Priprema velikog broja uzoraka za mitohondrijsku dijagnostiku
Mitohondrijska dijagnostika u istraživanjima i kliničkoj praksi provodi se različitim tehnikama kao što su sekvenciranje, PCR i biokemijski testovi. Te se metode primjenjuju za identifikaciju mutacija DNA i mjerenje mitohondrijske funkcije. Sekvenciranje pomaže u otkrivanju genetskih mutacija, dok PCR omogućuje kvantifikaciju specifičnih sekvencija DNA. Biokemijskim testovima procjenjuje se funkcionalnost mitohondrijskih proteina i enzima.
Dijagnostika mitohondrijskih bolesti osobito je teška zbog izražene kliničke varijabilnosti tih bolesti te složene interakcije između dvaju genoma koji se različito nasljeđuju: mitohondrijske DNA (mtDNA) i nuklearnog genoma.
Ekstrakcija i fragmentacija DNA sonikacijom
Ekstrakcija DNA iz mišićnog tkiva osobito je korisna kada se sumnja na promjene mtDNA specifične za tkivo. Te promjene mogu uključivati delecije mtDNA kod kronične progresivne vanjske oftalmoplegije (CPEO), točkaste mutacije mtDNA kod mitohondrijskih miopatija ili depleciju mtDNA kod Alpersova sindroma. DNA ekstrahirana iz mišićnog tkiva zatim se može upotrijebiti za različite genetske testove, kao što su Southern blot i PCR dugih fragmenata za delecije, PCR u stvarnom vremenu za depleciju ili sekvenciranje za točkaste mutacije.
Sonikacija intenzivnim ultrazvučnim valovima primjenjuje se u različite svrhe u mitohondrijskoj dijagnostici. Upotrebljava se za lizu stanica radi ekstrakcije unutarstaničnog sadržaja poput mitohondrija i DNA, za fragmentaciju DNA poput mtDNA i nDNA smičnim silama radi sekvenciranja te za homogenizaciju uzoraka.
Sonikator za pločice UIP400MTP za pripremu velikog broja uzoraka ravnomjerno sonicira uzorke u pločicama s više jažica i pločicama s 96 jažica
Kako izolirati mitohondrije iz stanica i tkiva
Izolacija mitohondrija obuhvaća dva ključna koraka: razaranje stanica radi oslobađanja njihova sadržaja i primjenu diferencijalnog centrifugiranja radi odvajanja i prikupljanja mitohondrijskih frakcija.
Sonikacija
Hielscher sonikatori kompatibilni su sa standardnim puferima i kompletima za lizu, što ih čini prikladnima za izolaciju mitohondrija. Sonikacija služi dvjema glavnim svrhama:
- Liza stanica: Ultrazvučni valovi razaraju stanične membrane i oslobađaju unutarstanični sadržaj.
- Razaranje mitohondrija: Sonikacija u naknadnom koraku može razoriti mitohondrije radi oslobađanja mitohondrijskih proteina ili mitohondrijske DNA.
- Fragmentacija mtDNA: Sonikacija je pouzdana tehnika za fragmentaciju mitohondrijske DNA smičnim silama radi sekvenciranja.
Sonikator za pločice s više jažica UIP400MTP omogućuje pripremu velikog broja mitohondrijskih uzoraka. U kombinaciji s diferencijalnim centrifugiranjem sonikacija povećava učinkovitost izolacije mitohondrija, osiguravajući visoke prinose intaktnih mitohondrija prikladnih za različite daljnje primjene.
Hielscher sonikator za pločice s više jažica UIP400MTP radi s bilo kojom standardnom pločicom
Sonikator za pločice s više jažica UIP400MTP nudi brojne prednosti za pripremu velikog broja uzoraka, primjerice u mitohondrijskoj dijagnostici.
Sonikator za pločice s više jažica UIP400MTP za pripremu velikog broja uzoraka u dijagnostici biomarkera.
Primjer uputa za ultrazvučnu fragmentaciju mtDNA
Priprema i ekstrakcija:
- Miševi C57BL/6 usmrćeni su dislokacijom vratne kralježnice.
- Jetre su brzo izvađene i isprane ledeno hladnim sterilnim PBS-om.
Izolacija mitohondrija:
- Mitohondriji su izolirani s pomoću Dounceova homogenizatora za tkivo od 2-mL i kompleta Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Početno centrifugiranje pri 700× g i 3.000× g.
- Provedite dva dodatna koraka ispiranja puferom C.
Izolacija DNA:
- Talog iz prvog centrifugiranja pri 700× g upotrijebljen je za izolaciju nuklearne DNA (nDNA).
- DNA je izolirana s pomoću centrifugacijskih kolona.
- Mitohondrijska DNA (mtDNA) ekstrahirana je iz izoliranih mitohondrija.
- Nuklearna DNA (nDNA) ekstrahirana je iz sirovih nuklearnih ekstrakata, a obje vrste DNA potječu iz tkiva mišje jetre.
Fragmentacija DNA:
- DNA je fragmentirana na ledu s pomoću ultrazvučnog sonikatora UP50H od 30-kHz/50-W sa sonotrodom s mikrovrhom od 0,5-mm pri 14 μm tijekom 2 × 30 sekundi.
Vizualizacija i kvantifikacija fragmentacije:
- Fragmentacija nakon ultrazvučne obrade vizualizirana je na 1% agaroznom gelu s bojom za DNA SYBR safe.
- Relativna zastupljenost mtDNA i nDNA određena je qPCR-om.
(cf. Mariero et al., 2019)
Za pripremu velikog broja uzoraka sonikator za pločice s više jažica UIP400MTP olakšava pripremu brojnih uzoraka u standardnim pločicama s 96 jažica, pločicama s više jažica i mikrotitarskim pločicama.
Pročitajte više o prednostima pripreme velikog broja uzoraka pomoću uređaja UIP400MTP!
Savjeti za optimalnu izolaciju mitohondrija sonikacijom:
- Kontrola temperature: Sve korake provedite u temperaturnom rasponu od 0°C do 4°C. To je ključno za očuvanje cjelovitosti i funkcionalnosti mitohondrija.
- Učinkovitost i brzina: Radite brzo i pročišćavajte mitohondrije samo u mjeri potrebnoj za vašu specifičnu primjenu. Prekomjerno rukovanje može dovesti do znatnih gubitaka mitohondrijskog sadržaja.
- Razrjeđivanje suspenzija: Održavajte niske koncentracije suspenzija stanica i organela tijekom cijelog postupka izolacije. To pomaže smanjiti rizike od zarobljavanja i aglutinacije, čime se poboljšava čistoća izoliranih mitohondrija.
- Volumen uzorka: Odaberite više priprema manjeg opsega umjesto jedne pripreme velikog opsega. Taj pristup obično daje bolje prinose jer povećanje opsega ne povećava proporcionalno količinu mitohondrija koji se mogu izdvojiti. Sonikator za pločice s više jažica UIP400MTP olakšava brzu i pouzdanu lizu stanica za izolaciju mitohondrija, kao i ekstrakciju proteina iz mitohondrija.
Ove će smjernice učiniti postupak izolacije ultrazvučnom lizom i centrifugiranjem učinkovitijim te omogućiti dobivanje visokokvalitetnih mitohondrijskih pripravaka prikladnih za daljnje primjene.
Sonikatori Hielscher – kvaliteta proizvedena u Njemačkoj
Ultrazvučni uređaji Hielscher poznati su po najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućuju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Ultrazvučni uređaji Hielscher lako se nose s teškim uvjetima i zahtjevnim okruženjima.
Hielscher Ultrasonics tvrtka je s ISO certifikatom koja poseban naglasak stavlja na ultrazvučne uređaje visokih performansi s najsuvremenijom tehnologijom i jednostavnom uporabom. Naravno, ultrazvučni uređaji Hielscher sukladni su zahtjevima oznake CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.
Sonikator za pločice s 96 jažica UIP400MTP za sonikaciju mikrotitarskih pločica i pločica s više jažica
Literatura / reference
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Često postavljana pitanja o mitohondrijima i mitohondrijskoj dijagnostici
Što su mitohondriji?
