PMCA לזיהוי פריונים בתפוקה גבוהה באמצעות UIP400MTP Sonicator

הסוניקטור UIP400MTP Multi-Well Plate Sonicator מציע פתרון רב עוצמה להכנת דגימות בתפוקה גבוהה בהגברה מחזורית של קיפול שגוי של חלבונים (PMCA). על ידי אספקת פיזור אנרגיה אחיד על פני בארות מרובות ושמירה על פרמטרים סוניים מדויקים, מערכת זו מאפשרת עיבוד בו זמנית של דגימות רבות עם יכולת שחזור יוצאת דופן. יכולות אלה קריטיות לאופטימיזציה של PMCA לאיתור פריונים בריכוזים נמוכים בדגימות ביולוגיות מאתגרות, כגון רוק, שם מעכבי בדיקה יכולים לטשטש את התוצאות.

מחלות פריון, כגון מחלת בזבוז כרונית (CWD) בצוואר הרחם ומחלת קרויצפלד-יעקב (CJD) בבני אדם, הן הפרעות נוירודגנרטיביות הנגרמות על ידי חלבוני פריון שאינם מקופלים כהלכה (PrP^סק). מחלות אלה מערבות לעתים קרובות רמות נמוכות של פריונים זיהומיים בנוזלי הגוף, כגון רוק, דם ושתן, מה שמסבך את האבחון והמחקר. להעברה אופקית של CWD דרך פריונים שנשפכו במטריצות סביבתיות יש השלכות משמעותיות במיוחד על ניהול חיות הבר ובריאות אקולוגית. באופן דומה, במחלות כמו מחלת קרויצפלד-יעקב, הגברה אמינה של חלבוני פריון מקופלים שלא כהלכה מדגימות אנושיות חיונית לקידום האבחון ולהבנת התקדמות המחלה.

יישום פרוטוקול PMCA שונה מאפשר לעקוף מעכבי בדיקה נפוצים (למשל, מוצינים ברוק) ולהשיג רגישות גבוהה באיתור פריונים שאחרת לא היו ניתנים לגילוי או מעורפלים באמצעות טכניקות כגון המרה בזמן אמת הנגרמת על ידי רעידות אדמה (RT-QuIC). התקדמות זו משפרת את זיהוי הפריונים עבור מחלות שונות, מה שהופך את PMCA לכלי חיוני למחקר פריונים ואבחון. UIP400MTP הסוניקטור מרובה הבארות מאפשר PMCA בתפוקה גבוהה הסוניק דגימות רבות במיקרו-צלחות (למשל לוחות 6, 24 או 96 בארות) או בקבוקונים במדף צינורות.

פרוטוקול להגברה מחזורית של קיפול שגוי של חלבון בתפוקה גבוהה (PMCA)

הפרוטוקול הבא מאפשר עיבוד יעיל של מספר מדגם גבוה באותם תנאים בדיוק לקבלת תוצאות מחקר חזקות.

הכנת דוגמאות

חומר התחלתי:
הכינו דוגמאות על ידי:

• השעיית כדורי מיצוי סרקוזיל במצע PMCA.
• זינוק ישיר הומוגנאטים במוח או דגימות דם עם זרעי פריון.

המצע:

• השתמש בהומוגנט מוח של 10% (wt/vol) שהוכן מעכברים טרנסגניים המבטאים יתר על המידה PrP^C (למשל, עכברי Tg).
• הומוגניזציה של רקמת המוח ב:
  – 1× PBS.
  – 150 מ"מ NaCl.
  – 1% טריטון X-100.
• אחסנו את המצע בטמפרטורה של -80ºC עד לשימוש.

הגדרה לדוגמה במיקרו-צלחת או בצינורות:
צינורות:

• הוסף 90 μL של מצע הומוגני במוח וזרע עם 10 μL של דגימה (למשל, דם, הומוגנט במוח, או גלולת סרקוזיל).
• מניחים 3 חרוזי טפלון (קוטר 1.59 מ"מ או 2.38 מ"מ) בכל צינור 0.2 מ"ל.
• הרכיבו את הצינורות בארון תקשורת התואם לסוניקטור UIP400MTP.

6-באר microplate:

• הוסף 5 מ"ל של מצע הומוגני במוח וזרע עם 500 μL של מדגם לכל באר.
• מוסיפים 3 חרוזי טפלון לכל באר.

נוהל PMCA

מיקום:
הניחו את מתלה הצינור או צלחת מיקרו בעלת 6 בארות לתוך הסוניקטור UIP400MTP בהתאם להוראות היצרן.

תוכנית רכיבה על אופניים:
בצע 144 מחזורי PMCA באופן הבא:

• דגירה: 29 דקות ו-30 שניות ב-37°C.
• סוניקציה: 30 שניות באמפליטודה של 60%.
• ניטור הטמפרטורה: השתמש בחיישן הטמפרטורה הניתן לחיבור כדי לנטר את טמפרטורת הדגימה ולתכנת את UIP400MTP לטמפרטורה מרבית של 48-50°C.

הסבבים הבאים:
לאחר השלמת הסבב הראשון של 144 מחזורים, להעביר aliquot של החומר המוגבר:

• לדלל פי 10 למצע הומוגני טרי במוח עכבר מהונדס.
• בצע 96 מחזורי PMCA לסבבים הבאים, תוך שמירה על אותם פרמטרים של סוניקציה.
• המשך למספר הסבבים הרצוי (בדרך כלל עד 5).

איתור PrP^סק

1. עיכול פרוטאינאז K:
   – יש לטפל בדגימות עם פרוטאינאז K (50 מיקרוגרם/מ"ל) בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
   – יש לסיים את העיכול על ידי הוספת מאגר דגימת SDS והרתחה למשך 10 דקות.
2. ניתוח כתם מערבי:
   – נתח דגימות מעוכלות באמצעות:
   – נוגדנים 6H4 או PRC1 נגד PrP.
   – ביצוע SDS-PAGE והעברה לממברנות PVDF לצורך זיהוי.

 

 

עבד דוגמאות נוספות לקבלת תוצאות חזקות יותר

הסוניקטור UIP400MTP Multi-Well Plate משפר באופן משמעותי את היעילות והמדרגיות של הגברה מחזורית של קיפול שגוי של חלבונים (PMCA), תוך התייחסות לאופי הגוזל זמן מסורתי של ההליך. על ידי מתן אפשרות לעיבוד סימולטני של עד 96 דגימות בלוח של 96 בארות, המערכת מייעלת את תהליכי העבודה של PMCA תוך שמירה על תנאי סוניקציה מדויקים ואחידים בכל הבארות. יכולת תפוקה גבוהה זו ממזערת את הטיפול הידני, מפחיתה שלבים עתירי עבודה ומבטיחה יכולת שחזור, מה שהופך אותה לכלי חיוני למחקר פריונים. בין אם חוקרים מחלת בזבוז כרונית או מחלת קרויצפלד-יעקב, UIP400MTP מאפשר מחקרים בקנה מידה גדול ביעילות רבה יותר, ומאפשר לחוקרים לעמוד בדרישות של יישומים אבחוניים ומדעיים מודרניים.

---

---

ספרות / מקורות

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.