إنتاج بيتا-غلوكان الشيزوفيلان عالي النقاوة بالموجات فوق الصوتية

الشيزوفيلان هو β-غلوكان فطري ذو خصائص معدِّلة للمناعة. ولتحقيق تأثيرات دوائية عالية الفعالية، يجب أن يكون للشيزوفيلان وزن جزيئي منخفض كي يُظهر توافراً حيوياً أفضل. وقد ثبت أن المعالجة بالموجات فوق الصوتية تقلل الوزن الجزيئي للشيزوفيلان. وبوصفها طريقة موثوقة وفعالة، يمكن تطبيق المعالجة بالموجات فوق الصوتية بسهولة لإنتاج شيزوفيلان منخفض الوزن الجزيئي.

فطر Schizophyllum واستخلاص بيتا-غلوكان بالموجات فوق الصوتية

تنمو أنواع فطر Schizophyllum في الطبيعة على الأشجار المتحللة بعد مواسم الأمطار. وتُجمع الأجسام الثمرية في موسم الجفاف التالي. وتتميز أنواع Schizophyllum بغناها بالمركبات الكيميائية الحيوية مثل الغلوكانات، ولذلك تُستهلك بوصفها غذاءً ودواءً، ولا سيما في البلدان الاستوائية. وبفضل خصائصه المعدِّلة للمناعة والمضادة للفطريات والأورام والفيروسات، اجتذب فطر Schizophyllum commune، المعروف أيضاً باسم فطر الخياشيم المشقوقة، اهتمام شركات التكنولوجيا الحيوية والأدوية.
يُعد عديد السكاريد الشيزوفيلان، المعروف أيضاً باسم sizofiran أو sonifilan أو sizofilan، β-غلوكان الرئيسي الموجود في فطر Schizophyllum، الذي يوفر الشيزوفيلان، وهو β-غلوكان نشط حيوياً وعالي الفعالية.
ينمو فطر Schizophyllum commune في الطبيعة على الأشجار، ويمكن أيضاً استزراع الغزل الفطري في مرق التخمير. وفي التطبيقات الدوائية والتجميلية، يكون الشيزوفيلان منخفض الوزن الجزيئي أكثر فعالية بكثير من الشيزوفيلان مرتفع الوزن الجزيئي. ويرجع ذلك إلى أن الشيزوفيلان منخفض الوزن الجزيئي يُظهر توافراً حيوياً ومعدلات امتصاص أفضل بكثير. إضافةً إلى ذلك، غالباً ما يسبب الشيزوفيلان مرتفع الوزن الجزيئي مشكلات في التطبيقات، لأنه يؤدي إلى ارتفاع لزوجة محاليله المائية.
يُعد تقليل الحجم بالموجات فوق الصوتية تقنية عالية الفعالية وموثوقة لخفض الوزن الجزيئي للشيزوفيلان، مما يزيد جودة جزيء β-غلوكان.

بروتوكول إنتاج الشيزوفيلان منخفض الوزن الجزيئي

نظراً إلى أن الشيزوفيلان ذا الوزن الجزيئي يُظهر توافراً حيوياً وخصائص تطبيقية أفضل بدرجة كبيرة، درس فريق Smirnou البحثي المعالجة بالموجات فوق الصوتية لشطر جزيء β-غلوكان الشيزوفيلان وتقليل حجمه.

