Visokoučinkovita priprema uzorka za dijagnostiku mitohondrija
Mitohondrijska dijagnostika u istraživanjima i klinikama provodi se različitim tehnikama kao što su sekvenciranje, PCR i biokemijski testovi. Ove se metode koriste za identifikaciju mutacija DNA i mjerenje mitohondrijske funkcije. Sekvenciranje pomaže u otkrivanju genetskih mutacija, dok PCR može kvantificirati specifične sekvence DNK. Biokemijski testovi procjenjuju funkcionalnost mitohondrijskih proteina i enzima.
Dijagnostika mitohondrijskih bolesti posebno je teška zbog izražene kliničke varijabilnosti ovih bolesti kao i zbog složene interakcije između dva različito naslijeđena genoma: mitohondrijske DNA (mtDNA) i jezgrinog genoma.
Ekstrakcija DNA i fragmentacija pomoću sonikacije
Ekstrakcija DNA iz mišićnog tkiva osobito je korisna kada se sumnja na tkivno specifične promjene u mtDNA. Te promjene mogu uključivati delecije mtDNA u kroničnoj progresivnoj vanjskoj oftalmoplegiji (CPEO), točkaste mutacije mtDNA u mitohondrijskim miopatijama ili smanjenje mtDNA u Alpersovom sindromu. DNK ekstrahirana iz mišićnog tkiva može se zatim koristiti za različite genetske testove, kao što su Southern blot i PCR dugog dometa za delecije, PCR u stvarnom vremenu za depleciju ili sekvenciranje za točkaste mutacije.
Sonikacija, koja koristi intenzivne ultrazvučne valove, primjenjuje se za nekoliko primjena u dijagnostici mitohondrija. Koristi se za lizu stanica za izdvajanje unutarstaničnog sadržaja kao što su mitohondriji i DNA, za smicanje DNA kao što su mtDNA i nDNA za sekvenciranje i za homogenizaciju uzoraka.
UIP400MTP sonikator za ploče za pripremu uzoraka visoke propusnosti ravnomjerno sonicira uzorke u pločama s više jažica i 96 jažica
Kako izolirati mitohondrije iz stanica i tkiva
Izolacija mitohondrija sastoji se od dva bitna koraka: razbijanje stanica kako bi se oslobodio njihov sadržaj i korištenje diferencijalnog centrifugiranja za odvajanje i obnavljanje mitohondrijskih frakcija.
sonikacija
Hielscher sonikatori su kompatibilni sa standardnim puferima i priborom za lizu, što ih čini prikladnima za izolaciju mitohondrija. Sonikacija ima dvije glavne svrhe:
- Liza stanica: Ultrazvučni valovi ometaju stanične membrane, oslobađajući unutarstanični sadržaj.
- Mitohondrijski poremećaj: Sonikacija u sljedećem koraku može otvoriti mitohondrije kako bi se oslobodili mitohondrijski proteini ili mitohondrijska DNK.
- Fragmentacija mtDNA: Sonikacija je pouzdana tehnika za smicanje mitohondrijske DNA za sekvenciranje.
Sonikator ploča s više jažica UIP400MTP omogućuje pripremu mitohondrijskih uzoraka visoke propusnosti. U kombinaciji s diferencijalnim centrifugiranjem, ultrazvuk poboljšava učinkovitost izolacije mitohondrija, osiguravajući visoke prinose intaktnih mitohondrija pogodnih za razne daljnje primjene.
Hielscher UIP400MTP sonikator ploča s više jažica radi s bilo kojom standardnom pločom
Sonikator ploča s više jažica UIP400MTP nudi brojne prednosti za pripremu uzorka visoke propusnosti, npr. u dijagnostici mitohondrija.
UIP400MTP sonikator ploča s više jažica za pripremu uzorka visoke propusnosti u dijagnostici biomarkera.
Ogledne upute za ultrazvučnu fragmentaciju mtDNA
Priprema i ekstrakcija:
- C57BL/6 miševi su ubijeni dislokacijom cerviksa.
- Jetra su brzo ekstrahirana i isprana u ledeno hladnom sterilnom PBS-u.
Izolacija mitohondrija:
- Mitohondriji su izolirani korištenjem 2-mL Dounce mlinca za tkivo i Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Početno centrifugiranje na 700×g i 3000×g.
- Izvedite dva dodatna koraka pranja puferom C.
Izolacija DNK:
- Talog iz prvog centrifugiranja na 700×g korišten je za izolaciju nuklearne DNA (nDNA).
- DNA je izolirana korištenjem spin kolona.
- Mitohondrijska DNA (mtDNA) ekstrahirana je iz izoliranih mitohondrija.
- Nuklearna DNA (nDNA) ekstrahirana je iz sirovih jezgrinih ekstrakata, oba iz tkiva mišje jetre.
Fragmentacija DNK:
- DNK je fragmentirana na ledu pomoću 30-kHz/50-W ultrazvučnog sonikatora UP50H sa 0,5-mm sonotrodom s mikro vrhom na 14 μm tijekom 2 × 30 sekundi.
Vizualizacija i kvantifikacija fragmentacije:
- Fragmentacija nakon ultrazvuka vizualizirana je na 1% agaroznom gelu sa SYBR sigurnom DNA bojom.
- Relativna zastupljenost mtDNA i nDNA određena je qPCR-om.
(usp. Mariero i dr., 2019.)
Za pripremu uzorka visoke propusnosti, sonikator ploča s više jažica UIP400MTP olakšava pripremu velikog broja uzoraka u standardnim pločama s 96 jažica, više jažica i mikrotitarskim pločama.
Pročitajte više o prednostima pripreme uzorka visoke propusnosti pomoću UIP400MTP!
Savjeti za optimalnu izolaciju mitohondrija korištenjem sonikacije:
- Kontrola temperature: Sve korake provodite na temperaturnom rasponu od 0°C do 4°C. To je ključno za održavanje integriteta i funkcionalnosti mitohondrija.
- Učinkovitost i brzina: Radite brzo i pročistite mitohondrije samo u mjeri potrebnoj za vašu specifičnu primjenu. Pretjerana manipulacija može dovesti do značajnih gubitaka sadržaja mitohondrija.
- Razrjeđivanje suspenzija: Održavajte niske koncentracije suspenzija stanica i organela tijekom procesa izolacije. To pomaže u smanjenju rizika od hvatanja i aglutinacije, čime se poboljšava čistoća izoliranih mitohondrija.
- Volumen uzorka: Radije se odlučite za više manjih priprema nego za jednu veliku. Ovaj pristup obično rezultira boljim prinosima, budući da povećanje ne povećava proporcionalno količinu mitohondrija koji se mogu obnoviti. Sonikator ploča s više jažica UIP400MTP olakšava brzu i pouzdanu lizu stanica za izolaciju mitohondrija, kao i ekstrakciju proteina iz mitohondrija.
Ove će smjernice učiniti proces izolacije pomoću ultrazvučne lize i centrifugiranja učinkovitijim, dajući visokokvalitetne mitohondrijske pripravke prikladne za daljnje primjene.
Hielscher sonikatori – Kvaliteta Proizvedeno u Njemačkoj
Hielscher ultrasonicators su poznati po svojim najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavan rad omogućuju glatku integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijske objekte. Teški uvjeti i zahtjevna okruženja lako se nose s Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana tvrtka i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne uređaje visokih performansi koji sadrže najsuvremeniju tehnologiju i jednostavnu su za korištenje. Naravno, Hielscher ultrasonicators sukladni su CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.
Sonikator ploča s 96 jažica UIP400MTP za sonikaciju mikrotitarskih ploča i ploča s više jažica
Literatura / Reference
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Često postavljana pitanja o mitohondrijima i dijagnostici mitohondrija
Što su mitohondriji?
Mitohondriji su organele vezane za membranu koje se nalaze u stanicama većine eukariotskih organizama. Poznati su kao elektrane stanice jer proizvode energiju u obliku adenozin trifosfata (ATP) kroz proces staničnog disanja. Osim toga, mitohondriji imaju vlastitu DNK i igraju ključne uloge u drugim staničnim procesima, uključujući regulaciju staničnog ciklusa i stanične smrti.
