إنتاج بالموجات فوق الصوتية من الفصام عالي النقاء بيتا جلوكان
الفصام هو β جلوكان فطري مع خصائص المناعة. بالنسبة للآثار الطبية النشطة للغاية ، يجب أن يكون الفصامي منخفض الوزن الجزيئي من أجل إظهار التوافر البيولوجي المحسن. وقد ثبت Ultrasonication للحد من الوزن الجزيئي للفصاميزولان. كطريقة موثوقة وفعالة ، يمكن تطبيق sonication بسهولة لإنتاج فصاميزوفولان منخفض الوزن الجزيئي.
فطر الفصام واستخراج بيتا جلوكان بالموجات فوق الصوتية
أنواع من فطر الفصام تنمو في الطبيعة على الأشجار المتحللة بعد مواسم الأمطار. يتم جمع أجسام الفاكهة في موسم الجفاف التالي. الأنواع الفصام غنية في المركبات الكيميائية الحيوية مثل الجلوكان، وبالتالي تستهلك خاصة في البلدان الاستوائية والغذاء والدواء. بسبب خصائصها المناعية والمضادة للفطريات والانتينوبلاستيك ومضادة للفيروسات ، جذبت بلدية سكيزوفيزيلوم ، المعروفة أيضا باسم فطر سبليتجيل ، شركات التكنولوجيا الحيوية والأدوية.
فصاميزوفيلان البوليساكريد، المعروف أيضا باسم سيزوفيران، سونيفيليان، أو سيزوفلان، هو β-جلوكان الرئيسي الموجود في فطر الفصام، والتي توفر فعالة للغاية النشطة بيولوجيا β جلوكان الفصام.
فطر بلدية الفصام تنمو في الطبيعة على الأشجار، ويمكن أيضا أن تزرع الخلايا الميسيليوم في مرق التخمير. للتطبيقات الصيدلانية ومستحضرات التجميل، وانخفاض الوزن الجزيئي الفصامي هو وسيلة أكثر فعالية من الفصام الوزن الجزيئي عالية. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن انخفاض الوزن الجزيئي الفصامي يظهر أفضل بكثير التوافر البيولوجي ومعدلات الامتصاص. Aditionally، فصاميزوفولان الوزن الجزيئي العالي غالبا ما يكون إشكالية في التطبيقات لأنه يؤدي إلى لزوجة عالية من حلولها المائية.
الحد من حجم الموجات فوق الصوتية هو تقنية فعالة للغاية وموثوق بها لخفض الوزن الجزيئي للفصاميزوفلان، وبالتالي زيادة نوعية جزيء β-جلوكان.
وultrasonicator UIP2000hdT تم استخدامه بنجاح لتقليل الوزن الجزيئي للفصاميزوفلان ، وهو β جلوكان فطري
بروتوكول لإنتاج سكيزوفولان الوزن الجزيئي منخفض
منذ الفصام الوزن الجزيئي يوضح التوافر البيولوجي أفضل بشكل كبير وخصائص التطبيق، وفريق البحث من سميرنو التحقيق ultrasonication لانشقاق وخفض حجم فصامية جزيء β جلوكان.
Ultrasonication من سكيزوفولان
β-1.3 (1.6)-جلوكان فصاميزوفولان (SPG) تم إنتاجه عن طريق زراعة مغمورة من الفطريات البلدية S. في المفاعل الحيوي باستخدام السكروز كركيزة.
بعد نهاية الزراعة، تم تخفيف مرق الثقافة مع المياه demineralized إلى تركيز الفصام 2 غرام / لتر و بالموجات فوق الصوتية مع معالج بالموجات فوق الصوتية UIP2000hdT (Hielscher الفوق صوتيات GmbH، ألمانيا) في وضع إعادة تدوير في المعلمات والظروف التالية: تدفق متوسط 50 مل / ثانية، تردد 20 كيلوهرتز، إخراج 2000 W، سونوترودي نوع BS2d22، نوع الداعم B2-1.4 والسعة 100٪. كانت درجة حرارة مرق الثقافة في بداية سونيكيشن 25 درجة مئوية. تمت تصفية مرق الثقافة بالموجات فوق الصوتية (مدخلات طاقة محددة 100 Ws/mL) من خلال فلتر عمق Seitz HS800 تحت ضغط شريط 1.5 عند 40 درجة مئوية. وقد عجلت الفصام بالموجات فوق الصوتية (uSPG) لتوصيف الكيميائية من filtrate مع كمية ثلاثية من الكحول isopropyl في درجة حرارة المختبر، والمجففة في 60 درجة مئوية لحلول uSPG 12h للدراسات المناعية أعدت على النحو التالي: (1) تم diafiltrated مرق الثقافة بالموجات فوق الصوتية من خلال 0.1m2 Pall Centramate T-سلسلة كاسيت PES (100 kDa قطع) في 0.8 شريط واستمرت diafiltration حتى التوصيلية retentate كان 20 ميكروس / سم؛ (2) وتركز الحل عن طريق الترشيح إلى تركيز uSPG 1 غرام / لتر وتعقيمها عن طريق الالاستعباد الذاتي في 120 درجة مئوية / 20 دقيقة. تم إعداد uSPG المشوه بطريقة مماثلة ، باستثناء أنه تمت إضافة NaOH إلى مرق الثقافة filtrate في التركيز 0.2 M وتم احتضان المحلول قلوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة المختبر قبل الترشيح.
