Mitoxondrial diaqnostika üçün yüksək sayda nümunənin hazırlanması
Tədqiqatlarda və klinikalarda mitoxondrial diaqnostika sekvensləmə, PCR və biokimyəvi analizlər kimi müxtəlif üsullarla aparılır. Bu üsullar DNA mutasiyalarını müəyyən etmək və mitoxondrial funksiyanı ölçmək üçün istifadə olunur. Sekvensləmə genetik mutasiyaları aşkar etməyə kömək edir, PCR isə xüsusi DNA ardıcıllıqlarının miqdarını təyin edə bilir. Biokimyəvi analizlər mitoxondrial zülalların və fermentlərin funksionallığını qiymətləndirir.
Mitoxondrial xəstəliklərin diaqnostikası bu xəstəliklərin nəzərəçarpan klinik dəyişkənliyi, eləcə də fərqli yollarla irsən ötürülən iki genom – mitoxondrial DNA (mtDNA) və nüvə genomu – arasındakı mürəkkəb qarşılıqlı əlaqə səbəbindən xüsusilə çətindir.
Sonikasiya ilə DNA-nın ekstraksiyası və fraqmentasiyası
mtDNA-da toxumaya xas dəyişikliklərdən şübhələnildikdə əzələ toxumasından DNA-nın ekstraksiyası xüsusilə faydalıdır. Bu dəyişikliklərə xroniki proqressiv xarici oftalmoplegiya (CPEO) zamanı mtDNA delesiyaları, mitoxondrial miopatiyalar zamanı mtDNA-nın nöqtə mutasiyaları və ya Alpers sindromunda mtDNA miqdarının azalması daxil ola bilər. Əzələ toxumasından ekstraksiya edilmiş DNA daha sonra müxtəlif genetik testlər üçün istifadə oluna bilər: məsələn, delesiyalar üçün Southern blot və uzun fraqmentli PCR, mtDNA miqdarının azalması üçün real vaxt PCR və ya nöqtə mutasiyaları üçün sekvensləmə.
İntensiv ultrasəs dalğalarından istifadə edən sonikasiya mitoxondrial diaqnostikada bir neçə məqsədlə tətbiq olunur. Bu üsul mitoxondrilər və DNA kimi hüceyrədaxili komponentləri çıxarmaq üçün hüceyrələri lizisə uğratmaq, sekvensləmə üçün mtDNA və nDNA kimi DNA-nı kəsici qüvvələrlə parçalamaq və nümunələri homogenləşdirmək üçün istifadə olunur.
Yüksək sayda nümunənin hazırlanması üçün UIP400MTP lövhə sonikatoru çoxyuvalı və 96-yuvalı lövhələrdəki nümunələri bərabər şəkildə sonikasiyaya məruz qoyur
Mitoxondriləri hüceyrələrdən və toxumalardan necə təcrid etmək olar
Mitoxondrilərin təcridi iki əsas mərhələdən ibarətdir: hüceyrələrin tərkibini sərbəst buraxmaq üçün onların parçalanması və mitoxondrial fraksiyaları ayırıb əldə etmək üçün diferensial sentrifuqalamadan istifadə edilməsi.
Sonikasiya
Hielscher sonikatorları standart lizis buferləri və dəstləri ilə uyğundur, buna görə də mitoxondrilərin təcridi üçün yararlıdır. Sonikasiya iki əsas məqsədə xidmət edir:
- Hüceyrə lizisi: Ultrasəs dalğaları hüceyrə membranlarını parçalayaraq hüceyrədaxili komponentləri sərbəst buraxır.
- Mitoxondrilərin parçalanması: Sonrakı mərhələdə sonikasiya mitoxondriləri parçalayaraq mitoxondrial zülalları və ya mitoxondrial DNA-nı sərbəst buraxa bilər.
- mtDNA fraqmentasiyası: Sonikasiya sekvensləmə üçün mitoxondrial DNA-nı kəsici qüvvələrlə parçalamağın etibarlı üsuludur.
UIP400MTP çoxyuvalı lövhə sonikatoru yüksək sayda mitoxondrial nümunənin hazırlanmasına imkan verir. Diferensial sentrifuqalama ilə birlikdə sonikasiya mitoxondrilərin təcridinin səmərəliliyini artıraraq müxtəlif sonrakı tətbiqlər üçün yararlı, bütöv mitoxondrilərin yüksək çıxımını təmin edir.
Hielscher UIP400MTP çoxyuvalı lövhə sonikatoru istənilən standart lövhə ilə işləyir
UIP400MTP çoxyuvalı lövhə sonikatoru yüksək sayda nümunənin hazırlanması, məsələn, mitoxondrial diaqnostika üçün çoxsaylı üstünlüklər təklif edir.
Biomarker diaqnostikasında yüksək sayda nümunənin hazırlanması üçün UIP400MTP çoxyuvalı lövhə sonikatoru.
Ultrasəs vasitəsilə mtDNA fraqmentasiyası üçün nümunəvi təlimatlar
Hazırlıq və ekstraksiya:
- C57BL/6 siçanları boyun fəqərələrinin dislokasiyası ilə öldürülmüşdür.
- Qaraciyərlər sürətlə çıxarılmış və buz kimi soyuq steril PBS-də yuyulmuşdur.
Mitoxondrilərin təcridi:
- Mitoxondrilər 2-mL Dounce toxuma homogenizatoru və toxuma üçün mitoxondri təcridi dəsti istifadə edilərək təcrid edilmişdir.
- 700× g və 3.000× g-də ilkin sentrifuqalama.
- C buferi ilə iki əlavə yuma mərhələsi həyata keçirin.
DNA-nın təcridi:
- 700× g-də ilk sentrifuqalama nəticəsində alınmış çöküntü nüvə DNA-sını (nDNA) təcrid etmək üçün istifadə edilmişdir.
- DNA sentrifuqa sütunlarından istifadə edilərək təcrid edilmişdir.
- Mitoxondrial DNA (mtDNA) təcrid edilmiş mitoxondrilərdən ekstraksiya edilmişdir.
- Nüvə DNA-sı (nDNA) xam nüvə ekstraktlarından ekstraksiya edilmişdir; hər ikisi siçan qaraciyəri toxumasından əldə edilmişdir.
DNA fraqmentasiyası:
- DNA buz üzərində, 0,5-mm mikrouclu sonotrodu olan 30-kHz/50-W UP50H ultrasəs sonikatorundan istifadə edilərək, 14 μm göstəricisində 2 × 30 saniyə ərzində fraqmentlərə parçalanmışdır.
Fraqmentasiyanın vizuallaşdırılması və kəmiyyətcə təyini:
- Ultrasəs emalından sonra fraqmentasiya SYBR safe DNA boyası ilə 1% aqaroza gelində vizuallaşdırılmışdır.
- mtDNA və nDNA-nın nisbi miqdarı qPCR ilə müəyyən edilmişdir.
(cf. Mariero et al., 2019)
Yüksək sayda nümunənin hazırlanması üçün UIP400MTP çoxyuvalı lövhə sonikatoru standart 96-yuvalı, çoxyuvalı və mikrotitr lövhələrində çoxlu sayda nümunənin hazırlanmasını asanlaşdırır.
UIP400MTP ilə yüksək sayda nümunənin hazırlanmasının üstünlükləri haqqında daha ətraflı oxuyun!
Sonikasiya ilə mitoxondrilərin optimal təcridi üçün məsləhətlər:
- Temperatura nəzarət: Bütün mərhələləri 0°C ilə 4°C arasındakı temperatur diapazonunda həyata keçirin. Bu, mitoxondrilərin bütövlüyünü və funksionallığını qorumaq üçün həlledici əhəmiyyət daşıyır.
- Səmərəlilik və sürət: Sürətlə işləyin və mitoxondriləri yalnız konkret tətbiqiniz üçün tələb olunan dərəcədə təmizləyin. Həddindən artıq manipulyasiya mitoxondrial komponentlərin əhəmiyyətli itkisinə səbəb ola bilər.
