskaņu daudziedobju un 96 iedobju platēs
Kā izolēt mitohondrijus no šūnām un audiem
Mitohondriju izolēšana ietver divus būtiskus posmus: šūnu sagraušanu, lai atbrīvotu to saturu, un diferenciālo centrifugēšanu, lai atdalītu un iegūtu mitohondriju frakcijas.
Apstrāde ar ultraskaņu
Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces ir saderīgas ar standarta līzes buferšķīdumiem un komplektiem, tādēļ tās ir piemērotas mitohondriju izolēšanai. Apstrādei ar ultraskaņu ir divi galvenie mērķi:
- Šūnu līze: Ultraskaņas viļņi sagrauj šūnu membrānas, atbrīvojot šūnu iekšējo saturu.
- Mitohondriju sagraušana: Apstrāde ar ultraskaņu nākamajā posmā var sašķelt mitohondrijus, lai atbrīvotu mitohondriju olbaltumvielas vai mitohondriju DNS.
- mtDNA fragmentēšana: Apstrāde ar ultraskaņu ir uzticama metode mitohondriju DNS fragmentēšanai ar bīdes spēkiem sekvenēšanas vajadzībām.
Daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP ļauj sagatavot mitohondriju paraugus ar augstu caurlaidspēju. Kopā ar diferenciālo centrifugēšanu apstrāde ar ultraskaņu paaugstina mitohondriju izolēšanas efektivitāti, nodrošinot lielu neskartu mitohondriju iznākumu, kas ir piemēroti dažādiem turpmākiem lietojumiem.
Hielscher UIP400MTP daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce darbojas ar jebkuru standarta plati
Daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP piedāvā daudzas priekšrocības paraugu sagatavošanai ar augstu caurlaidspēju, piemēram, mitohondriju diagnostikā.
Daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP paraugu sagatavošanai ar augstu caurlaidspēju biomarķieru diagnostikā.
Norādījumu piemērs mtDNA fragmentēšanai ar ultraskaņu
Sagatavošana un ekstrakcija:
- C57BL/6 peles tika nonāvētas, veicot kakla skriemeļu dislokāciju.
- Aknas tika ātri izņemtas un mazgātas ledusaukstā sterilā PBS.
Mitohondriju izolēšana:
- Mitohondriji tika izolēti, izmantojot 2-mL Dounce audu homogenizatoru un Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Sākotnējā centrifugēšana pie 700× g un 3 000× g.
- Veiciet divus papildu mazgāšanas posmus ar buferšķīdumu C.
DNS izolēšana:
- Nogulsnes no pirmās centrifugēšanas pie 700× g tika izmantotas kodola DNS (nDNA) izolēšanai.
- DNS tika izolēta, izmantojot centrifugēšanas kolonnas.
- Mitohondriju DNS (mtDNA) tika ekstrahēta no izolētiem mitohondrijiem.
- Kodola DNS (nDNA) tika ekstrahēta no neattīrītiem kodolu ekstraktiem; abos gadījumos tika izmantoti peļu aknu audi.
DNS fragmentēšana:
- DNS tika fragmentēta uz ledus, izmantojot 30-kHz/50-W ultraskaņas apstrādes ierīci UP50H ar 0,5-mm mikrogala sonotrodi pie 14 μm, 2 × 30 sekundes.
Fragmentēšanas vizualizācija un kvantitatīvā noteikšana:
- Fragmentāciju pēc apstrādes ar ultraskaņu vizualizēja 1% agarozes gelā, izmantojot SYBR safe DNS krāsvielu.
- mtDNA un nDNA relatīvo daudzumu noteica ar qPCR.
(sal. Mariero et al., 2019)
Lielas caurlaidspējas paraugu sagatavošanai daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP atvieglo liela paraugu skaita sagatavošanu standarta 96 iedobju platēs, daudziedobju platēs un mikrotitrēšanas platēs.
Lasiet vairāk par lielas caurlaidspējas paraugu sagatavošanas priekšrocībām, izmantojot UIP400MTP!
Padomi optimālai mitohondriju izolēšanai, izmantojot apstrādi ar ultraskaņu:
- Temperatūras kontrole: Visus posmus veiciet temperatūras diapazonā no 0°C līdz 4°C. Tas ir izšķiroši svarīgi mitohondriju integritātes un funkcionalitātes saglabāšanai.
- Efektivitāte un ātrums: Strādājiet ātri un attīriet mitohondrijus tikai tādā mērā, kāda nepieciešama jūsu konkrētajam lietojumam. Pārmērīgas manipulācijas var izraisīt ievērojamus mitohondriju satura zudumus.
- Suspensiju atšķaidīšana: Visā izolēšanas procesā uzturiet zemu šūnu un organellu suspensiju koncentrāciju. Tas palīdz samazināt iesprostošanās un aglutinācijas risku, tādējādi uzlabojot izolēto mitohondriju tīrību.
- Parauga tilpums: Izvēlieties vairākas neliela mēroga preparātu sagatavošanas procedūras vienas liela mēroga procedūras vietā. Šī pieeja parasti nodrošina lielāku iznākumu, jo mēroga palielināšana proporcionāli nepalielina atgūstamo mitohondriju daudzumu. Daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP atvieglo ātru un uzticamu šūnu līzi mitohondriju izolēšanai, kā arī olbaltumvielu ekstrakciju no mitohondrijiem.
Šīs vadlīnijas padarīs izolēšanas procesu, kurā izmanto ultraskaņas izraisītu līzi un centrifugēšanu, efektīvāku, nodrošinot augstas kvalitātes mitohondriju preparātus, kas piemēroti turpmākajiem lietojumiem.
Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces – Vācijā ražota kvalitāte
Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces ir plaši pazīstamas ar visaugstākajiem kvalitātes un konstrukcijas standartiem. Izturība un vienkārša lietošana ļauj mūsu ultraskaņas apstrādes ierīces netraucēti integrēt rūpnieciskajās iekārtās. Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces viegli darbojas skarbos apstākļos un prasīgā vidē.
Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums, kas īpašu uzmanību pievērš augstas veiktspējas ultraskaņas apstrādes ierīcēm ar vismodernākajām tehnoloģijām un ērtu lietošanu. Protams, Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces atbilst CE prasībām un izpilda UL, CSA un RoHs prasības.
96 iedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP mikrotitrēšanas un daudziedobju plašu apstrādei ar ultraskaņu
Literatūra / atsauces
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Bieži uzdotie jautājumi par mitohondrijiem un mitohondriālo diagnostiku
Kas ir mitohondriji?
Mitohondriji ir ar membrānu norobežotas organellas, kas atrodamas vairuma eikariotisko organismu šūnās. Tos dēvē par šūnas spēkstacijām, jo šūnu elpošanas procesā tie ražo enerģiju adenozīntrifosfāta (ATP) veidā. Turklāt mitohondrijiem ir sava DNS, un tiem ir būtiska nozīme citos šūnu procesos, tostarp šūnas cikla un šūnu nāves regulēšanā.
Ar ko mtDNA atšķiras no genoma DNS?
Mitohondriālā DNS (mtDNA) vairākos būtiskos aspektos atšķiras no genoma DNS (gDNA). mtDNA atrodas mitohondrijos, ir gredzenveida un tiek pārmantota pa mātes līniju, savukārt gDNA atrodas šūnas kodolā, ir lineāra un tiek pārmantota no abiem vecākiem. mtDNA ir daudz mazāka un kodē tikai 37 gēnus, savukārt gDNA satur aptuveni 20 000–25 000 gēnu. Katrā šūnā ir vairākas mtDNA kopijas, tai ir augstāks mutāciju biežums, un tā galvenokārt kodē olbaltumvielas, kas iesaistītas mitohondriju darbībā. Turpretī gDNA parasti ir diploīda, tai ir zemāks mutāciju biežums, un tā kodē plašu gēnu klāstu, kas nepieciešams organisma attīstībai un darbībai. Turklāt mtDNA transkripcija un translācija notiek mitohondrijos, savukārt gDNA transkripcija notiek kodolā, bet translācija – citoplazmā. Šīs atšķirības atspoguļo to atšķirīgās funkcijas un evolucionāro izcelsmi.
Kas ir bezšūnu ekstrakts?
Bezšūnu ekstrakts ir šķīdums, kas satur lizētu šūnu saturu, tostarp olbaltumvielas, nukleīnskābes un citas šūnu sastāvdaļas, bet nesatur neskartas šūnu membrānas. Šo ekstraktu izmanto bioķīmijas un molekulārās bioloģijas pētījumos, lai pētītu šūnu procesus in vitro, ļaujot pētniekiem analizēt reakcijas un mehānismus ārpus dzīvām šūnām.
Kāda ir PCR testu nozīme mitohondriju diagnostikā?
PCR testiem ir izšķiroša nozīme mitohondriju diagnostikā, jo tie ļauj noteikt mutācijas, delēcijas vai kopiju skaita variācijas mitohondriju DNS (mtDNA). Tie ļauj amplificēt konkrētus mtDNA reģionus, lai identificētu patogēnus variantus, kas saistīti ar mitohondriālām slimībām. Uz PCR balstītas metodes, piemēram, kvantitatīvo PCR (qPCR) un garo fragmentu PCR, izmanto arī mtDNA integritātes, heteroplazmijas līmeņa un mtDNA deplecijas novērtēšanai, sniedzot būtisku informāciju par mitohondriju darbību un slimībām.
Uzziniet, kā mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP atvieglo PCR testus un analīzes!
Kas ir diferenciālā centrifugēšana?
Diferenciālā centrifugēšana ir plaši izmantota metode šūnu frakcionēšanai un mitohondriju izolēšanai. Ar šo metodi šūnu struktūras atdala pēc to sedimentācijas koeficienta, kas ir atkarīgs gan no blīvuma, gan formas. Procesā paraugus buferētos sāļu šķīdumos ar noteiktu blīvumu pakļauj dažāda lieluma centrbēdzes spēkam. Struktūras ar līdzīgiem sedimentācijas koeficientiem vienlaikus nogulsnējas savākšanas mēģenes dibenā, ļaujot tās iegūt.
Kā diferenciālo centrifugēšanu izmanto mitohondriju izolēšanai?
Diferenciālā centrifugēšana ļauj pētniekiem efektīvi atdalīt mitohondriju frakcijas no citām šūnu sastāvdaļām. Mitohondriju izolēšana ietver vairākus centrifugēšanas posmus un sekojošu izolāta iegūšanu.
Sākotnējā centrifugēšana: Izmantojiet nelielu centrbēdzes spēku, lai nogulsnētu lielas šūnu atliekas un kodolus.
Turpmākās centrifugēšanas: Pakāpeniski palieliniet centrbēdzes spēku, lai nogulsnētu ar mitohondrijiem bagātinātas frakcijas. Katrā centrifugēšanas posmā tiek atdalītas struktūras ar arvien lielākiem sedimentācijas koeficientiem.
Frakciju iegūšana: Pēc katras centrifugēšanas savāc nogulsnes, bet supernatantu pakļauj lielākam centrbēdzes paātrinājumam, kas izteikts g vienībās, lai izolētu nākamo frakciju. To atkārto, līdz sasniegta vēlamā mitohondriju tīrības pakāpe.