معالجة الشيزوفيلان بالموجات فوق الصوتية

أُنتج الشيزوفيلان (SPG)، وهو β-1.3(1.6)-غلوكان، باستزراع فطر S. commune استزراعاً مغموراً في مفاعل حيوي باستخدام السكروز ركيزةً.
بعد انتهاء الاستزراع، خُفِّف مرق الاستزراع بماء منزوع المعادن إلى تركيز شيزوفيلان قدره 2 g/L، وعُولج بالموجات فوق الصوتية باستخدام المعالج بالموجات فوق الصوتية UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH، ألمانيا) في وضع إعادة التدوير وفق المعلمات والظروف التالية: تدفق الوسط 50 mL/s، والتردد 20 kHz، وقدرة الخرج 2000 W، وسونوترود من النوع BS2d22، ومعزز سعة من النوع B2-1.4، وسعة 100%. كانت درجة حرارة مرق الاستزراع عند بدء المعالجة بالموجات فوق الصوتية 25°C. ورُشِّح مرق الاستزراع المعالَج بالموجات فوق الصوتية (مدخل طاقة نوعي 100 Ws/mL) عبر مرشح عمقي Seitz HS800 تحت ضغط 1.5 bar وعند 40°C. وللتوصيف الكيميائي، رُسِّب الشيزوفيلان المعالَج بالموجات فوق الصوتية (uSPG) من الراشح باستخدام كمية من كحول الأيزوبروبيل تعادل ثلاثة أمثاله عند درجة حرارة المختبر، وجُفِّف عند 60°C لمدة 12h. وحُضِّرت محاليل uSPG للدراسات المناعية كما يلي: (1) خضع راشح مرق الاستزراع المعالَج بالموجات فوق الصوتية للترشيح الغشائي الغسلي عبر خرطوشة Pall Centramate T-series PES بمساحة 0.1m2 (حد فصل 100 kDa) عند 0.8 bar، واستمر الترشيح الغشائي الغسلي حتى بلغت موصلية الجزء المحتجز 20 μS/cm؛ (2) رُكِّز المحلول بالترشيح الغشائي الغسلي إلى تركيز uSPG قدره 1 g/L، وعُقِّم بالأوتوكلاف عند 120°C/20 min. وحُضِّر uSPG الممسوخ بطريقة مماثلة، باستثناء إضافة NaOH إلى راشح مرق الاستزراع بتركيز 0.2 M، وحضانة المحلول الذي جُعل قلوياً لمدة 30 min عند درجة حرارة المختبر قبل الترشيح الغشائي الغسلي.

الطرق التحليلية

قُدِّر مردود الغزل الفطري بالتحليل الوزني: خُفِّف مرق الاستزراع بالماء بنسبة 1:4، وخضع للطرد المركزي عند 10,000 × g ودرجة حرارة 25°C لمدة 20 min، ثم غُسل الراسب بكمية من الماء تعادل ثلاثة أمثاله، وجُفِّف عند 60°C ووُزن. ورُسِّب الشيزوفيلان من السائل الفوقاني باستخدام كمية من كحول الأيزوبروبيل تعادل ثلاثة أمثاله، وجُفِّف عند 60°C لمدة 24h، وحُدِّد مردوده بالتحليل الوزني. وقِيس pO2 في مرق الاستزراع باستخدام المسبار البصري Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton، سويسرا).
قِيست اللزوجة الديناميكية لمرق الاستزراع باستخدام HAAKE Visco Tester 6L مع مغزلين 1L و2L عند 4°C وبسرعة دوران 30 rpm. وحُسبت سرعة الترشيح من زمن ترشيح 500 mL من مرق الاستزراع عبر مرشح عمقي Seitz HS800 (Pall، الولايات المتحدة الأمريكية) بأبعاد 200 × 200 mm عند ضغط 1.5 bar ودرجة حرارة 40°C.
قِيس الوزن الجزيئي لـ uSPG باستخدام SEC-MALLS على نظام HPLC من طراز Alliance (Waters)، مع عمودي PL aquagel OH60 وPL aquagel OH40 المتصلين على التوالي، وكاشف miniDAWN TREOS (Wyatt) الذي رُكِّز بالترشيح الغشائي الغسلي إلى تركيز uSPG قدره 1 g/L وعُقِّم بالأوتوكلاف عند 120°C/20 min. وحُضِّر uSPG الممسوخ بطريقة مماثلة، باستثناء إضافة NaOH إلى راشح مرق الاستزراع بتركيز 0.2 M، وحضانة المحلول الذي جُعل قلوياً لمدة 30 min عند درجة حرارة المختبر قبل الترشيح الغشائي الغسلي.

النتائج:
طُبِّقت المعالجة بالموجات فوق الصوتية مباشرةً على مرق استزراع S. commune لمدة 144-h، المحتوي على الغزل الفطري، لتسهيل معالجة SPG في المراحل اللاحقة.
 
خصائص الشيزوفيلان المعالَج بالموجات فوق الصوتية: رُسِّب الشيزوفيلان المعالَج بالموجات فوق الصوتية (uSPG) من راشح مرق الاستزراع بالكحول، وخضع للتوصيف. وقدَّرت تقنية SEC-MALLS قيمة Mw لـ uSPG بنحو 1 MDa. ويبلغ متوسط الوزن الجزيئي للشيزوفيلان الناتج من التخمير السائل نحو 5 MDa، بينما قد يصل في الاستزراع بالحالة الصلبة إلى 10 MDa. وبمقارنة الوزن الجزيئي للشيزوفيلان المعالَج بالموجات فوق الصوتية بالأوزان الجزيئية للشيزوفيلان الطبيعي غير المعالَج، يمكن ملاحظة انخفاض الوزن الجزيئي بمقدار 5 إلى 10 أضعاف نتيجة المعالجة بالموجات فوق الصوتية.
احتوى عديد السكاريد uSPG المعالَج بالموجات فوق الصوتية على بروتين بنسبة 0.7%w/w وعلى بقايا بعد الإحراق بنسبة 1.0%w/w. وكان الغلوكوز يشكل أكثر من 99% من ناتج التحلل المائي لـ uSPG. وتشير النتائج التحليلية إلى أن المعالجة بالموجات فوق الصوتية تشطر السلسلة الرئيسية لـ β-غلوكان عشوائياً، مع بقاء التفرعات الجانبية سليمة، مما يقلل حجم الشيزوفيلان ووزنه الجزيئي. وأظهرت الدراسات المناعية على uSPG الخالي إلى حد كبير من البروتين والذيفانات الداخلية أن الشيزوفيلان منخفض Mw المعالَج بالموجات فوق الصوتية يتمتع بنشاط واضح في تعديل المناعة.

 
انخفاض اللزوجة: أدت المعالجة بالموجات فوق الصوتية إلى انخفاض كبير في لزوجة مرق الاستزراع. وخلال المعالجة بالموجات فوق الصوتية، تغيرت لزوجة مرق الاستزراع على نحو غير خطي: كان انخفاض اللزوجة سريعاً في بداية المعالجة بالموجات فوق الصوتية، لكنه تباطأ لاحقاً. وكان مدخل طاقة نوعي قدره 100 Ws/mL كافياً لتقليل لزوجة مرق الاستزراع بنحو 7 أضعاف.

تحسين الترشيح: تدفق مرق الاستزراع المعالَج بالموجات فوق الصوتية عبر المرشح بسرعة أكبر من مرق الاستزراع غير المعالَج (مدخل طاقة نوعي 0 Ws/mL) المحتوي على SPG مرتفع الوزن الجزيئي. إضافةً إلى ذلك، قللت المعالجة بالموجات فوق الصوتية فاقد المنتج أثناء الترشيح بدرجة كبيرة. واحتوى راشح مرق الاستزراع غير المعالَج، المحتوي على SPG مرتفع الوزن الجزيئي (مدخل طاقة نوعي 0 Ws/mL)، على SPG بتركيز 0.3 ± 0.07 g/L، بينما كان تركيز SPG قبل الترشيح العمقي 2 g/L. وفي المقابل، احتوى راشح مرق الاستزراع المعالَج بالموجات فوق الصوتية عند 100 Ws/mL على SPG بتركيز 2.2 ± 0.2 g/L، وهو ما يقابل فاقداً شبه معدوم للمنتج.

الاستنتاج: يخلص الفريق البحثي إلى أن المعالجة بالموجات فوق الصوتية تقنية فعالة لتصنيع شيزوفيلان منخفض الوزن الجزيئي، يمكن استخدامه بعد ذلك في مستحضرات التجميل والطب. وتحقق المعالجة بالموجات فوق الصوتية، عند تطبيقها على مرق الاستزراع الكامل المحتوي على الغزل الفطري، مزايا معينة لإنتاج الشيزوفيلان. فهي تقلل فاقد المنتج أثناء المعالجة في المراحل اللاحقة، وتتيح إنتاج عديد سكاريد عالي النقاوة بفضل الاستخدام الفعال للترشيح الفائق.
إضافةً إلى ذلك، وجد الباحثون أن توسيع نطاق معالجة الشيزوفيلان بالموجات فوق الصوتية سهل. فقد عالجت وحدة واحدة من جهاز التفكيك بالموجات فوق الصوتية UIP2000hdT في المنشأة التجريبية 1 لتر من مرق الاستزراع خلال 110 s في وضع التدفق. ويمكن زيادة إنتاجية النظام بسهولة عن طريق توصيل وحدات إضافية للموجات فوق الصوتية على التوالي.

 
اقرأ المزيد عن سهولة توسيع نطاق استخلاص الفطر!
 

معدات موجات فوق صوتية عالية الأداء لمعالجة الغلوكانات الفطرية

يمكن إجراء تجزئة عديدات السكاريد، مثل الغلوكانات، وكذلك المركبات الأخرى النشطة حيوياً، مثل الكيتين والكيتوزان، بصورة موثوقة باستخدام معدات Hielscher عالية الأداء للموجات فوق الصوتية. ويمكن لأجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية لدينا توفير سعات عالية، وتتيح تحكماً دقيقاً في معلمات العملية، ويمكن تشغيلها على مدار 24/7 تحت أحمال شديدة وفي بيئات صعبة. وتلبي مجموعة معدات Hielscher Ultrasonics هذه المتطلبات بصورة موثوقة. وإلى جانب الأداء المتميز للموجات فوق الصوتية، تتميز أجهزة Hielscher للمعالجة بالموجات فوق الصوتية بكفاءة عالية في استخدام الطاقة، وهي ميزة اقتصادية كبيرة – خصوصاً عند استخدامها في الإنتاج التجاري واسع النطاق.
أجهزة Hielscher للمعالجة بالموجات فوق الصوتية هي أنظمة عالية الأداء يمكن تجهيزها بملحقات، مثل السونوترودات ومعززات السعة والمفاعلات أو خلايا التدفق، لتلائم احتياجات عمليتك على النحو الأمثل.
وتضمن الشاشة الرقمية الملونة، وإمكانية الضبط المسبق لدورات المعالجة بالموجات فوق الصوتية، والتسجيل التلقائي للبيانات على بطاقة SD مدمجة، والتحكم عن بُعد عبر المتصفح، والعديد من الميزات الأخرى، أعلى مستويات التحكم في العملية وسهولة الاستخدام. وبفضل المتانة والقدرة على تحمل الأحمال الشديدة، تمثل أنظمة Hielscher للموجات فوق الصوتية معداتك الموثوقة للعمل المتواصل في الإنتاج.
ويتطلب تقليل الوزن الجزيئي لـ β-غلوكانات، مثل الشيزوفيلان، موجات فوق صوتية قوية لتحقيق الشطر المستهدف والحصول على منتج شيزوفيلان نهائي عالي الجودة يمكن استخدامه في التطبيقات الدوائية.
 
اعثر هنا على مزيد من المعلومات حول استخلاص بيتا-غلوكان من الفطر بالموجات فوق الصوتية، بما في ذلك تعليمات خطوة بخطوة!
 
يوضح الجدول أدناه القدرة التقريبية للمعالجة لأجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية لدينا: