إنتاج بالموجات فوق الصوتية من Schizophyllan بيتا جلوكان عالية النقاء
Schizophyallan هو β جلوكان فطري له خصائص مناعية. للحصول على تأثيرات طبية نشطة للغاية ، يجب أن يكون للفصام وزن جزيئي منخفض من أجل إظهار التوافر البيولوجي المحسن. وقد ثبت الموجات فوق الصوتية للحد من الوزن الجزيئي لمرض انفصام. كطريقة موثوقة وفعالة ، يمكن تطبيق صوتنة بسهولة لإنتاج الفصام منخفض الوزن الجزيئي.
فطر الفصام واستخراج بيتا جلوكان بالموجات فوق الصوتية
تنمو أنواع فطر الفصام في الطبيعة على الأشجار المتحللة بعد مواسم الأمطار. يتم جمع أجسام الفاكهة في موسم الجفاف التالي. أنواع الفصام غنية بالمركبات الكيميائية الحيوية مثل الجلوكان ، وبالتالي يتم استهلاكها بشكل خاص في البلدان الاستوائية كغذاء ودواء. نظرا لخصائصه المناعية والمضادة للفطريات والمضادة للأورام والمضادة للفيروسات ، اجتذبت بلدية Schizophyllum ، المعروفة أيضا باسم فطر Splitgill ، شركات التكنولوجيا الحيوية والأدوية.
السكاريد شيزوفيلان ، المعروف أيضا باسم سيزوفيران ، سونيفيلان ، أو سيزوفيلان ، هو β جلوكان الرئيسي الموجود في فطر شيزوفيلوم ، والذي يوفر الفصام النشط بيولوجيا β جلوكان النشط بيولوجيا.
تنمو فطر بلدية Schizophyllum في الطبيعة على الأشجار ، ويمكن أيضا زراعة الفطريات في مرق التخمير. بالنسبة للتطبيقات الصيدلانية ومستحضرات التجميل ، فإن الفصام منخفض الوزن الجزيئي أكثر فعالية من الفصام عالي الوزن الجزيئي. هذا يرجع إلى حقيقة أن الفصام منخفض الوزن الجزيئي يظهر معدلات توافر وامتصاص أفضل بكثير. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يكون الفصام عالي الوزن الجزيئي مشكلة في التطبيقات لأنه يؤدي إلى لزوجة عالية لمحاليله المائية.
يعد تقليل الحجم بالموجات فوق الصوتية تقنية فعالة للغاية وموثوقة لخفض الوزن الجزيئي لمرض الفصام ، وبالتالي زيادة جودة جزيء β-glucan.
الموجات فوق الصوتية UIP2000hdT تم استخدامه بنجاح لتقليل الوزن الجزيئي لمرض الفصام ، وهو β جلوكان فطري
بروتوكول لإنتاج الفصام منخفض الوزن الجزيئي
نظرا لأن الفصام ذو الوزن الجزيئي يوضح التوافر البيولوجي وخصائص التطبيق الأفضل بشكل كبير ، قام فريق البحث في Smirnou بالتحقيق في الموجات فوق الصوتية من أجل الانقسام وتقليل حجم جزيء β-glucan schizophyllan.
الموجات فوق الصوتية من الفصام
β-1.3 (1.6) - تم إنتاج الفصام الجلوكان (SPG) عن طريق الزراعة المغمورة للفطر المجتمعي S. في مفاعل حيوي باستخدام السكروز كركيزة.
بعد نهاية الزراعة ، تم تخفيف مرق الاستزراع بالماء منزوع المعادن إلى تركيز الفصام 2 جم / لتر والموجات فوق الصوتية مع معالج بالموجات فوق الصوتية UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH ، ألمانيا) في وضع إعادة التدوير في المعلمات والشروط التالية: تدفق متوسط 50 مل / ثانية ، تردد 20 كيلو هرتز ، إخراج 2000 واط ، نوع سونوترود BS2d22 ، نوع معزز B2-1.4 وسعة 100٪. كانت درجة حرارة مرق الثقافة في بداية الصوتنة 25 درجة مئوية. تمت تصفية مرق الثقافة بالموجات فوق الصوتية (مدخلات الطاقة المحددة 100 واط / مل) من خلال مرشح عمق Seitz HS800 تحت ضغط 1.5 بار عند 40 درجة مئوية. تم ترسيب الفصام بالموجات فوق الصوتية (uSPG) للتوصيف الكيميائي من الراشح بكمية ثلاثية من كحول الأيزوبروبيل في درجة حرارة المختبر ، وتجفيفه عند 60 درجة مئوية لمدة 12 ساعة تم تحضير محاليل uSPG للدراسات المناعية على النحو التالي: (1) تم ترشيح مرق الثقافة بالموجات فوق الصوتية من خلال شريط PES من سلسلة Pall Centramate T 0.1m2 (قطع 100 كيلو دالتون) عند 0.8 بار واستمر الترشيح حتى كانت الموصلية المحتجزة 20 ميكرو ثانية / سم ؛ (2) تم تركيز المحلول عن طريق الترشيح إلى تركيز uSPG 1 جم / لتر وتعقيمه بواسطة التعقيم عند 120 درجة مئوية / 20 دقيقة. تم تحضير uSPG المشوه بطريقة مماثلة ، باستثناء أنه تمت إضافة NaOH إلى مرق الترشيح المستزرع بتركيز 0.2 M وتم تحضين المحلول القلوي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة المختبر قبل الترشيح.
الأساليب التحليلية
تم تقدير محصول الفطريات بالجاذبية: تم تخفيف مرق الاستزراع بالماء 1: 4 ، والطرد المركزي 10000 × جم عند 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، وتم غسل الراسب بكمية ثلاثية من الماء ، وتجفيفه عند 60 درجة مئوية ووزنه. تم ترسيب الفصام من المادة الطافية بكمية ثلاثية من كحول الأيزوبروبيل ، وتجفيفه عند 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة وتم تحديد محصوله بالجاذبية. تم قياس pO2 في مرق الثقافة بواسطة المسبار البصري Hamilton-Visiferm DO 120 (هاميلتون ، سويسرا).
تم قياس اللزوجة الديناميكية لمرق الاستزراع على جهاز HAAKE Visco Tester 6L مع مغازل 1L و 2L عند 4 درجات مئوية وسرعة دوران 30 دورة في الدقيقة. تم حساب سرعة الترشيح من وقت الترشيح لمرق الاستزراع 500 مل من خلال مرشح عمق 200 × 200 مم Seitz HS800 (Pall ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند ضغط 1.5 بار و 40 درجة مئوية.
تم قياس الوزن الجزيئي uSPG بواسطة SEC-MALLS على تحالف نظام HPLC (المياه) مع أعمدة PL aquagel OH60 و PL aquagel OH40 المتصلة بالسلسلة ، وتم تركيز الكاشف miniDAWN TREOS (Wyatt) عن طريق الترشيح إلى تركيز uSPG 1 جم / لتر وتعقيمه بواسطة التعقيم عند 120 درجة مئوية / 20 دقيقة. تم تحضير uSPG المشوه بطريقة مماثلة ، باستثناء أنه تمت إضافة NaOH إلى مرق الترشيح المستزرع بتركيز 0.2 M وتم تحضين المحلول القلوي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة المختبر قبل الترشيح.
UIP2000hdT للحد من الوزن الجزيئي الفصامي
الموجات فوق الصوتية UP400St (400 وات، 24 كيلو هرتز) لمعالجة الفصام
تم تطبيق العلاج بالموجات فوق الصوتية مباشرة على مرق ثقافة S. commune 144-h مع mycelium لتسهيل معالجة SPG النهائية.
خصائص الفصام الصوتي: تم ترسيب الفصام بالموجات فوق الصوتية (uSPG) من ترشيح مرق الثقافة بواسطة الكحول وتميزه. قدرت SEC-MALLS ميغاواط من uSPG بحوالي 1 MDa. يبلغ متوسط الوزن الجزيئي للشيزوفيلان الناتج عن التخمير السائل حوالي 5 MDa ، بينما في زراعة الحالة الصلبة قد يصل إلى 10 MDa. بمقارنة الوزن الجزيئي للشيزوفيلان بالموجات فوق الصوتية مع الأوزان الجزيئية للشيزوفيلان الأصلي غير المعالج ، يمكن ملاحظة انخفاض الوزن الجزيئي من 5 إلى 10 أضعاف بسبب الموجات فوق الصوتية.
يحتوي عديد السكاريد الصوتي uSPG على 0.7٪ وزن / وزن بروتين و 1.0٪ وزن / وزن بقايا بعد الاشتعال. يتكون uSPG hydrolysate من الجلوكوز بأكثر من 99٪. تشير النتائج التحليلية إلى أن الصوتنة تشق العمود الفقري β-glucan بشكل عشوائي وتبقى الفروع الجانبية سليمة مما يقلل من الحجم والوزن الجزيئي لمرض الفصام. أظهرت الدراسات المناعية على uSPG الخالي من البروتين والذيفان الداخلي بشكل أساسي ، أن الفصام منخفض ميغاواط بالموجات فوق الصوتية قد أعلن عن نشاط مناعي.
تصوير AFM (في الأعلى) والملف الطبوغرافي (في الأسفل) لمرض الفصام بالموجات فوق الصوتية الأصلي. القياس في وضع شبه الاتصال بدقة 512 × 512 بكسل2. الظروف: طلاء ذهبي ، ثابت زنبركي 15.3 نيوتن / م ، زاوية مخروط الطرف <22°.
انخفاض اللزوجة: الموجات فوق الصوتية أدى إلى انخفاض كبير في لزوجة مرق الثقافة. أثناء الموجات فوق الصوتية ، تغيرت لزوجة مرق الثقافة بشكل غير خطي: كان انخفاض اللزوجة سريعا في بداية الموجات فوق الصوتية ، لكنه تباطأ لاحقا. كان إدخال الطاقة المحدد 100 واط / مل كافيا لتقليل لزوجة مرق الثقافة حوالي 7 مرات.
الموجات فوق الصوتية من مرق ثقافة S.commune ، والتي تم الحصول عليها عن طريق زراعة الفطريات في مفاعل حيوي لمدة 144 ساعة. تأثير فترة الموجات فوق الصوتية (معبرا عنها كمدخلات طاقة محددة في Ws / mL) على سرعة ترشيح عمق مرق الثقافة (العمود الأسود) ، وتركيز الفصام (SPG) في الترشيح (العمود الرمادي). شروط الموجات فوق الصوتية: معالج بالموجات فوق الصوتية UIP2000hd (20 كيلو هرتز ، 2000 واط)، سونوترودي BS2d22 ، معزز B2-1.4 ، السعة 100٪ ، معدل التدفق 50 مل / ثانية.
(الصورة والدراسة: ©سميرنو وآخرون ، 2017)
تحسين الترشيح: تدفق مرق الثقافة المعالج بالموجات فوق الصوتية عبر المرشح بشكل أسرع من مرق الثقافة غير المعالج (مدخلات الطاقة المحددة 0 واط / مل) مع SPG الجزيئي العالي. الى جانب ذلك ، خفضت الموجات فوق الصوتية بشكل كبير فقدان المنتج أثناء الترشيح. احتوى ترشيح مرق الاستزراع غير المعالج مع SPG الجزيئي العالي (مدخلات الطاقة المحددة 0 واط / مل) على 0.3 ± 0.07 جم / لتر SPG ، بينما كان تركيز SPG قبل الترشيح العميق 2 جم / لتر. في المقابل ، احتوى كل من ترشيح 100 واط / مل من الثقافة بالموجات فوق الصوتية على SPG بتركيز 2.2 ± 0.2 جم / لتر ، وهو ما يتوافق مع فقدان المنتج صفر تقريبا.
الموجات فوق الصوتية من مرق ثقافة S.commune ، والتي تم الحصول عليها عن طريق زراعة الفطريات في مفاعل حيوي لمدة 144 ساعة. تأثير فترة الموجات فوق الصوتية (معبرا عنها كمدخلات طاقة محددة في Ws / mL) على سرعة ترشيح عمق مرق الثقافة (العمود الأسود) ، وتركيز الفصام (SPG) في الترشيح (العمود الرمادي). شروط الموجات فوق الصوتية: معالج بالموجات فوق الصوتية UIP2000hd (20 كيلو هرتز ، 2000 واط)، سونوترودي BS2d22 ، معزز B2-1.4 ، السعة 100٪ ، معدل التدفق 50 مل / ثانية.
(الصورة والدراسة: ©سميرنو وآخرون ، 2017)
تصوير AFM (في الأعلى) والملف الطبوغرافي (في الأسفل) لفصام الفصام بالموجات فوق الصوتية. القياس في وضع شبه الاتصال بدقة 512 × 512 بكسل2. الظروف: طلاء ذهبي ، ثابت زنبركي 15.3 نيوتن / م ، زاوية مخروط الطرف < 22°.
(الصورة والدراسة: ©سميرنو وآخرون ، 2017)
بالإضافة إلى ذلك ، وجد الباحثون أن المعالجة بالموجات فوق الصوتية للشيزوفيلان قابلة للتطوير بسهولة. وحدة واحدة من المصنع التجريبي بالموجات فوق الصوتية المفكك UIP2000hdT معالجة 1 لتر من مرق الثقافة في 110 ثانية في وضع التدفق. يمكن زيادة إنتاجية النظام بسهولة عن طريق التوصيل المتسلسل لوحدات الموجات فوق الصوتية الإضافية.
اقرأ المزيد عن التوسع البسيط في استخراج الفطر!
معدات الموجات فوق الصوتية عالية الأداء لمعالجة الجلوكان الفطرية
تجزئة السكريات مثل الجلوكان وكذلك غيرها من المركبات النشطة بيولوجيا مثل الكيتين والشيتوزان يمكن أن تكون عمليات موثوقة مع معدات الموجات فوق الصوتية Hielscher عالية الأداء. لدينا الموجات فوق الصوتية يمكن أن توفر السعات العالية، ويوفر التحكم الدقيق على المعلمات العملية ويمكن تشغيلها 24/7 تحت الحمل الثقيل وفي البيئات الصعبة. Hielscher الموجات فوق الصوتية مجموعة المعدات يفي هذه المتطلبات بشكل موثوق. إلى جانب الأداء المتميز بالموجات فوق الصوتية، Hielscher الموجات فوق الصوتية تفتخر كفاءة عالية في استخدام الطاقة، والتي هي ميزة اقتصادية كبيرة – خاصة عند استخدامها في الإنتاج التجاري على نطاق واسع.
Hielscher الموجات فوق الصوتية هي أنظمة عالية الأداء التي يمكن أن تكون مجهزة الملحقات مثل sonotrodes، المعززات، مفاعلات أو خلايا التدفق من أجل تلبية احتياجات العملية الخاصة بك بطريقة مثالية. مع شاشة ملونة رقمية ، يتم ضمان خيار تشغيل صوتنة مسبقا ، وتسجيل البيانات التلقائي على بطاقة SD مدمجة ، والتحكم في المتصفح عن بعد والعديد من الميزات الأخرى ، وأعلى تحكم في العملية وسهولة الاستخدام. مقترنا بالمتانة والقدرة على التحمل الثقيل، أنظمة الموجات فوق الصوتية Hielscher هي حصان العمل الموثوق به في الإنتاج. يتطلب تقليل الوزن الجزيئي للجلوكان β مثل الفصام موجات فوق صوتية قوية للحصول على الانقسام المستهدف ومنتج شيزوفيلان نهائي عالي الجودة ، والذي يمكن استخدامه للتطبيقات الصيدلانية.
اعثر على مزيد من المعلومات حول استخراج بيتا جلوكان بالموجات فوق الصوتية من الفطر بما في ذلك التعليمات خطوة بخطوة هنا!
يمنحك الجدول أدناه مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لأجهزة الموجات فوق الصوتية لدينا:
| حجم الدفعة | معدل التدفق | الأجهزة الموصى بها |
|---|---|---|
| 1 إلى 500 مل | 10 إلى 200 مل / دقيقة | UP100H |
| 10 إلى 2000 مل | 20 إلى 400 مل / دقيقة | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 إلى 20 لتر | 0.2 إلى 4 لتر / دقيقة | UIP2000hdT |
| 10 إلى 100 لتر | 2 إلى 10 لتر / دقيقة | UIP4000hdT |
| ن.أ. | 10 إلى 100 لتر / دقيقة | UIP16000 |
| ن.أ. | أكبر | مجموعة من UIP16000 |
اتصل بنا! / اسألنا!
Hielscher Ultrasonics بتصنيع المجانسات بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء لخلط التطبيقات، والتشتت، والاستحلاب والاستخراج على المختبر، التجريبية والصناعية النطاق.
الأدب / المراجع
- Smirnou, Dzianis; Knotek, Petr; Nesporova, Kristina; Smejkalova, Daniela; Pavlik, Vojtech; Franke, Lukas; Velebny, Vladimir (2017): Ultrasound-assisted production of highly-purified β-glucan schizophyllan and characterization of its immune properties. Process Biochemistry 2017.
- Zhong, Kui; Tong, Litao; Liu, Liya; Zhou, Xianrong; Liu, Xingxun; Zhang, Qi; Zhou, Sumei (2015): Immunoregulatory and antitumor activity of schizophyllan under ultrasonic treatment. International Journal of Biological Macromolecules, 80, 2015. 302–308.
- Kengo Tabata, Wataru Ito, Takemasa Kojima, Shozo Kawabata, Akira Misaki (1981): Ultrasonic degradation of schizophyllan, an antitumor polysaccharide produced by Schizophyllum commune fries. Carbohydrate Research, Volume 89, Issue 1, 1981. 121-135.
حقائق تستحق المعرفة
شيزوفيلان – فطري β جلوكان
الفصام ، المعروف أيضا باسم سيزوفيران ، SPG ، سونيفيلان ، سيزوفيلان ، هو عديد السكاريد المحايد خارج الخلية الذي تنتجه الفطريات Schizophyllum commune Fries ، وهو نوع من فطر Basidiomycetes. الفصام هو بيتا دي جلوكان قابل للذوبان ، لم يتم توضيح آلية عمله الدقيقة بالكامل بعد ، ولكن هذا β-جلوكان المحدد يظهر تأثيرات مناعية ومضادة للأورام. على الرغم من أن آلية عمل سيزوفيران الدقيقة لم يتم توضيحها بالكامل بعد ، يبدو أن هذا العامل يحفز جهاز المناعة عن طريق زيادة إنتاج السيتوكين ، وتنشيط البلاعم وخلايا لانجرهانز وتعزيز نشاط الكريات البيض متعددة الأشكال (PML) والخلايا القاتلة الطبيعية (NK). تم العثور على Sizofiran غير فعال إلى حد ما ضد سرطان المعدة ، ولكن تمديد وقت البقاء على قيد الحياة في المرضى الذين يعانون من سرطان الرأس والرقبة. في سرطان عنق الرحم ، أطال سيزوفيران البقاء على قيد الحياة ووقت التكرار لحالات المرحلة الثانية ولكن ليس المرحلة الثالثة ، وأظهر فعالية إضافية عند حقنه مباشرة في كتلة الورم. يستخدم Sonifilan كمعدل استجابة بيولوجية (BRM) مع العلاج الإشعاعي لعلاج السرطان في اليابان. تم إطلاقه لسرطان عنق الرحم في كوريا الجنوبية في عام 1998.
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع الخالط بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء من المختبر ل الحجم الصناعي.