סוניקציה לשיפור פירוק תאי אצות והמיצוי מהם

אצות, הן מאקרו־אצות והן מיקרו־אצות, מכילות תרכובות רבות בעלות ערך, המשמשות כמזונות מזינים, כתוספי מזון, כדלק או כחומר גלם לדלק. כדי לשחרר את חומרי המטרה מתא האצה, נדרשת טכניקה עוצמתית ויעילה לפירוק תאים. מכשירי מיצוי אולטרסוניים יעילים ואמינים ביותר במיצוי תרכובות פעילות ביולוגית מחומרים צמחיים, מאצות ומפטריות. מכשירי המיצוי האולטרסוניים של Hielscher זמינים בקנה מידה מעבדתי, שולחני ותעשייתי, והשימוש בהם מבוסס בהפקת תמציות שמקורן בתאים בתעשיות המזון, התרופות והדלק הביולוגי.

אצות כמשאב בעל ערך לתזונה ולדלק

תאי אצות הם מקור רב־שימושי לתרכובות פעילות ביולוגית ועשירות באנרגיה, כגון חלבונים, פחמימות, ליפידים וחומרים אחרים בעלי פעילות ביולוגית, וכן לאלקאנים. לכן אצות משמשות כמקור למזון ולתרכובות בעלות ערך תזונתי, וכן לדלקים.
מיקרו־אצות הן מקור מוערך לליפידים, המשמשים לתזונה וכחומר גלם לדלקים ביולוגיים (למשל, ביודיזל). זנים של הפיטופלנקטון הימי Dicrateria, כגון Dicrateria rotunda, מוכרים כאצות המייצרות בנזין, המסוגלות לסנתז סדרה של פחמימנים רוויים (n‐alkanes), מ־C₁₀H₂₂ עד C₃₈H₇₈, המסווגים כבנזין (C10–C15), סולר (C16–C20) ומזוט (C21–C38).
בשל ערכן התזונתי, אצות משמשות כ"מזונות פונקציונליים" או כ"נוטרצבטיקה". מיקרונוטריינטים חשובים המופקים מאצות, ובהם הקרוטנואידים אסטקסנטין, פוקוקסנטין וזאקסנטין, פוקואידן, laminari וגלוקנים אחרים, לצד חומרים רבים נוספים בעלי פעילות ביולוגית, משמשים כתוספי תזונה וכתרופות. קרגינן, אלגינט והידרוקולואידים אחרים משמשים כתוספי מזון. ליפידים מאצות משמשים כמקור טבעוני לאומגה־3, וכן כדלק או כחומר גלם לייצור ביודיזל.

פירוק תאי אצות ומיצוי מהם באמצעות אולטרסאונד רב־עוצמה

מכשירי מיצוי אולטרסוניים, או פשוט מכשירי סוניקציה, משמשים למיצוי תרכובות בעלות ערך מדגימות קטנות במעבדה, וכן לייצור בקנה מידה מסחרי גדול.
תאי אצות מוגנים במטריצות מורכבות של דופן התא, המורכבות מליפידים, מתאית, מחלבונים, מגליקופרוטאינים ומפוליסכרידים. הבסיס של רוב דופנות תאי האצות בנוי מרשת מיקרופיברילרית בתוך מטריצת חלבון דמוית ג'ל; עם זאת, לחלק מהמיקרו־אצות יש דופן אי־אורגנית קשיחה המורכבת מפרוסטולות של סיליקה אופאלית או מסידן פחמתי. כדי להפיק תרכובות פעילות ביולוגית מביומסה של אצות, נדרשת טכניקה יעילה לפירוק תאים. לצד הגורמים הטכנולוגיים של המיצוי (כלומר, שיטת המיצוי והציוד), יעילות פירוק תאי האצות והמיצוי מהם מושפעת מאוד גם מגורמים שונים התלויים באצות, כגון הרכב דופן התא, מיקומה של הביומולקולה הרצויה בתאי המיקרו־אצות ושלב הגידול של המיקרו־אצות בעת הקציר.

כיצד פועלים פירוק תאי אצות והמיצוי מהם באמצעות אולטרסאונד?

