PMCA לזיהוי פריונים בתפוקה גבוהה באמצעות מכשיר הסוניקציה UIP400MTP

מכשיר הסוניקציה UIP400MTP לפלטות מרובות בארות מציע פתרון רב עוצמה להכנת דגימות בתפוקה גבוהה לצורך הגברה מחזורית של קיפול חלבונים שגוי (PMCA). באמצעות פיזור אנרגיה אחיד בין בארות רבות ושמירה על פרמטרי סוניקציה מדויקים, מערכת זו מאפשרת עיבוד בו־זמני של דגימות רבות עם הדירות יוצאת דופן. יכולות אלו חיוניות לאופטימיזציה של PMCA לזיהוי פריונים בריכוזים נמוכים בדגימות ביולוגיות מאתגרות, כגון רוק, שבהן חומרים המעכבים את הבדיקה עלולים לטשטש את התוצאות.

מחלות פריונים, כגון מחלת הדלדול הכרונית (CWD) באייליים ומחלת קרויצפלד־יעקב (CJD) בבני אדם, הן מחלות ניווניות של מערכת העצבים הנגרמות מחלבוני פריון בעלי קיפול שגוי (PrP^Sc). מחלות אלו כרוכות לעיתים קרובות ברמות נמוכות של פריונים מידבקים בנוזלי גוף, כגון רוק, דם ושתן, דבר המקשה על האבחון והמחקר. להעברה אופקית של CWD באמצעות פריונים המופרשים למטריצות סביבתיות יש השלכות משמעותיות במיוחד על ניהול אוכלוסיות חיות בר ועל הבריאות האקולוגית. בדומה לכך, במחלות כגון מחלת קרויצפלד־יעקב, הגברה אמינה של חלבוני פריון בעלי קיפול שגוי מדגימות אנושיות חיונית לקידום האבחון ולהבנת התקדמות המחלה.

יישום פרוטוקול PMCA מותאם מאפשר להתגבר על חומרים נפוצים המעכבים את הבדיקה (למשל, מוצינים ברוק) ולהשיג רגישות גבוהה בזיהוי פריונים שאחרת לא היו ניתנים לזיהוי או שתוצאות זיהוים היו מעורפלות בשיטות כגון המרה המושרית בטלטול בזמן אמת (RT-QuIC). התקדמות זו משפרת את זיהוי הפריונים במחלות שונות, והופכת את PMCA לכלי הכרחי במחקר ובאבחון של פריונים. מכשיר הסוניקציה UIP400MTP לפלטות מרובות בארות מאפשר PMCA בתפוקה גבוהה באמצעות סוניקציה של דגימות רבות במיקרופלטות (למשל, פלטות בעלות 6, 24 או 96 בארות) או בבקבוקונים במעמד מבחנות.

פרוטוקול להגברה מחזורית של קיפול חלבונים שגוי (PMCA) בתפוקה גבוהה

הפרוטוקול הבא מאפשר עיבוד יעיל של מספר רב של דגימות בתנאים זהים לחלוטין, לקבלת תוצאות מחקר מבוססות.

הכנת דגימות

חומר מוצא:
הכינו דגימות באמצעות:

• הרחפה מחדש של משקעי מיצוי בסרקוזיל במצע PMCA.
• הוספה ישירה של זרעי פריונים להומוגנטים של מוח או לדגימות דם.

מצע:

• השתמשו בהומוגנט מוח בריכוז 10% (משקל/נפח), שהוכן מעכברים טרנסגניים המבטאים ביתר PrP^C (למשל, עכברי Tg).
• בצעו הומוגניזציה של רקמת המוח בתוך:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• אחסנו את המצע ב־-80ºC עד לשימוש.

סידור הדגימות במיקרופלטה או במבחנות:
מבחנות:

• הוסיפו 90 μL של מצע הומוגנט מוח וזרעו באמצעות 10 μL של דגימה (למשל, דם, הומוגנט מוח או משקע סרקוזיל).
• הניחו 3 חרוזי טפלון (בקוטר 1.59-mm או 2.38-mm) בכל מבחנה בנפח 0.2 mL.
• הציבו את המבחנות במעמד התואם למכשיר הסוניקציה UIP400MTP.