Što razlikuje mtDNA od genomske DNA?
Mitohondrijska DNA (mtDNA) razlikuje se od genomske DNA (gDNA) na nekoliko ključnih načina. MtDNA se nalazi u mitohondrijima, kružna je i nasljeđuje se s majčine strane, dok se gDNA nalazi u jezgri stanice, linearna je i nasljeđuje se od oba roditelja. MtDNA je mnogo manja, kodira samo 37 gena, dok gDNA sadrži oko 20.000-25.000 gena. MtDNA je prisutna u više kopija po stanici, ima veću stopu mutacije i prvenstveno kodira proteine uključene u funkciju mitohondrija. Nasuprot tome, gDNA je obično diploidna, ima nižu stopu mutacije i kodira širok niz gena potrebnih za razvoj i funkcioniranje organizma. Uz to, transkripcija i translacija mtDNA odvija se unutar mitohondrija, dok se transkripcija gDNA događa u jezgri, a translacija u citoplazmi. Ove razlike odražavaju njihove različite uloge i evolucijsko podrijetlo.
Što je Cell-Free Extract?
Ekstrakt bez stanica je otopina koja sadrži sadržaj liziranih stanica, uključujući proteine, nukleinske kiseline i druge stanične komponente, ali bez intaktnih staničnih membrana. Ovaj se ekstrakt koristi u biokemijskim i molekularnobiološkim istraživanjima za proučavanje staničnih procesa in vitro, omogućujući istraživačima da analiziraju reakcije i mehanizme izvan živih stanica.
Koju ulogu igraju PCR testovi u dijagnostici mitohondrija?
PCR testovi igraju ključnu ulogu u mitohondrijskoj dijagnostici omogućujući otkrivanje mutacija, brisanja ili varijacija broja kopija u mitohondrijskoj DNA (mtDNA). Oni omogućuju pojačanje specifičnih regija mtDNA za identifikaciju patogenih varijanti povezanih s mitohondrijskim poremećajima. Tehnike temeljene na PCR-u, poput kvantitativnog PCR-a (qPCR) i PCR-a dugog dometa, također se koriste za procjenu integriteta mtDNA, razina heteroplazme i smanjenja mtDNA, dajući bitne uvide u funkciju mitohondrija i bolesti.
Saznajte kako UIP400MTP Microplate sonicator olakšava PCR testove i analize!
Što je diferencijalno centrifugiranje?
Diferencijalno centrifugiranje široko je korištena tehnika za frakcioniranje stanica i izolaciju mitohondrija. Ova metoda razdvaja stanične strukture na temelju njihovog sedimentacijskog koeficijenta, koji ovisi i o gustoći i o obliku. Proces uključuje primjenu različitih razina centrifugalne sile na uzorke u puferiranim otopinama soli specifične gustoće. Strukture sa sličnim sedimentacijskim koeficijentima će se u isto vrijeme taložiti na dnu sabirne cijevi, što će omogućiti njihovo obnavljanje.
Kako se koristi diferencijalna centrifugacija za izolaciju mitohondrija?
Diferencijalno centrifugiranje omogućuje istraživačima učinkovito odvajanje mitohondrijskih frakcija od ostalih staničnih komponenti. Izolacija mitohondrija uključuje nekoliko koraka centrifugiranja i kasnije obnavljanje izolata.
Početno centrifugiranje: Primijenite malu centrifugalnu silu za taloženje velikih staničnih ostataka i jezgri.
Naknadna centrifugiranja: Povećajte centrifugalnu silu postupno kako biste peletirali frakcije obogaćene mitohondrijima. Svaki korak centrifugiranja uklanja strukture s progresivno višim koeficijentima sedimentacije.
Oporavak frakcije: Nakon svakog centrifugiranja, talog se skuplja, a supernatant se podvrgava višim g-silama kako bi se izolirala sljedeća frakcija. To se ponavlja dok se ne postigne željena čistoća mitohondrija.