Mitoxondrial Diaqnostika üçün Yüksək Təsirli Nümunə Hazırlanması
Tədqiqat və klinikalarda mitoxondrial diaqnostika ardıcıllıq, PCR və biokimyəvi analizlər kimi müxtəlif üsullardan istifadə etməklə həyata keçirilir. Bu üsullar DNT mutasiyalarını müəyyən etmək və mitoxondrial funksiyanı ölçmək üçün istifadə olunur. Ardıcıllıq genetik mutasiyaları aşkar etməyə kömək edir, PCR isə spesifik DNT ardıcıllıqlarını ölçə bilir. Biokimyəvi analizlər mitoxondrial zülalların və fermentlərin funksionallığını qiymətləndirir.
Mitoxondrial xəstəliklərin diaqnostikası bu xəstəliklərin açıq-aşkar klinik dəyişkənliyi, eləcə də iki fərqli irsi genom: mitoxondrial DNT (mtDNT) və nüvə genomu arasında mürəkkəb qarşılıqlı əlaqə səbəbindən xüsusilə çətindir.
Sonication istifadə edərək DNT-nin çıxarılması və fraqmentasiyası
Əzələ toxumasından DNT çıxarılması xüsusilə mtDNA-da toxuma spesifik dəyişikliklərdən şübhələnildikdə faydalıdır. Bu dəyişikliklərə xroniki mütərəqqi xarici oftalmoplegiya (CPEO) zamanı mtDNT-nin silinməsi, mitoxondrial miopatiyalarda mtDNT-nin nöqtə mutasiyaları və ya Alpers sindromunda mtDNT-nin tükənməsi daxil ola bilər. Əzələ toxumasından çıxarılan DNT daha sonra müxtəlif genetik testlər üçün istifadə edilə bilər, məsələn, Southern blot və silinmələr üçün uzun məsafəli PCR, tükənmə üçün real vaxt PCR və ya nöqtə mutasiyaları üçün ardıcıllıq.
Güclü ultrasəs dalğalarından istifadə edərək sonikasiya mitoxondrial diaqnostikada bir neçə tətbiq üçün tətbiq olunur. O, mitoxondriya və DNT kimi hüceyrədaxili məzmunu çıxarmaq, ardıcıllıq üçün mtDNA və nDNA kimi DNT-ni kəsmək və nümunələri homogenləşdirmək üçün hüceyrələri lize etmək üçün istifadə olunur.
Yüksək məhsuldarlıqlı nümunə hazırlamaq üçün UIP400MTP Plate Sonicator nümunələri çox quyu və 96 quyu plitələrində vahid sonikasiya edir
Mitoxondriləri hüceyrələrdən və toxumalardan necə təcrid etmək olar
Mitoxondrial təcrid iki əsas addımdan ibarətdir: hüceyrələrin məzmununu sərbəst buraxması və mitoxondrial fraksiyaları ayırmaq və bərpa etmək üçün diferensial sentrifuqasiyadan istifadə etmək.
sonication
Hielscher sonicators standart lizis tamponları və dəstləri ilə uyğun gəlir, bu da onları mitoxondriyaların izolyasiyası üçün uyğun edir. Sonikasiya iki əsas məqsədə xidmət edir:
- Hüceyrə lizisi: Ultrasəs dalğaları hüceyrə membranlarını pozaraq hüceyrədaxili məzmunu buraxır.
- Mitoxondrial pozğunluqlar: Sonrakı addımda sonikasiya mitokondriyal zülalları və ya mitoxondrial DNT-ni buraxmaq üçün mitoxondriləri qıra bilər.
- mtDNT fraqmentasiyası: Sonikasiya ardıcıllıq üçün mitoxondrial DNT-ni kəsmək üçün etibarlı bir texnikadır.
Çox quyulu boşqab sonikatoru UIP400MTP mitoxondrial nümunələrin yüksək məhsuldarlıqlı nümunə hazırlanmasına imkan verir. Diferensial sentrifuqasiya ilə birlikdə sonikasiya mitoxondrial izolyasiyanın səmərəliliyini artırır, müxtəlif aşağı axın tətbiqləri üçün uyğun olan bütöv mitoxondrilərin yüksək məhsuldarlığını təmin edir.
Hielscher UIP400MTP çoxqulu boşqab sonikatoru istənilən standart lövhə ilə işləyir
Çox quyulu boşqab sonikatoru UIP400MTP, məsələn, mitoxondrial diaqnostikada yüksək məhsuldarlıqlı nümunənin hazırlanması üçün çoxsaylı üstünlüklər təklif edir.
Biomarker diaqnostikasında yüksək məhsuldarlıqlı nümunənin hazırlanması üçün UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator.
Ultrasonik mtDNT Fragmentasiyası üçün Nümunəvi Təlimatlar
Hazırlanması və çıxarılması:
- C57BL/6 siçanları servikal dislokasiya ilə öldürüldü.
- Qaraciyərlər tez çıxarıldı və buz kimi soyuq steril PBS-də yuyuldu.
Mitoxondriya izolyasiyası:
- Mitoxondriya 2 ml Dounce toxuma dəyirmanı və Toxuma üçün Mitoxondriya İzolyasiya Kitindən istifadə edərək təcrid edilmişdir.
- 700 × g və 3000 × g-də ilkin sentrifuqalama.
- Bufer C ilə əlavə iki yuma addımını yerinə yetirin.
DNT izolyasiyası:
- 700 × g-də ilk sentrifuqadan alınan qranul nüvə DNT-ni (nDNT) təcrid etmək üçün istifadə edilmişdir.
- DNT spin sütunları istifadə edərək təcrid edilmişdir.
- Mitoxondrial DNT (mtDNT) təcrid olunmuş mitoxondriyadan çıxarılıb.
- Nüvə DNT (nDNT) həm siçan qaraciyər toxumasından xam nüvə ekstraktlarından çıxarılıb.
DNT fraqmentasiyası:
- DNT 2 × 30 saniyə ərzində 14 μm-də 0,5 mm mikro-ucu sonotrode ilə 30 kHz/50 Vt ultrasəs sonikatoru UP50H istifadə edərək buz üzərində parçalandı.
Parçalanmanın vizuallaşdırılması və kəmiyyəti:
- Ultrasəsdən sonra parçalanma SYBR təhlükəsiz DNT boyası ilə 1% agaroz geldə vizuallaşdırıldı.
- mtDNT və nDNT-nin nisbi bolluğu qPCR ilə müəyyən edilmişdir.
(müq. Mariero və başqaları, 2019)
Yüksək məhsuldarlıqlı nümunənin hazırlanması üçün çox quyulu boşqab sonikatoru UIP400MTP standart 96 quyu, çox quyu və mikrotitr plitələrdə böyük nümunə nömrələrinin hazırlanmasını asanlaşdırır.
UIP400MTP istifadə edərək yüksək məhsuldarlıqlı nümunə hazırlığının üstünlükləri haqqında ətraflı oxuyun!
Sonication istifadə edərək optimal mitoxondri izolyasiyası üçün göstərişlər:
- Temperatur nəzarəti: Bütün addımları 0°C-dən 4°C-ə qədər olan temperaturda aparın. Bu, mitoxondriyanın bütövlüyünü və funksionallığını qorumaq üçün vacibdir.
- Səmərəlilik və Sürət: Sürətlə işləyin və mitoxondriləri yalnız xüsusi tətbiqiniz üçün tələb olunan dərəcədə təmizləyin. Həddindən artıq manipulyasiya mitokondrial məzmunun əhəmiyyətli itkilərinə səbəb ola bilər.
- Süspansiyonların seyreltilməsi: İzolyasiya prosesi boyunca hüceyrə və orqanel suspenziyalarının aşağı konsentrasiyasını qoruyun. Bu, tələyə düşmə və aglütinasiya risklərini minimuma endirməyə kömək edir və bununla da təcrid olunmuş mitoxondriyanın təmizliyini yaxşılaşdırır.
- Nümunə Həcmi: Tək bir böyükdən daha çox kiçik miqyaslı hazırlıqlara üstünlük verin. Bu yanaşma adətən daha yaxşı məhsuldarlıqla nəticələnir, çünki miqyasının artırılması bərpa edilə bilən mitoxondrilərin miqdarını mütənasib şəkildə artırmır. Çox quyulu boşqab sonikatoru UIP400MTP, mitoxondriyanın təcrid olunması üçün hüceyrənin sürətli və etibarlı parçalanmasını, həmçinin mitoxondriyadan protein çıxarılmasını asanlaşdırır.
Bu təlimatlar ultrasəs lizis və sentrifuqadan istifadə edərək izolyasiya prosesini daha səmərəli edəcək, aşağı axın tətbiqləri üçün uyğun yüksək keyfiyyətli mitoxondrial preparatlar verəcəkdir.
Hielscher Sonicators – Keyfiyyətli Almaniya istehsalı
Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Sağlamlıq və asan əməliyyat ultrasəs aparatlarımızın sənaye obyektlərinə rahat inteqrasiyasına imkan verir. Kobud şərtlər və tələbkar mühitlər Hielscher ultrasəs cihazları tərəfindən asanlıqla idarə olunur.
Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikatlı bir şirkətdir və ən müasir texnologiya və istifadəçi dostu olan yüksək performanslı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə ki, Hielscher ultrasəs cihazları CE-yə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərinə cavab verir.
Mikrotiter və çoxqulu plitələrin sonikasiyası üçün 96 quyulu boşqab sonikatoru UIP400MTP
Ədəbiyyat / İstinadlar
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mitokondriya və Mitokondrial Diaqnostika haqqında Tez-tez verilən suallar
Mitoxondriya nədir?
Mitoxondriyalar əksər eukaryotik orqanizmlərin hüceyrələrində olan membrana bağlı orqanoidlərdir. Hüceyrə tənəffüs prosesi ilə adenozin trifosfat (ATP) şəklində enerji istehsal etdikləri üçün hüceyrənin güc mərkəzləri kimi tanınırlar. Bundan əlavə, mitoxondriyanın öz DNT-si var və hüceyrə dövrünün və hüceyrə ölümünün tənzimlənməsi də daxil olmaqla, digər hüceyrə proseslərində əsas rol oynayır.