כאשר גלי אולטרסאונד בעוצמה גבוהה מועברים באמצעות גשוש אולטרסוני (המכונה גם קרן אולטרסונית או סונוטרודה) אל תוך נוזל או תרחיף, גלי הקול מתפשטים בנוזל ויוצרים מחזורים מתחלפים של לחץ גבוה / לחץ נמוך. במהלך מחזורים אלה של לחץ גבוה / לחץ נמוך נוצרות בועות ריק זעירות או חללים. בועות קוויטציה נוצרות כאשר הלחץ המקומי יורד במהלך מחזורי הלחץ הנמוך במידה מספקת מתחת ללחץ האדים הרווי, שערכו נקבע על ידי חוזק המתיחה של הנוזל בטמפרטורה מסוימת. בועות אלה גדלות לאורך מספר מחזורים. כאשר בועות הריק מגיעות לגודל שבו אינן יכולות לספוג עוד אנרגיה, הן קורסות פנימה בעוצמה במהלך מחזור של לחץ גבוה. הקריסה פנימה של בועות הקוויטציה היא תהליך עוצמתי בעל צפיפות אנרגיה גבוהה, היוצר גלי הלם חזקים, מערבולות וסילונים זעירים בנוזל. בנוסף, נוצרים באופן מקומי לחצים גבוהים מאוד וטמפרטורות גבוהות מאוד. תנאים קיצוניים אלה יכולים בקלות לפרק דפנות תאים וממברנות ולשחרר תרכובות תוך־תאיות באופן יעיל, אפקטיבי ומהיר. כך ניתן למצות ביעילות תרכובות תוך־תאיות כגון חלבונים, רב־סוכרים, ליפידים, ויטמינים, מינרלים ונוגדי חמצון באמצעות אולטרסאונד רב־עוצמה.

קוויטציה אולטרסונית לפירוק תאים ולמיצוי

בחשיפה לאנרגיה אולטרסונית עזה, הדופן או הקרום של כל סוג של תא (לרבות תאי צמחים, יונקים, אצות, פטריות, חיידקים וכו׳) מתפרקים, והתא נקרע למקטעים קטנים יותר בשל הכוחות המכניים של קוויטציה אולטרסונית בעלת צפיפות אנרגיה גבוהה. כאשר דופן התא נשברת, מטבוליטים תאיים כגון חלבון, ליפיד, חומצת גרעין וכלורופיל משתחררים הן ממטריצת דופן התא והן מתוך התא, ועוברים אל מצע הגידול או הממס שסביבו.
מנגנון הקוויטציה האולטרסונית / האקוסטית שתואר לעיל מפרק באופן ניכר תאי אצות שלמים או חלוליות גז ונוזל בתוך התאים. הקוויטציה האולטרסונית, הרטט, המערבולות והמיקרו־זרימה מקדמים את מעבר המסה בין פנים התא לממס שסביבו, כך שהביומולקולות (כלומר המטבוליטים) משתחררות ביעילות ובמהירות. סוניקציה היא טיפול מכני בלבד, שאינו דורש כימיקלים אגרסיביים, רעילים ו/או יקרים.
אולטרסאונד בעוצמה גבוהה ובתדר נמוך יוצר תנאים קיצוניים בעלי צפיפות אנרגיה גבוהה, המאופיינים בלחצים גבוהים, בטמפרטורות גבוהות ובכוחות גזירה גבוהים. כוחות פיזיקליים אלה מקדמים את פירוק מבני התא כדי לשחרר תרכובות תוך־תאיות אל המדיום. לכן, אולטרסאונד בתדר נמוך משמש בהיקף נרחב למיצוי חומרים פעילים ביולוגית ודלקים מאצות. בהשוואה לשיטות מיצוי קונבנציונליות כגון מיצוי בממס, טחינה בחרוזים או הומוגניזציה בלחץ גבוה, מיצוי אולטרסוני מצטיין בשחרור מרבית התרכובות הפעילות ביולוגית (כגון ליפידים, חלבונים, רב־סוכרים ומיקרונוטריינטים) מתוך התא שנוקב באמצעות אולטרסאונד ופורק. בתנאי התהליך המתאימים, מיצוי אולטרסוני מספק תפוקות מיצוי עדיפות במשך תהליך קצר מאוד. לדוגמה, מכשירי מיצוי אולטרסוניים עתירי ביצועים מציגים ביצועי מיצוי מצוינים מאצות כאשר משתמשים בהם עם ממס מתאים. בסביבה חומצית או בסיסית, דופן תא האצה נעשית נקבובית ומקומטת, דבר המוביל לתפוקות מוגברות בטמפרטורה נמוכה (מתחת ל־60°C) ובזמן סוניקציה קצר (פחות מ־3 שעות). משך המיצוי הקצר בטמפרטורות מתונות מונע פירוק של פוקואידן, וכך מתקבל רב־סוכר בעל פעילות ביולוגית גבוהה.
טיפול באולטרסאונד הוא גם שיטה להפיכת פוקואידן בעל משקל מולקולרי גבוה לפוקואידן בעל משקל מולקולרי נמוך, שפעילותו הביולוגית גבוהה משמעותית בשל המבנה שלו שהוסרו ממנו הסתעפויות. בזכות פעילותו הביולוגית הגבוהה ונגישותו הביולוגית הגבוהה, פוקואידן בעל משקל מולקולרי נמוך הוא תרכובת מעניינת עבור תכשירים פרמצבטיים ומערכות להובלת תרופות.

