Schizophyallan är en svamp β-glukan med immunmodulerande egenskaper. För mycket aktiva medicinska effekter måste schizophyllan ha låg molekylvikt för att visa förbättrad biotillgänglighet. Ultraljud har visat sig minska molekylvikten av schizophyllan. Som tillförlitlig och effektiv metod, ultraljudsbehandling kan lätt tillämpas för produktion av låg molekylvikt schizophyllan.

Schizophyllum svampar och ultraljud beta-glukan extraktion

Arter av Schizophyllum svamp växer i naturen på förfallna träd efter regniga årstider. Fruktkropparna samlas in under följande torrperiod. Schizophyllum arter är rika på biokemiska föreningar såsom glukaner och konsumeras därför särskilt i tropiska länder som mat och medicin. På grund av dess immunmodulerande, svampdödande, antineoplastiska och antivirala egenskaper har Schizophyllum kommun, även känd som Splitgill svamp, lockat bioteknik- och läkemedelsföretag.
Polysackarid schizophyllan, även känd som sizofiran, sonifilan eller sizofilan, är den största β-glukan som finns i Schizophyllum svampar, som erbjuder den mycket effektiva bioaktiva β-glukan schizophyllan.
Schizophyllum kommunsvampar växer i naturen på träd, mycelliumet kan också odlas i jäsningsbuljong. För farmaceutiska och kosmetiska tillämpningar, låg molekylvikt schizophyllan är mycket effektivare än hög molekylvikt schizophyllan. Detta beror på det faktum att låg molekylvikt schizophyllan visar betydligt bättre biotillgänglighet och absorptionshastigheter. Aditionally, hög molekylvikt schizophyllan är ofta problematiskt i applikationer eftersom det resulterar i hög viskositet av dess vattenhaltiga lösningar.
Ultraljud storlek minskning är en mycket effektiv och pålitlig teknik för att sänka molekylvikten av schizophyllan, vilket ökar kvaliteten på β-glukan molekyl.

Protokoll för produktion av Schizophyllan med låg molekylvikt

Eftersom molekylvikt schizophyllan visar drastiskt bättre biotillgänglighet och tillämpningsegenskaper, undersökte forskargruppen av Smirnou ultraljud för klyvning och storleksminskning av β-glukanmolekylen schizophyllan.

Ultraljud av Schizophyllan

β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) producerades genom nedsänkt odling av S. kommunsvamp i bioreaktor med sackaros som substrat.
Efter avslutad odling späddes odlingsbuljong med demineraliserat vatten till schizophyllan koncentration 2 g/L och ultraljud med Ultraljud processor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Tyskland) i återvinningsläge vid följande parametrar och villkor: medelflöde 50 ml/s, frekvens 20 kHz, utgång 2000 W, sonotrode typ BS2d22, booster typ B2-1.4 och amplitud 100%. Kultur buljong temperatur i början av ultraljudsbehandling var 25°C. Ultraljud kultur buljong (specifik energi ingång 100 Ws/mL) filtrerades genom Seitz HS800 djup filter under 1.5 bar tryck vid 40°C. Ultraljud schizophyllan (uSPG) för kemisk karakterisering fälldes ut från filtratet med trippel mängd isopropylalkohol vid laboratorietemperatur och torkades vid 60 °C för 12h uSPG-lösningar för immunologiska studier utarbetades enligt följande: (1) ultraljudskulturen buljong filtrate var diafiltrerade genom 0,1m2 Pall Centramate T-serien PES-kassett (100 kDa cut-off) vid 0,1m2 Pall Centramate T-serien PES-kassett (100 kDa cut-off) vid 0,1 m2 Pall Centramate T-serien PES-kassett (100 kDa cut-off) vid 0,1 m2 Pall Centramate T-serien PES-kassett (100 kDa cut-off) vid 0,1 m2 Pall Centramate T-serien PES-kassett (100 kDa cut-off) vid 0,1 m2 Pall Centramate T-serien PES-kassett (100 kDa cut-off) vid 0,1 m2 Pall Centramate T-serien PES-kassett (100 kDa cut-off) vid 0,1 m2 Pall Centramate T-serien PES-kassett (100 kDa cut-off) vid 0,1 m2 Pall Centramate T-serien PES-kassett (100 kDa cut-off) vid 0,1 m2 Pall Centramate T-serien PES-kassett (100 kDa cut-off) vid 0,1 m2 Pall Centramate T-serien PES-kassett (100 kDa cut-off) vid 0, (2) Lösningen koncentrerades genom diafiltrering till uSPG koncentration 1 g/L och steriliserades genom autoklavering vid 120°C/20 min. Denatured uSPG förbereddes på ett liknande sätt, förutom att NaOH tillsattes till odlingsbuljong filtratet i koncentration 0,2 M och alkaliserad lösning inkuberades i 30 min vid laboratorietemperatur före diafiltrering.

Analysmetoder

Mycelium avkastning uppskattades gravimetrically: kultur buljong späddes med vatten 1:4, centrifugerade 10000 × g vid 25 °C i 20 min, fällning tvättades med trippel mängd vatten, torkades vid 60 °C och viktades. Schizophyllan var utfälld från supernatant med trippel mängd isopropyl alkohol, torkas vid 60 °C för 24h och dess avkastning fastställdes gravimetrically. pO2 i odlingsbuljongen mättes med optisk sond Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Schweiz).
Kulturbuljong dynamisk viskositet mättes på HAAKE Visco Tester 6L med spindlar 1L och 2L vid 4°C och rotationshastighet på 30 rpm. Filtreringshastigheten beräknades från filtreringstiden för 500 ml kulturbuljong till 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) djupfilter vid 1,5 bar tryck och 40 °C.
uSPG molekylvikt mättes av SEC-MALLS på HPLC system Alliance (Waters) med serieanslutna PL aquagel OH60 och PL aquagel OH40 kolumner, och detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) koncentrerades genom diafiltration till uSPG koncentration 1 g/L och steriliserades genom autoklavering vid 120 °C/20 min. Denatured uSPG förbereddes på ett liknande sätt, förutom att NaOH tillsattes till odlingsbuljong filtratet i koncentration 0,2 M och alkaliserad lösning inkuberades i 30 min vid laboratorietemperatur före diafiltrering.