- Suspenziyaların durulaşdırılması: Təcrid prosesi boyunca hüceyrə və orqanoid suspenziyalarının konsentrasiyalarını aşağı səviyyədə saxlayın. Bu, tutulma və aqqlütinasiya risklərini minimuma endirməyə kömək edir və beləliklə, təcrid edilmiş mitoxondrilərin təmizliyini artırır.
- Nümunə həcmi: Bir böyük həcmli preparat əvəzinə bir neçə kiçik həcmli preparat hazırlamağa üstünlük verin. Bu yanaşma adətən daha yüksək çıxımla nəticələnir, çünki miqyasın artırılması əldə edilə bilən mitoxondrilərin miqdarını mütənasib şəkildə artırmır. UIP400MTP çoxyuvalı lövhə sonikatoru mitoxondrilərin təcridi üçün hüceyrələrin sürətli və etibarlı lizisini, eləcə də mitoxondrilərdən zülal ekstraksiyasını asanlaşdırır.
Bu tövsiyələr ultrasəs lizisi və sentrifuqalama ilə təcrid prosesini daha səmərəli edərək sonrakı tətbiqlər üçün yararlı, yüksək keyfiyyətli mitoxondrial preparatların əldə olunmasını təmin edəcək.
Hielscher sonikatorları – Almaniya istehsalı keyfiyyət
Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Möhkəmlik və asan istifadə ultrasəs cihazlarımızın sənaye müəssisələrinə problemsiz inteqrasiyasına imkan verir. Hielscher ultrasəs cihazları ağır şəraitin və tələbkar mühitlərin öhdəsindən asanlıqla gəlir.
Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatlı şirkətdir və ən müasir texnologiya və istifadə rahatlığı ilə seçilən yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə, Hielscher ultrasəs cihazları CE tələblərinə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərinə cavab verir.
Mikrotitr və çoxyuvalı lövhələrin sonikasiyası üçün 96-yuvalı UIP400MTP lövhə sonikatoru
Ədəbiyyat / İstinadlar
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mitoxondrilər və mitoxondrial diaqnostika haqqında tez-tez verilən suallar
Mitoxondrilər nədir?
Mitoxondrilər əksər eukariot orqanizmlərin hüceyrələrində olan membranla əhatə olunmuş orqanoidlərdir. Onlar hüceyrənin enerji stansiyaları kimi tanınır, çünki hüceyrə tənəffüsü prosesi vasitəsilə adenozin trifosfat (ATP) şəklində enerji istehsal edirlər. Bundan əlavə, mitoxondrilərin öz DNA-sı var və onlar hüceyrə siklinin və hüceyrə ölümünün tənzimlənməsi də daxil olmaqla digər hüceyrə proseslərində əsas rol oynayırlar.
mtDNA-nı genom DNA-sından nə fərqləndirir?
Mitoxondrial DNA (mtDNA) genom DNA-sından (gDNA) bir neçə əsas xüsusiyyətinə görə fərqlənir. MtDNA mitoxondrilərdə yerləşir, halqavidir və ana tərəfindən irsən ötürülür, gDNA isə hüceyrə nüvəsində yerləşir, xəttidir və hər iki valideyndən irsən ötürülür. MtDNA daha kiçikdir və yalnız 37 geni kodlaşdırır, gDNA isə təxminən 20.000–25.000 gen ehtiva edir. Hər hüceyrədə mtDNA-nın bir neçə nüsxəsi olur, onun mutasiya tezliyi daha yüksəkdir və o, əsasən mitoxondrial funksiyada iştirak edən zülalları kodlaşdırır. Bunun əksinə, gDNA adətən diploiddir, daha aşağı mutasiya tezliyinə malikdir və orqanizmin inkişafı və fəaliyyəti üçün zəruri olan çoxsaylı genləri kodlaşdırır. Bundan əlavə, mtDNA-nın transkripsiyası və translyasiyası mitoxondrilərin daxilində baş verir, gDNA-nın transkripsiyası isə nüvədə, translyasiyası isə sitoplazmada baş verir. Bu fərqlər onların fərqli rollarını və təkamül mənşələrini əks etdirir.
Hüceyrəsiz ekstrakt nədir?
Hüceyrəsiz ekstrakt lizisə uğramış hüceyrələrin tərkibini, o cümlədən zülalları, nuklein turşularını və digər hüceyrə komponentlərini ehtiva edən, lakin bütöv hüceyrə membranları olmayan məhluldur. Bu ekstrakt biokimya və molekulyar biologiya tədqiqatlarında hüceyrə proseslərini in vitro öyrənmək üçün istifadə olunur və tədqiqatçılara reaksiyaları və mexanizmləri canlı hüceyrələrdən kənarda təhlil etməyə imkan verir.
PCR testləri mitoxondrial diaqnostikada hansı rolu oynayır?
PCR testləri mitoxondrial DNA-da (mtDNA) mutasiyaların, delesiyaların və ya nüsxə sayındakı dəyişikliklərin aşkar edilməsinə imkan verərək mitoxondrial diaqnostikada həlledici rol oynayır. Onlar mitoxondrial pozğunluqlarla əlaqəli patogen variantları müəyyən etmək üçün xüsusi mtDNA bölgələrinin amplifikasiyasına imkan verir. Kəmiyyət PCR-i (qPCR) və uzun fraqmentli PCR kimi PCR əsaslı üsullar mtDNA-nın bütövlüyünü, heteroplazmiya səviyyələrini və mtDNA miqdarının azalmasını qiymətləndirmək üçün də istifadə olunur və mitoxondrial funksiya və xəstəlik haqqında mühüm məlumatlar verir.
UIP400MTP mikro lövhə sonikatorunun PCR testlərini və analizlərini necə asanlaşdırdığını öyrənin!
Diferensial sentrifuqalama nədir?
Diferensial sentrifuqalama hüceyrə fraksiyalaşdırılması və mitoxondrilərin təcridi üçün geniş istifadə olunan üsuldur. Bu üsul hüceyrə strukturlarını həm sıxlıqdan, həm də formadan asılı olan sedimentasiya əmsalına əsasən ayırır. Proses müəyyən sıxlıqlara malik buferləşdirilmiş duz məhlullarındakı nümunələrə müxtəlif səviyyələrdə mərkəzdənqaçma qüvvəsinin tətbiq edilməsini əhatə edir. Oxşar sedimentasiya əmsallarına malik strukturlar toplama borusunun dibinə eyni vaxtda çökərək onların əldə edilməsinə imkan verir.
Diferensial sentrifuqalama mitoxondrilərin təcridi üçün necə istifadə olunur?
Diferensial sentrifuqalama tədqiqatçılara mitoxondrial fraksiyaları digər hüceyrə komponentlərindən səmərəli şəkildə ayırmağa imkan verir. Mitoxondrilərin təcridi bir neçə sentrifuqalama mərhələsini və sonradan təcrid edilmiş materialın əldə edilməsini əhatə edir.
İlkin sentrifuqalama: İri hüceyrə qalıqlarını və nüvələri çökdürmək üçün aşağı mərkəzdənqaçma qüvvəsi tətbiq edin.
Sonrakı sentrifuqalamalar: Mitoxondrilərlə zənginləşdirilmiş fraksiyaları çökdürmək üçün mərkəzdənqaçma qüvvəsini mərhələli şəkildə artırın. Hər sentrifuqalama mərhələsi getdikcə daha yüksək sedimentasiya əmsallarına malik strukturları uzaqlaşdırır.
Fraksiyanın əldə edilməsi: Hər sentrifuqalamadan sonra çöküntü toplanır və növbəti fraksiyanı təcrid etmək üçün çöküntüüstü maye daha yüksək g qüvvələrinə məruz qoyulur. Bu, mitoxondrilərin arzu olunan təmizlik dərəcəsi əldə edilənədək təkrarlanır.