תיאורי מקרה: מיצוי אולטרסוני של תרכובות מאצות

יעילות המיצוי האולטרסוני ואופטימיזציה של פרמטרי המיצוי האולטרסוני נחקרו בהרחבה. להלן מובאות תוצאות לדוגמה של מיצוי באמצעות אולטרסאונד ממיני אצות שונים.

מיצוי חלבונים מספירולינה באמצעות מנו–תרמו–סוניקציה

קבוצת המחקר של פרופ' Chemat (אוניברסיטת אביניון) חקרה את השפעות המנו-תרמו-סוניקציה (MTS) על מיצוי חלבונים (כגון פיקוציאנין) מציאנובקטריה מיובשת מהמין Arthrospira platensis (המוכרת גם כספירולינה). מנו-תרמו-סוניקציה (MTS) היא הפעלת אולטרסאונד בשילוב לחצים וטמפרטורות מוגברים כדי להעצים את תהליך המיצוי האולטרסוני.
"על פי תוצאות הניסויים, MTS הגבירה את מעבר המסה (דיפוזיביות אפקטיבית גבוהה, De) ואפשרה לקבל 229% יותר חלבונים (28.42 ± 1.15 g/100 g DW) בהשוואה לתהליך המקובל ללא אולטרסאונד (8.63 ± 1.15 g/100 g DW). עם 28.42 g חלבונים לכל 100 g ביומסה יבשה של ספירולינה בתמצית, הושג שיעור השבת חלבון של 50% בתוך 6 דקות אפקטיביות בתהליך MTS רציף. תצפיות מיקרוסקופיות הראו שקוויטציה אקוסטית השפיעה על סיבי הספירולינה באמצעות מנגנונים שונים, כגון קיטוע, יצירת נקבוביות באמצעות אולטרסאונד ופירוק המרקם. תופעות שונות אלה מקלות על המיצוי, השחרור וההמסה של תרכובות פעילות ביולוגית מספירולינה." [Vernès et al., 2019]

תמונות מיקרוסקופיה אופטית של סיבי ספירולינה שלמים שנחשפו לטיפול MTS לאורך זמן. קנה המידה (תמונה A) = 50 μm בכל התמונות.
תמונה ומחקר: ©Vernès et al. 2019

מיצוי אולטרסוני של פוקואידן וגלוקן מן Laminaria digitata

קבוצת המחקר של ד"ר Tiwari ב-TEAGASC חקרה מיצוי של רב-סוכרים, כלומר פוקואידן, למינרין וסך הגלוקנים, מהמאקרו-אצה Laminaria digitata באמצעות מכשיר האולטרסאונד UIP500hdT. פרמטרי המיצוי בסיוע אולטרסאונד (UAE) שנחקרו הראו השפעה משמעותית על רמות הפוקוז, FRAP ו-DPPH. רמות של 1060.75 mg/100 g ds, 968.57 mg/100 g ds, 8.70 μM trolox/mg fde ו-11.02% התקבלו עבור פוקוז, סך הגלוקנים, FRAP ו-DPPH, בהתאמה, בתנאים ממוטבים של טמפרטורה (76◦C), זמן (10 min) ואמפליטודה אולטרסונית (100%), תוך שימוש ב-0.1 M HCl כממס. תנאי ה-UAE שתוארו יושמו לאחר מכן בהצלחה על מאקרו-אצות חומיות נוספות בעלות חשיבות כלכלית (L. hyperborea ו-A. nodosum) לקבלת תמציות עשירות ברב-סוכרים. מחקר זה מדגים את ישימותו של UAE לשיפור המיצוי של רב-סוכרים פעילים ביולוגית ממינים שונים של מאקרו-אצות.