Resultat:
Ultraljud behandling tillämpades direkt på S. commune 144-h kultur buljong med mycelium för att underlätta SPG nedströms bearbetning.
 
Egenskaper hos Sonicated Schizophyllan: Ultraljud schizophyllan (uSPG) fälldes ut från kultur buljong filtrate av alkohol och karakteriseras. SEC-MALLS uppskattade mw uSPG till cirka 1 MDa. Den genomsnittliga molekylvikten av schizophyllan från flytande jäsning är cirka 5 MDa, medan den i solid state-odling kan nå upp till 10 MDa. Jämföra molekylvikten av ultraljud schizophyllan med molekylvikterna hos inhemska obehandlade schizophyllan, en 5- till 10-faldig minskad molekylvikt kan observeras på grund av ultraljud.
Sonicated polysackarid uSPG innehöll 0,7%w/w protein och 1,0%w/w rester efter antändning. uSPG hydrolysat bestod av glukos med mer än 99%. Analys resultaten visar att ultraljudsbehandling klyver β-glukan ryggraden slumpmässigt och sidogrenarna förblir intakt och därmed minska storlek och molekylvikt av schizophyllan. Immunologiska studier på i huvudsak protein- och endotoxinfri uSPG visade, att ultraljud låg-Mw schizophyllan har uttalat immunmodulerande aktivitet.

 
Minskad viskositet: Ultraljud resulterade i en betydande minskning av kultur buljong viskositet. Under ultraljud, kultur buljong viskositet förändrats nonlinearly: viskositet minskning var snabb i början av ultra- ultraljudsbehandling, men senare saktade det ner. Specifik energitillförsel 100 Ws/ml var tillräcklig för att minska odlingsbuljongviskositeten nästan 7 gånger.

Förbättrad filtrering: Ultraljud-behandlade kultur buljong flödade genom filtret snabbare än den obehandlade odling buljong (specifika energi ingång 0 Ws/mL) med högmolekylära SPG. Dessutom minskade ultraljud avsevärt produktförlusten under filtrering. Filtratet av obehandlad odlingsbuljong med högmolekylär SPG (specifik energitillförsel 0 Ws/ml) innehöll 0,3 ± 0,07 g/L SPG, medan SPG-koncentrationen före djupfiltrering var 2 g/L. Däremot innehöll filtratet 100 Ws/ml ultraljudskultur båda SPG i koncentration 2,2 ± 0,2 g/L, vilket motsvarar nästan noll produktförlust.

Slutsats: I sin slutsats återupptar forskargruppen att ultraljudsbehandling är en effcient teknik för tillverkning av lågmolekylär vikt schizophyllan, som sedan kan användas i kosmetika och medicin. Ultraljud, när det appliceras på fullständig kulturbuljong med mycelium, ger vissa fördelar till schizophyllan produktion. Det minskar produktförlusterna under bearbetning nedströms och möjliggör produktion av högrenat polysackarrid på grund av effektiv användning av ultrafiltrering.
Dessutom fann forskarna att ultraljud bearbetning av schizophyllan är lätt skalbar. En enhet av pilotanläggningen ultraljud sönderfaller UIP2000hdT bearbetade 1 liter kulturbuljong i 110 s i flödesläge. Systemets produktivitet kan enkelt ökas genom sekventiell anslutning av ytterligare ultraljudsenheter.

 
Läs mer om den enkla uppskalningen av svampextraktion!
 

Högpresterande ultraljudsutrustning för svamp glukan bearbetning

Fragmenteringen av polysackarider såsom glukaner samt andra bioaktiva föreningar såsom kitin och kitosan kan på ett tillförlitligt sätt bearbetas med Hielschers högpresterande ultraljudsutrustning. Våra ultraljudsapparater kan leverera höga amplituder, erbjuder exakt styrbarhet över processparametrarna och kan användas 24/7 under tung belastning och i krävande miljöer. Hielscher Ultrasonics utrustningssortiment uppfyller dessa krav på ett tillförlitligt sätt. Förutom enastående ultraljudsprestanda har Hielscher ultraljudsapparater hög energieffektivitet, vilket är en betydande ekonomisk fördel – särskilt när de används i kommersiell storskalig produktion.
Hielscher ultrasonicators är högpresterande system som kan utrustas med tillbehör som sonotrodes, boosters, reaktorer eller flödesceller för att matcha dina processbehov på ett optimalt sätt. Med digital färgdisplay säkerställs alternativet att förinställa ultraljudskörningar, automatisk datainspelning på ett integrerat SD-kort, fjärrwebbläsare och många fler funktioner, högsta processkontroll och användarvänlighet. I kombination med robusthet och tung bärande kapacitet, Hielscher ultraljudssystem är din pålitliga arbetshäst i produktion β.
 
Hitta mer information om ultraljud betaglukanextraktion från svampar inklusive steg-för-steg-instruktioner här!
 
Nedanstående tabell ger dig en indikation på hur mycket våra ultraljudsapparater kan hantera: