יצירת סיבי עמילואיד באמצעות הסוניקטור למיקרופלטות UIP400MTP

סיבי עמילואיד, בדומה לגבישים, נוצרים בתהליך של התגרענות ולאחריה גדילה. עם זאת, בשל מחסום האנרגיה החופשית הגבוה של ההתגרענות, יצירה ספונטנית של סיבי עמילואיד מתרחשת רק לאחר שלב השהיה ממושך. סוניקציה התפתחה לכלי רב־עוצמה להשראת התגרענות של עמילואיד, ובכך מאיצה במידה ניכרת את יצירת הסיבים. בשילוב עם קורא מיקרופלטות המשתמש בפלואורסצנציה של תיופלאבין T ‏(ThT), סוניקציה מאפשרת זיהוי בתפוקה גבוהה של סיבי עמילואיד בדגימות רבות בו־זמנית.

יצירת סיבי עמילואיד בהשראת אולטרסאונד באמצעות הסוניקטור למיקרופלטות UIP400MTP

באמצעות הסוניקטור לפלטות מרובות באריות UIP400MTP ניתן לסנתז במהירות כמויות גדולות של סיבי עמילואיד באיכות אחידה לצורכי מחקר. גישה יעילה זו מאפשרת לחקור את הנטייה של חלבונים ליצור עמילואיד. טכניקה זו מקלה על יצירה מהירה והדירה של סיבי עמילואיד, כפי שהודגם עם β2-microglobulin ‏(β2-m), חלבון בעל נטייה ליצור עמילואיד הקשור לעמילואידוזיס הקשורה לדיאליזה.

גישה ניסויית פשוטה: יצירת סיבי עמילואיד בהשראת אולטרסאונד

כדי להשרות יצירת סיבים, הונחה מיקרופלטה בעלת 96 באריות במרכז הסוניקטור לפלטות מרובות באריות UIP400MTP, המבטיח חשיפה אחידה לאולטרסאונד בכל הבאריות. תנאי הניסוי היו כדלקמן:

1. כל בארית הכילה 0.2 ml של תמיסת β2-microglobulin ‏(0.3 mg/ml, pH 2.5) בתוספת 5 μM ThT.
2. הפלטה עברה מחזורי סוניקציה, כגון סוניקציה למשך 1 דקה ולאחריה הפסקה של 9 דקות.
3. לאחר הסוניקציה נמדדה פלואורסצנציית ThT באמצעות קורא מיקרופלטות.

(ראו So et al., 2011)

השוואה לערבול קונבנציונלי

בהשוואה לשיטות ערבול מסורתיות, סוניקציה קיצרה באופן דרסטי את שלב ההשהיה של יצירת הסיבים. בתנאי טלטול קונבנציונליים של מיקרופלטות, רק 1 מתוך 10 באריות הראתה עלייה בפלואורסצנציית ThT לאחר 20 שעות. לעומת זאת, באמצעות סוניקציה מחזורית (15 דקות סוניקציה ולאחריהן 5 דקות במנוחה), זוהתה עלייה משמעותית בפלואורסצנציית ThT מיד לאחר טיפול הסוניקציה הראשון.

האצה מהירה של קינטיקת יצירת הסיבים

התוצאות שהתקבלו במחקר של So et al. (2011) הראו כי ניתן להאיץ את היצירה הספונטנית של סיבי β2-microglobulin ב־pH 2.5 מכמה שעות ל־10–15 דקות בלבד באמצעות סוניקציה.
תמונות ממיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) אישרו כי לא ניתן היה להבחין מבחינה מורפולוגית בין סיבים שנוצרו באמצעות סוניקציה למשך 10 דקות בכל 15 דקות לבין אלה שנוצרו באמצעות סוניקציה למשך 1 דקה בכל 10 דקות. הדבר מדגיש את ההדירות והעמידות של תהליך יצירת סיבי העמילואיד בהשראת אולטרסאונד.

תמונות AFM של סיבי עמילואיד שנוצרו באמצעות סוניקציה למשך 1 דקה בכל 10 דקות (i), באמצעות סוניקציה למשך 10 דקות בכל 15 דקות (ii), ובאמצעות תגובת זריעה ללא סוניקציה (iii). קו קנה המידה הלבן מייצג 1 μm.
מחקר ותמונות: ©So et al., 2011

יצירת סיבים בתנאי pH ניטרלי

גם בתנאי pH ניטרלי הושגה יצירת סיבים לאחר זמן השהיה של 1.5 שעות, דבר המראה כי סוניקציה מפחיתה במידה ניכרת את המחסום האנרגטי להתגרענות ולגדילה. ממצא זה מספק תמיכה נוספת בהשערה שיצירת סיבי עמילואיד היא בעיקר תגובה פיזיקלית, המוגבלת במידה רבה על ידי מחסום האנרגיה של ההתגרענות, שאותו הסוניקציה מפחיתה ביעילות.

השפעה על חקר מחלות הקשורות לעמילואיד

ליצירה הקלה והאמינה של סיבי עמילואיד באמצעות הסוניקטור למיקרופלטות UIP400MTP יש השלכות משמעותיות על חקר מחלת אלצהיימר (AD) והפרעות אחרות הקשורות לעמילואיד, כגון מחלת פרקינסון, סוכרת מסוג II ועמילואידוזות מערכתיות. במחלת אלצהיימר, הצטברות עמילואיד־β ‏(Aβ) היא סימן היכר פתולוגי מרכזי, אך חקר קינטיקת יצירת הסיבים שלו נותר מאתגר בשל שלבי השהיה ארוכים ושונות בשיטות הקונבנציונליות. יצירת סיבים המונעת באמצעות סוניקציה מאיצה את ההתגרענות ומבטיחה הדירות גבוהה ושונות מופחתת, דבר החיוני לסריקת מעכבים פוטנציאליים ולהבנת מנגנוני יצירת עמילואיד. יתרה מזאת, יכולת התפוקה הגבוהה של UIP400MTP מאפשרת מחקרים בהיקף נרחב על קיפול שגוי והצטברות של חלבונים, ומקלה על גילוי חומרים טיפוליים שיכולים לווסת את יצירת הסיבים ואולי למתן את התקדמותם של תהליכים ניווניים במערכת העצבים.

מחקר זה מבסס את הסוניקציה באמצעות הסוניקטור לפלטות מרובות באריות UIP400MTP כשיטה יעילה ביותר להאצת יצירת סיבי עמילואיד. היתרונות המרכזיים של גישה זו כוללים:

• קיצור דרמטי של זמן ההשהיה עד ליצירת סיבים.
• חשיפה אחידה לאולטרסאונד בכל הבאריות, המאפשרת יצירת סיבים הדירה.
• יכולת סריקה בתפוקה גבוהה, ההופכת אותה למתאימה לחיפושים כלל־גנומיים אחר הנטייה של חלבונים ליצור עמילואיד.

באמצעות שילוב סוניקציה עם זיהוי פלואורסצנציית ThT, שיטה זו מספקת פלטפורמה מהירה, אמינה וניתנת להרחבה לחקר יצירת סיבי עמילואיד. בהתחשב ביעילותה ובפוטנציאל התפוקה הגבוהה שלה, גישה זו עשויה להקל על סינתזה פשוטה של סיבי עמילואיד למחקר ביופיזיקלי ופרמצבטי, ולהציע כלי מבטיח למחקרים הקשורים לעמילואיד ולסריקת תרופות.