מיצוי אולטרסוני של פיטוכימיקלים מן F. vesiculosus ומן P. canaliculata

צוות המחקר של García-Vaquero השווה בין טכניקות מיצוי חדשניות שונות, ובהן מיצוי אולטרסוני בעל ביצועים גבוהים, מיצוי באמצעות אולטרסאונד ומיקרוגל, מיצוי באמצעות מיקרוגל, מיצוי בסיוע טיפול הידרותרמי ומיצוי בסיוע לחץ גבוה, כדי להעריך את יעילות המיצוי ממיני המיקרו-אצות החומיות Fucus vesiculosus ו-Pelvetia canaliculata. לצורך הסוניקציה הם השתמשו במכשיר המיצוי האולטרסוני Hielscher UIP500hdT. ניתוח תפוקות המיצוי גילה שמיצוי אולטרסוני השיג את התפוקות הגבוהות ביותר של רוב הפיטוכימיקלים משני F. vesiculosus. כלומר, התפוקות הגבוהות ביותר של תרכובות שמוצו מן F. vesiculosus באמצעות מכשיר המיצוי האולטרסוני UIP500hdT היו: תכולת פנולים כוללת (445.0 ± 4.6 mg שווי ערך לחומצה גאלית/g), תכולת פלורוטאנינים כוללת (362.9 ± 3.7 mg שווי ערך לפלורוגלוצינול/g), תכולת פלבונואידים כוללת (286.3 ± 7.8 mg שווי ערך לקוורצטין/g) ותכולת טאנינים כוללת (189.1 ± 4.4 mg שווי ערך לקטכין/g).
במחקרם הסיק הצוות כי השימוש במיצוי בסיוע אולטרסאונד "בשילוב תמיסה אתנולית בריכוז 50% כממס למיצוי עשוי להיות אסטרטגיה מבטיחה למיצוי TPC, TPhC, TFC ו-TTC, תוך הפחתת המיצוי הנלווה של פחמימות בלתי רצויות הן מן F. vesiculosus והן מן P. canaliculata, עם יישומים מבטיחים לשימוש בתרכובות אלה כתרופות, כתוספי תזונה בעלי תועלת בריאותית וכתכשירי קוסמטיקה בעלי פעילות ביולוגית." [García-Vaquero et al., 2021]

הגדלת קנה המידה של מנו-תרמו-סוניקציה באוניברסיטת אביניון באמצעות מכשירי אולטרסאונד של Hielscher: מציוד מעבדתי UIP1000hdT (A) לציוד בקנה מידה של פיילוט UIP4000hdT (B, C & D). בתמונה D מוצג חתך רוחב סכמטי של תא הזרימה האולטרסוני FC100K.
תמונה ומחקר: ©Vernès et al. 2019

מכשירי מיצוי אולטרסוניים עתירי ביצועים לפירוק אצות

הציוד האולטרסוני המתקדם ביותר של Hielscher מאפשר שליטה מלאה בפרמטרים של התהליך, כגון משרעת, טמפרטורה, לחץ ואנרגיה מושקעת.
במיצוי אולטרסוני ניתן לשנות ולמטב פרמטרים כגון גודל חלקיקי חומר הגלם, סוג הממס, היחס בין המוצק לממס וזמן המיצוי, לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
מכיוון שמיצוי אולטרסוני הוא שיטת מיצוי לא תרמית, נמנע הפירוק התרמי של הרכיבים הפעילים ביולוגית המצויים בחומר הגלם, כגון אצות.
בסך הכול, יתרונות כגון תפוקה גבוהה, זמן מיצוי קצר, טמפרטורת מיצוי נמוכה וכמויות ממס קטנות הופכים את הסוניקציה לשיטת המיצוי העדיפה.

מיצוי אולטרסוני: שיטה מבוססת במעבדה ובתעשייה

מיצוי אולטרסוני משמש באופן נרחב למיצוי כל סוג של תרכובת פעילה ביולוגית מחומרים צמחיים, מאצות, מחיידקים ומתאי יונקים. מיצוי אולטרסוני התבסס כשיטה פשוטה, חסכונית ויעילה ביותר, העולה על טכניקות מיצוי מסורתיות אחרות בזכות תפוקות מיצוי גבוהות יותר ומשך עיבוד קצר יותר.
הודות לזמינותן של מערכות אולטרסוניות למעבדה, לשולחן העבודה ולשימוש תעשייתי מלא, מיצוי אולטרסוני הוא כיום טכנולוגיה מבוססת ואמינה. מכשירי המיצוי האולטרסוניים של Hielscher מותקנים ברחבי העולם במתקני עיבוד תעשייתיים המייצרים תרכובות פעילות ביולוגית בדרגת איכות למזון ולתרופות.

תקנון תהליכים עם Hielscher Ultrasonics

תמציות המופקות מאצות ומשמשות במזון, בתרופות או בתכשירים קוסמטיים חייבות להיות מיוצרות בהתאם לתנאי ייצור נאותים (GMP) ולפי מפרטי עיבוד תקניים. מערכות המיצוי הדיגיטליות של Hielscher Ultrasonics מצוידות בתוכנה חכמה, המקלה על הגדרה ובקרה מדויקות של תהליך הסוניקציה. רישום נתונים אוטומטי שומר בכרטיס ה-SD המובנה את כל פרמטרי התהליך האולטרסוני, כגון אנרגיית האולטרסאונד (אנרגיה כוללת ואנרגיה נטו), משרעת, טמפרטורה ולחץ (כאשר מותקנים חיישני טמפרטורה ולחץ), בצירוף חותמת תאריך ושעה. כך ניתן לבדוק כל אצווה שעברה עיבוד אולטרסוני. בה בעת, מובטחות הדירות ואיכות מוצר גבוהה באופן מתמשך.

הטבלה שלהלן מספקת אומדן של קיבולת העיבוד המשוערת של המכשירים האולטרסוניים שלנו: