היווצרות עמילואיד פיבריל באמצעות UIP400MTP Microplate Sonicator

סיבי עמילואיד, בדומה לגבישים, נוצרים בתהליך של התגרענות וגדילה לאחר מכן. עם זאת, בשל מחסום האנרגיה החופשית הגבוה של נוקלציה, היווצרות ספונטנית של עמילואיד פיבריל מתרחשת רק לאחר שלב פיגור ממושך. אולטרה-סוניקציה התפתחה ככלי רב עוצמה לגרימת נוקלציה עמילואידית, ובכך מאיצה באופן משמעותי את היווצרות הפיבריל. בשילוב עם קורא מיקרו-צלחות המשתמש בפלואורסצנטיות של תיאופלבין T (ThT), אולטרסוניקציה מאפשרת זיהוי בתפוקה גבוהה של סיבי עמילואיד במספר דגימות בו זמנית.

היווצרות עמילואיד פיבריל המושרה באולטרסאונד עם הסוניקטור UIP400MTP Microplate

עם הסוניקטור UIP400MTP Multi-Well Plate, ניתן לסנתז במהירות סיבי עמילואיד באותה איכות בכמויות גדולות למטרות מחקר. גישה יעילה זו מאפשרת לחקור עמילואידוגניות חלבונית. טכניקה זו מאפשרת פרפור עמילואיד מהיר וניתן לשחזור, כפי שהודגם עם β2-microglobulin (β2-m), חלבון עמילואידוגני הקשור לעמילואידוזיס הקשור לדיאליזה.

גישה ניסיונית פשוטה: פרפור עמילואיד המושרה באולטרסאונד

כדי לגרום להיווצרות פיבריל, הוצב מיקרו-צלחת בעלת 96 בארות במרכז הסוניקטור UIP400MTP רב-באר, המבטיח חשיפה על-קולית אחידה בכל הבארות. תנאי הניסוי היו כדלקמן:

1. כל באר הכילה 0.2 מ"ל של תמיסת β2-מיקרוגלובולין (0.3 מ"ג/מ"ל, pH 2.5) בתוספת 5 מיקרומטר ThT.
2. הצלחת הייתה נתונה למחזורי אולטרה-סוניקציה, כגון אולטרסוניקציה של דקה ואחריה 9 דקות של הפסקה.
3. לאחר סוניקציה, פלואורסצנטיות ThT נמדדה באמצעות קורא microplate.

(ראה: So et al., 2011)

השוואה עם תסיסה קונבנציונלית

בהשוואה לשיטות תסיסה מסורתיות, אולטרסוניקציה הפחיתה באופן דרסטי את שלב הפיגור של היווצרות פיבריל. בתנאים קונבנציונליים של רעידות מיקרו-צלחות, רק 1 מתוך 10 בארות הציגו פלואורסצנטיות מוגברת של ThT לאחר 20 שעות. לעומת זאת, באמצעות אולטרה-סוניקציה מחזורית (15 דקות סוניקציה ואחריה 5 דקות שקט), זוהתה עלייה משמעותית בפלואורסצנטיות ThT מיד לאחר טיפול הסוניקציה הראשון.

האצה מהירה של קינטיקה לפרפור

התוצאות שהתקבלו מ So et al. (2011) הראו כי היווצרות פיבריל ספונטנית של β2-microglobulin ב pH 2.5 יכול להיות מואץ מ כמה שעות רק 10-15 דקות עם ultrasonication.
תמונות של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) אישרו כי סיבים שנוצרו באמצעות אולטרסוניקציה של 10 דקות כל 15 דקות היו בלתי ניתנים להבחנה מורפולוגית מאלה שנוצרו באמצעות אולטרה-סוניקציה של דקה אחת כל 10 דקות. זה מדגיש את יכולת השחזור והחוסן של פרפור עמילואיד המושרה באולטרסאונד.

תמונות AFM של סיבי עמילואיד המיוצרים על ידי אולטרה-סוניקציה של דקה אחת כל 10 דקות (i), על ידי סוניקציה של 10 דקות כל 15 דקות (ii), ועל ידי תגובת הזריעה ללא אולטרה-סוניקציה (iii). סרגל קנה המידה הלבן מייצג 1 מיקרומטר.
מחקר ותמונות: ©So et al., 2011

פרפור בתנאי pH ניטרלי

אפילו בתנאי pH ניטרליים, היווצרות פיבריל הושגה לאחר זמן פיגור של שעה וחצי, מה שמוכיח כי אולטרסוניקציה מורידה באופן משמעותי את המחסום האנרגטי להתגרענות וצמיחה. זה תומך עוד יותר בהשערה כי פרפור עמילואיד הוא בעיקר תגובה פיזית, מוגבלת במידה רבה על ידי מחסום האנרגיה nucleation, אשר ultrasonication למעשה מפחית.

השפעה על מחקר מחלות הקשורות לעמילואיד

להיווצרות קלה ואמינה של סיבי עמילואיד באמצעות הסוניקטור UIP400MTP microplate יש השלכות משמעותיות על מחקר מחלת אלצהיימר (AD) והפרעות אחרות הקשורות לעמילואיד, כגון מחלת פרקינסון, סוכרת מסוג II ועמילואידוסים מערכתיים. באלצהיימר, צבירת β עמילואיד (Aβ) היא סימן היכר פתולוגי מרכזי, אך חקר קינטיקה הפרפור שלה נותר מאתגר בשל שלבי פיגור ארוכים ושונות בשיטות קונבנציונליות. היווצרות פיבריל מונעת אולטרסוניקציה מאיצה נוקלציה, מבטיחה יכולת שחזור גבוהה ושונות מופחתת, שהיא חיונית לסינון מעכבים פוטנציאליים ולהבנת מנגנונים עמילואידוגניים. יתר על כן, יכולת התפוקה הגבוהה של UIP400MTP מאפשרת חקירות בקנה מידה גדול של קיפול שגוי וצבירה של חלבונים, מה שמקל על גילוי של חומרים טיפוליים שיכולים לווסת היווצרות פיבריל ואולי למתן התקדמות נוירודגנרטיבית.

מחקר זה מבסס אולטרסוניקציה באמצעות הסוניקטור UIP400MTP Multi-Well Plate Sonicator כשיטה יעילה ביותר להאצת היווצרות פיבריל עמילואיד. היתרונות העיקריים של גישה זו כוללים:

• הפחתה דרמטית בזמן הפיגור לפרפור.
• חשיפה אחידה לאולטרסאונד בכל הבארות, המאפשרת היווצרות פיבריל הניתנת לשחזור.
• יכולת סינון בתפוקה גבוהה, מה שהופך אותו מתאים לחיפושים ברחבי הגנום של עמילואידוגניות חלבונית.

על ידי שילוב אולטרה-סוניקציה עם זיהוי פלואורסצנטי ThT, שיטה זו מספקת פלטפורמה מהירה, ניתנת להרחבה ואמינה לחקר פרפור עמילואיד. בהתחשב ביעילותה ובפוטנציאל התפוקה הגבוה שלה, גישה זו עשויה להקל על סינתזה קלה של סיבי עמילואיד למחקר ביופיזי ופרמצבטי, ומציעה כלי מבטיח למחקרים הקשורים לעמילואיד ולבדיקת תרופות.