الأساليب التحليلية
تم تقدير غلة الميسيليوم بشكل دقيق: تم تخفيف مرق الثقافة بالماء 1:4 ، والطرد المركزي 10000 × غرام عند 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، وغسل الترسب بكمية ثلاثية من الماء ، وتجفيفه عند 60 درجة مئوية ووزنه. وقد عجلت Schizophyllan من supernatant مع كمية ثلاثية من الكحول ايزوبروبيل، المجففة في 60 درجة مئوية لمدة 24h وتم تحديد غلتها gravimetrically. تم قياس pO2 في مرق الثقافة من خلال التحقيق البصري هاملتون فيسيفرم DO 120 (هاميلتون، سويسرا).
تم قياس اللزوجة الديناميكية لمرق الثقافة على HAAKE Visco Tester 6L مع المغزلين 1L و 2L عند 4 درجة مئوية وسرعة دوران 30 دورة في الدقيقة. تم حساب سرعة الترشيح من وقت الترشيح من مرق ثقافة 500 مل من خلال 200 × 200 مم Seitz HS800 (بال، الولايات المتحدة الأمريكية) مرشح العمق في 1.5 شريط الضغط و 40 درجة مئوية.
تم قياس الوزن الجزيئي uSPG من قبل SEC-MALLS على تحالف نظام HPLC (المياه) مع أعمدة PL aquagel OH60 وPL aquagel OH40 المتصلة بالسلاسل ، وتركز كاشف miniDAWN TREOS (Wyatt) عن طريق الترشيح إلى تركيز uSPG 1 غرام / لتر وتعقيمه عن طريق الاستعباد التلقائي عند 120 درجة مئوية / 20 دقيقة. تم إعداد uSPG المشوه بطريقة مماثلة ، باستثناء أنه تمت إضافة NaOH إلى مرق الثقافة filtrate في التركيز 0.2 M وتم احتضان المحلول قلوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة المختبر قبل الترشيح.
تم تطبيق العلاج ultrasonication مباشرة إلى S. البلدية 144 ساعة مرق الثقافة مع الميسيليوم لتسهيل تجهيز SPG المصب.
خصائص سكيزوفولان سونيكاتيد: وقد عجلت الفصام بالموجات فوق الصوتية (uSPG) من مرق الثقافة filtrate من الكحول وتتميز. وقدرت SEC-MALLS ميغاواط من uSPG أن يكون حوالي 1 MDa. متوسط الوزن الجزيئي للفصاميزولان من التخمير السائل هو ما يقرب من 5 MDa ، في حين أنه في زراعة الحالة الصلبة قد تصل إلى 10 MDa. مقارنة الوزن الجزيئي للفصاميزوفيلان بالموجات فوق الصوتية مع الأوزان الجزيئية من الفصام الأصلي غير المعالجة، يمكن ملاحظة انخفاض الوزن الجزيئي 5-إلى 10 أضعاف بسبب ultrasonication.
يحتوي الكسيد السكري السكري الصوتي uSPG على 0.7٪ ث / ث البروتين و 1.0٪ ث / ث بقايا بعد الاشتعال. تألفت التحلل المائي uSPG من الجلوكوز مع أكثر من 99٪. تشير النتائج التحليلية إلى أن سونيكيشن يشق العمود الفقري β-جلوكان بشكل عشوائي والفروع الجانبية لا تزال سليمة وبالتالي تقليل الحجم والوزن الجزيئي للفصاميزفيلي. وأظهرت الدراسات المناعية على البروتين أساسا و endotoxin uSPG الحرة، أن بالموجات فوق الصوتية منخفضة ميغاواط schizophyllan قد أعلن النشاط المناعي.
AFM التصوير (على أعلى) وملف الطبوغرافية (في الجزء السفلي) من الفصام بالموجات فوق الصوتية الأصلية. القياس في وضع شبه الاتصال مع القرار 512 × 512 pxs2. الشروط: طلاء الذهب، ثابت الربيع 15.3 N/m، تلميح زاوية مخروط <22°.
انخفاض اللزوجة: أدى Ultrasonication في انخفاض كبير في لزوجة مرق الثقافة. أثناء ultrasonication ، تغيرت لزوجة مرق الثقافة بشكل غير خطي: كان انخفاض اللزوجة سريعا في بداية سونيكيشن فائقة ، ولكن في وقت لاحق تباطأ. مدخلات محددة للطاقة 100 WS/mL كانت كافية للحد من لزوجة مرق الثقافة ما يقرب من 7 مرات.
Ultrasonication من مرق الثقافة S.commune، والتي تم الحصول عليها عن طريق زراعة الفطريات في مفاعل حيوي ل144h. تأثير فترة ultrasonication (أعرب عن مدخلات محددة للطاقة في WS / مل) على سرعة الترشيح عمق مرق الثقافة (العمود الأسود)، وتركيز الفصام (SPG) في الخيوط (العمود الرمادي). شروط ultrasonication: المعالج بالموجات فوق الصوتية UIP2000hd (20 كيلو هرتز، 2000W)، سونوترودي BS2d22، الداعم B2-1.4، السعة 100٪، معدل التدفق 50 مل / ثانية.
(الصورة والدراسة: ©Smirnou et al., 2017)
ترشيح محسن: تدفق مرق الثقافة المعالج بالموجات فوق الصوتية من خلال الفلتر أسرع من مرق الثقافة غير المعالج (مدخلات طاقة محددة 0 Ws/mL) مع SPG عالي الجزيئية. الى جانب ذلك، ultrasonication خفضت بشكل كبير فقدان المنتج أثناء الترشيح. احتوى خيط مرق الثقافة غير المعالج مع SPG عالي الجزيئية (مدخلات طاقة محددة 0 Ws/mL) على 0.3 ± 0.07 جرام / لتر SPG ، في حين كان تركيز SPG قبل ترشيح العمق 2 غرام / لتر. في المقابل، فإن filtrate من 100 Ws/mL الثقافة ultrasonicated على حد سواء الواردة SPG في تركيز 2.2 ± 0.2 غرام / لتر، وهو ما يتوافق مع فقدان المنتج صفر تقريبا.
Ultrasonication من مرق الثقافة S.commune، والتي تم الحصول عليها عن طريق زراعة الفطريات في مفاعل حيوي ل144h. تأثير فترة ultrasonication (أعرب عن مدخلات محددة للطاقة في WS / مل) على سرعة الترشيح عمق مرق الثقافة (العمود الأسود)، وتركيز الفصام (SPG) في الخيوط (العمود الرمادي). شروط ultrasonication: المعالج بالموجات فوق الصوتية UIP2000hd (20 كيلو هرتز، 2000W)، سونوترودي BS2d22، الداعم B2-1.4، السعة 100٪، معدل التدفق 50 مل / ثانية.
(الصورة والدراسة: ©Smirnou et al., 2017)
AFM التصوير (في الأعلى) وملف تعريف الطبوغرافية (في الجزء السفلي) من الفصام بالموجات فوق الصوتية مشوهة. القياس في وضع شبه الاتصال مع القرار 512 × 512 pxs2. الشروط: طلاء الذهب، ثابت الربيع 15.3 N/m، تلميح زاوية مخروط < 22°.
(الصورة والدراسة: ©Smirnou et al., 2017)
بالإضافة إلى ذلك ، وجد الباحثون أن المعالجة بالموجات فوق الصوتية من الفصام قابلة للتطوير بسهولة. وحدة واحدة من مصنع التجريبية الموجات فوق الصوتية المتفكك UIP2000hdT معالجتها 1 لتر من مرق الثقافة في 110 ق في وضع التدفق. يمكن زيادة إنتاجية النظام بسهولة عن طريق الاتصال التسلسلي لوحدات الموجات فوق الصوتية الإضافية.
اقرأ المزيد عن التوسع البسيط في استخراج الفطر!
معدات الموجات فوق الصوتية عالية الأداء لمعالجة جلوكان الفطرية
تجزئة السكريات مثل الجلوكان وكذلك غيرها من المركبات النشطة بيولوجيا مثل الكيتين والشيتوزان يمكن أن تكون عمليات موثوقة مع معدات الموجات فوق الصوتية Hielscher عالية الأداء. لدينا الموجات فوق الصوتية يمكن أن توفر السعات العالية، ويوفر التحكم الدقيق على المعلمات العملية ويمكن تشغيلها 24/7 تحت الحمل الثقيل وفي البيئات الصعبة. Hielscher الموجات فوق الصوتية مجموعة المعدات يفي هذه المتطلبات بشكل موثوق. إلى جانب الأداء المتميز بالموجات فوق الصوتية، Hielscher الموجات فوق الصوتية تفتخر كفاءة عالية في استخدام الطاقة، والتي هي ميزة اقتصادية كبيرة – خاصة عندما تستخدم على الإنتاج التجاري على نطاق واسع.
Hielscher ultrasonicators هي أنظمة عالية الأداء يمكن تجهيزها بملحقات مثل سونوتروديس أو معززات أو مفاعلات أو خلايا تدفق من أجل مطابقة احتياجات العملية الخاصة بك بطريقة مثالية. يقترن متانة والثقيلة تحمل القدرة، أنظمة الموجات فوق الصوتية Hielscher هي حصان العمل الخاص بك موثوق بها في الإنتاج β.
اعثر على مزيد من المعلومات حول استخراج بيتا جلوكان بالموجات فوق الصوتية من الفطر بما في ذلك التعليمات خطوة بخطوة هنا!
الجدول أدناه يعطيك مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لultrasonicators لدينا:
| دفعة حجم | معدل المد و الجزر | الأجهزة الموصى بها |
|---|---|---|
| 1 إلى 500ML | 10 إلى 200ML / دقيقة | UP100H |
| 10 إلى 2000ML | 20 إلى 400ML / دقيقة | Uf200 ः ر، UP400St |
| 00.1 إلى 20L | 00.2 إلى 4L / دقيقة | UIP2000hdT |
| 10 إلى 100L | 2 إلى 10L / دقيقة | UIP4000hdT |
| زمالة المدمنين المجهولين | 10 إلى 100L / دقيقة | UIP16000 |
| زمالة المدمنين المجهولين | أكبر | مجموعة من UIP16000 |
اتصل بنا! / اسألنا!
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع عالية الأداء المجانسة بالموجات فوق الصوتية لخلط التطبيقات، تشتت، استحلاب واستخراج على المختبر، والطيارية ومقياس الصناعية.
الأدب / المراجع
- Smirnou, Dzianis; Knotek, Petr; Nesporova, Kristina; Smejkalova, Daniela; Pavlik, Vojtech; Franke, Lukas; Velebny, Vladimir (2017): Ultrasound-assisted production of highly-purified β-glucan schizophyllan and characterization of its immune properties. Process Biochemistry 2017.
- Zhong, Kui; Tong, Litao; Liu, Liya; Zhou, Xianrong; Liu, Xingxun; Zhang, Qi; Zhou, Sumei (2015): Immunoregulatory and antitumor activity of schizophyllan under ultrasonic treatment. International Journal of Biological Macromolecules, 80, 2015. 302–308.
- Kengo Tabata, Wataru Ito, Takemasa Kojima, Shozo Kawabata, Akira Misaki (1981): Ultrasonic degradation of schizophyllan, an antitumor polysaccharide produced by Schizophyllum commune fries. Carbohydrate Research, Volume 89, Issue 1, 1981. 121-135.
حقائق تستحق العلم
سكيزوفولان – β جلوكان فطرية
الفصام، المعروف أيضا باسم sizofiran، SPG، sonifilan، sizofilan، هو البوليساكريد خارج الخلية محايدة التي تنتجها الفطريات Schizophyllum البلدية فرايز، وهو نوع من فطر Basidiomycetes. سكيزوفيتلان هو قابل للذوبان بيتا-D-جلوكان, آلية الدقيق للعمل لم يتم توضيحها تماما بعد, ولكن هذا محددة β-الجلوكان يظهر آثار المناعة ومضادات الورم. على الرغم من أن آلية عمل sizofiran الدقيقة لم يتم توضيحها بالكامل بعد ، يبدو أن هذا العامل يحفز الجهاز المناعي عن طريق زيادة إنتاج السيتوكين ، وتفعيل الضامة وخلايا Langerhans وتعزيز نشاط الكريات البيض متعددة الأشكال (PML) والخلايا القاتلة الطبيعية (NK). تم العثور على Sizofiran غير فعالة إلى حد ما ضد سرطان المعدة، ولكن تمديد وقت البقاء على قيد الحياة في المرضى الذين يعانون من سرطان الرأس والرقبة. في سرطان عنق الرحم، سيزوفيران البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة والوقت لتكرار لحالات المرحلة الثانية ولكن ليس المرحلة الثالثة، وأظهرت فعالية إضافية عند حقنها مباشرة في كتلة الورم. يستخدم سونيفيلان كمعدل للاستجابة البيولوجية (BRM) مع العلاج الإشعاعي لعلاج السرطان في اليابان. تم إطلاقه لسرطان عنق الرحم في كوريا الجنوبية في عام 1998.
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع عالية الأداء المجانسة بالموجات فوق الصوتية من مختبر إلى حجم الصناعية.