מיקרופלטה בעלת 6 בארות:

• הוסיפו לכל באר 5 mL של מצע הומוגנט מוח וזרעו באמצעות 500 μL של דגימה.
• הוסיפו 3 חרוזי טפלון לכל באר.

הליך PMCA

הצבה:
הניחו את מעמד המבחנות או את המיקרופלטה בעלת 6 הבארות בתוך מכשיר הסוניקציה UIP400MTP בהתאם להוראות היצרן.

תוכנית מחזורים:
בצעו 144 מחזורי PMCA באופן הבא:

• הדגרה: 29 דקות ו־30 שניות ב־37°C.
• סוניקציה: 30 שניות באמפליטודה של 60%.
• נטרו את הטמפרטורה: השתמשו בחיישן הטמפרטורה הניתן לחיבור כדי לנטר את טמפרטורת הדגימה, ותכנתו את UIP400MTP לטמפרטורה מרבית של 48–50°C.

סבבים נוספים:
לאחר השלמת הסבב הראשון של 144 מחזורים, העבירו מנה מדודה מהחומר המוגבר:

• מהלו פי 10 במצע טרי של הומוגנט מוח מעכבר טרנסגני.
• בצעו 96 מחזורי PMCA בסבבים הנוספים, תוך שמירה על אותם פרמטרי סוניקציה.
• המשיכו עד למספר הסבבים הרצוי (בדרך כלל עד 5).

זיהוי PrP^Sc

1. עיכול באמצעות פרוטאינאז K:
   – טפלו בדגימות באמצעות פרוטאינאז K ‏(50 μg/mL) ב־37°C למשך 1 שעה.
   – הפסיקו את העיכול באמצעות הוספת בופר דגימה המכיל SDS והרתחה למשך 10 דקות.
2. אנליזת Western blot:
   – נתחו את הדגימות שעברו עיכול באמצעות:
   – נוגדני 6H4 או PRC1 נגד PrP.
   – בצעו SDS-PAGE והעבירו לממברנות PVDF לצורך זיהוי.

 

Hielscher UIP400MTP הוא הסוניקטור הגמיש ביותר לשימוש עם פלטות מרובות באריות, פלטות PCR או מבחנות דגימה. בהספק סוניקציה רציף של 400 ואט, הוא מיועד ליישומים כגון פירוק תאים, יצירת תחליבים, מיצוי חלבונים, קיטוע DNA / RNA, פירוק אגלומרטים, מיצוי מדגימות FFPE, ניתוק תאים וביופילם או יצירת תחליבים. UIP400MTP אינו אמבט אולטרסוני. זהו מתמר כוס בעוצמה גבוהה לסוניקציה ממוקדת. סוניקטור רב־עוצמה זה, הפועל ללא מגע, מספק סוניקציה אחידה בכל הבאריות של פלטת הבאריות התקנית שלכם. ניתן לשלוט במדויק במשרעת, בהספק ובפעימה. טיימר מובנה וגשש טמפרטורה מבטיחים תוצאות עקביות. הסוניקטור לפלטות UIP400MTP מקרר דגימות באמצעות אמבט מים, עם אפשרות ליחידת קירור חיצונית.

 

עבדו יותר דגימות לקבלת תוצאות מבוססות יותר

מכשיר הסוניקציה UIP400MTP לפלטות מרובות בארות משפר משמעותית את היעילות ואת היכולת להרחיב את היקף ההגברה המחזורית של קיפול חלבונים שגוי (PMCA), ונותן מענה לכך שההליך דורש באופן מסורתי זמן רב. המערכת מאפשרת עיבוד בו־זמני של עד 96 דגימות בפלטה בעלת 96 בארות, וכך מייעלת את תהליכי העבודה של PMCA תוך שמירה על תנאי סוניקציה מדויקים ואחידים בכל הבארות. יכולת זו לעבודה בתפוקה גבוהה ממזערת טיפול ידני, מצמצמת שלבים עתירי עבודה ומבטיחה הדירות, והופכת את המכשיר לכלי הכרחי לחקר פריונים. בין שחוקרים את מחלת הדלדול הכרונית ובין שחוקרים את מחלת קרויצפלד־יעקב, UIP400MTP מאפשר מחקרים בקנה מידה גדול ביעילות רבה יותר, ומאפשר לחוקרים לעמוד בדרישות של יישומים אבחוניים ומדעיים מודרניים.

---

---

ספרות / מקורות

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.