Mitohondriji su organele omeđene membranom koje se nalaze u stanicama većine eukariotskih organizama. Poznati su kao elektrane stanice jer proizvode energiju u obliku adenozin-trifosfata (ATP) procesom staničnog disanja. Osim toga, mitohondriji imaju vlastitu DNA i igraju ključne uloge u drugim staničnim procesima, uključujući regulaciju staničnog ciklusa i stanične smrti.
Po čemu se mtDNA razlikuje od genomske DNA?
Mitohondrijska DNA (mtDNA) razlikuje se od genomske DNA (gDNA) na nekoliko ključnih načina. MtDNA se nalazi u mitohondrijima, kružna je i nasljeđuje se od majke, dok se gDNA nalazi u staničnoj jezgri, linearna je i nasljeđuje se od oba roditelja. MtDNA je mnogo manja i kodira samo 37 gena, dok gDNA sadrži oko 20.000–25.000 gena. MtDNA je prisutna u više kopija po stanici, ima višu stopu mutacija i prvenstveno kodira proteine uključene u funkciju mitohondrija. Nasuprot tome, gDNA je obično diploidna, ima nižu stopu mutacija i kodira širok raspon gena potrebnih za razvoj i funkcioniranje organizma. Osim toga, transkripcija i translacija mtDNA odvijaju se unutar mitohondrija, dok se transkripcija gDNA odvija u jezgri, a translacija u citoplazmi. Te razlike odražavaju njihove različite uloge i evolucijsko podrijetlo.
Što je bestanični ekstrakt?
Ekstrakt bez stanica otopina je koja sadržava sadržaj liziranih stanica, uključujući proteine, nukleinske kiseline i druge stanične komponente, ali bez neoštećenih staničnih membrana. Taj se ekstrakt upotrebljava u biokemijskim i molekularnobiološkim istraživanjima za proučavanje staničnih procesa in vitro, omogućujući istraživačima analizu reakcija i mehanizama izvan živih stanica.
Koju ulogu imaju PCR testovi u mitohondrijskoj dijagnostici?
PCR testovi imaju ključnu ulogu u mitohondrijskoj dijagnostici jer omogućuju otkrivanje mutacija, delecija ili varijacija broja kopija mitohondrijske DNA (mtDNA). Omogućuju umnažanje specifičnih regija mtDNA radi prepoznavanja patogenih varijanti povezanih s mitohondrijskim poremećajima. Tehnike temeljene na PCR-u, kao što su kvantitativni PCR (qPCR) i PCR dugih fragmenata, također se upotrebljavaju za procjenu cjelovitosti mtDNA, razine heteroplazmije i deplecije mtDNA, pružajući ključne uvide u funkciju mitohondrija i bolesti.
Saznajte kako sonikator za mikropločice UIP400MTP olakšava PCR testove i analize!
Što je diferencijalno centrifugiranje?
Diferencijalno centrifugiranje široko je primjenjivana tehnika za frakcioniranje stanica i izolaciju mitohondrija. Tom se metodom stanične strukture razdvajaju na temelju njihova sedimentacijskog koeficijenta, koji ovisi i o gustoći i o obliku. Postupak uključuje primjenu različitih razina centrifugalne sile na uzorke u puferiranim otopinama soli specifičnih gustoća. Strukture sa sličnim sedimentacijskim koeficijentima istodobno će se taložiti na dnu sabirne epruvete, što omogućuje njihovo izdvajanje.
Kako se diferencijalno centrifugiranje upotrebljava za izolaciju mitohondrija?
Diferencijalno centrifugiranje omogućuje istraživačima učinkovito odvajanje mitohondrijskih frakcija od drugih staničnih komponenti. Izolacija mitohondrija uključuje nekoliko koraka centrifugiranja i naknadno izdvajanje izolata.
Početno centrifugiranje: Primijenite malu centrifugalnu silu kako biste istaložili velike stanične ostatke i jezgre.
Naknadna centrifugiranja: Postupno povećavajte centrifugalnu silu kako biste istaložili frakcije obogaćene mitohondrijima. Svakim korakom centrifugiranja uklanjaju se strukture sa sve višim sedimentacijskim koeficijentima.
Izdvajanje frakcija: Nakon svakog centrifugiranja talog se prikuplja, a supernatant se izlaže višim g-silama kako bi se izolirala sljedeća frakcija. To se ponavlja dok se ne postigne željena čistoća mitohondrija.