MtDNT-ni Genomik DNT-dən nə ilə fərqləndirir?
Mitoxondrial DNT (mtDNA) genomik DNT-dən (gDNA) bir neçə əsas cəhətdə fərqlənir. MtDNA mitoxondriyada yerləşir, dairəvidir və ana tərəfindən miras alınır, gDNT isə hüceyrə nüvəsində yerləşir, xəttidir və hər iki valideyndən miras alınır. MtDNA daha kiçikdir, yalnız 37 geni kodlayır, gDNA isə təxminən 20.000-25.000 gen ehtiva edir. MtDNA hüceyrə başına bir neçə nüsxədə mövcuddur, daha yüksək mutasiya dərəcəsinə malikdir və ilk növbədə mitoxondrial funksiyada iştirak edən zülalları kodlayır. Bunun əksinə olaraq, gDNT tipik olaraq diploiddir, daha az mutasiya dərəcəsinə malikdir və orqanizmin inkişafı və funksiyası üçün zəruri olan çoxlu genləri kodlaşdırır. Bundan əlavə, mtDNT transkripsiyası və tərcüməsi mitoxondriyada baş verir, gDNT transkripsiyası isə nüvədə, tərcümə isə sitoplazmada baş verir. Bu fərqlər onların fərqli rollarını və təkamül mənşəyini əks etdirir.
Cell-Free Extract nədir?
Hüceyrəsiz ekstrakt zülallar, nuklein turşuları və digər hüceyrə komponentləri daxil olmaqla, parçalanmış hüceyrələrin məzmununu ehtiva edən, lakin toxunulmaz hüceyrə membranları olmayan bir məhluldur. Bu ekstrakt biokimyəvi və molekulyar biologiya tədqiqatlarında hüceyrə proseslərini in vitro öyrənmək üçün istifadə olunur, tədqiqatçılara canlı hüceyrələrdən kənar reaksiyaları və mexanizmləri təhlil etməyə imkan verir.
Mitoxondrial Diaqnostikada PCR Testlərinin Rolu Nədir?
PCR testləri mitoxondrial DNT-də (mtDNT) mutasiyaların, silinmələrin və ya surət sayı dəyişikliklərinin aşkar edilməsinə imkan verməklə mitoxondrial diaqnostikada mühüm rol oynayır. Onlar mitoxondrial pozğunluqlarla əlaqəli patogen variantları müəyyən etmək üçün xüsusi mtDNT bölgələrinin gücləndirilməsinə imkan verir. Kəmiyyət PCR (qPCR) və uzunmüddətli PCR kimi PCR-əsaslı üsullar, həmçinin mtDNT bütövlüyünü, heteroplazma səviyyələrini və mtDNA tükənməsini qiymətləndirmək üçün istifadə olunur, mitoxondrial funksiya və xəstəlik haqqında əsas anlayışları təmin edir.
UIP400MTP Microplate Sonicator-un PCR testlərini və təhlillərini necə asanlaşdırdığını öyrənin!
Diferensial sentrifuqasiya nədir?
Diferensial sentrifuqasiya hüceyrə fraksiyaları və mitoxondrilərin izolyasiyası üçün geniş istifadə olunan bir texnikadır. Bu üsul həm sıxlıqdan, həm də formadan asılı olan sedimentasiya əmsalı əsasında hüceyrə strukturlarını ayırır. Proses xüsusi sıxlığa malik tamponlu duz məhlullarında olan nümunələrə müxtəlif səviyyələrdə mərkəzdənqaçma qüvvəsinin tətbiqini nəzərdə tutur. Bənzər çöküntü əmsallarına malik strukturlar eyni vaxtda toplama borusunun dibində yerləşəcək və onların bərpasına imkan verəcəkdir.
Diferensial sentrifuqadan mitoxondriyanın izolyasiyası üçün necə istifadə olunur?
Diferensial sentrifuqa tədqiqatçılara mitoxondrial fraksiyaları digər hüceyrə komponentlərindən effektiv şəkildə ayırmağa imkan verir. Mitoxondriyanın təcrid edilməsi bir neçə sentrifuqasiya mərhələsini və təcridin sonrakı bərpasını əhatə edir.
İlkin sentrifuqasiya: Böyük hüceyrə zibillərini və nüvələrini çöküntü etmək üçün aşağı mərkəzdənqaçma qüvvəsi tətbiq edin.
Sonrakı sentrifuqalar: Mitoxondriya ilə zənginləşdirilmiş qranul fraksiyalarına qədər mərkəzdənqaçma qüvvəsini addım-addım artırın. Hər bir sentrifuqalama addımı getdikcə daha yüksək çökmə əmsalları olan strukturları aradan qaldırır.
Fraksiya bərpası: Hər sentrifuqadan sonra qranul toplanır və supernatant növbəti fraksiyanı təcrid etmək üçün daha yüksək g qüvvələrinə məruz qalır. Bu, mitoxondriyanın istənilən saflığına nail olunana qədər təkrarlanır.