Ultraljudsproduktion av högrenade Schizophyllan betaglukaner

Schizophyallan är en svamp β-glukan med immunmodulerande egenskaper. För högaktiva medicinska effekter måste schizophyllan ha en låg molekylvikt för att visa förbättrad biotillgänglighet. Ultraljud har visat sig minska molekylvikten av schizophyllan. Som tillförlitlig och effektiv metod, ultraljudsbehandling kan enkelt tillämpas för produktion av lågmolekylär schizophyllan.

Schizophyllum svampar och ultraljud beta-glukan extraktion

Arter av Schizophyllum-svampen växer i naturen på ruttnande träd efter regnperioder. Fruktkropparna skördas under den följande torrperioden. Schizophyllum-arter är rika på biokemiska föreningar som glukaner och konsumeras därför särskilt i tropiska länder som mat och medicin. På grund av sina immunmodulerande, svampdödande, antineoplastiska och antivirala egenskaper har Schizophyllum commune, även känd som Splitgill-svamp, lockat bioteknik- och läkemedelsföretag.
Polysackariden schizophyllan, även känd som sizofiran, sonifilan eller sizofilan, är den viktigaste β-glukanen som finns i Schizophyllum-svampar, som erbjuder den mycket effektiva bioaktiva β-glukanen schizophyllan.
Schizophyllum commune-svampar växer i naturen på träd, mycelliumet kan också odlas i jäsningsbuljong. För farmaceutiska och kosmetiska tillämpningar är schizophyllan med låg molekylvikt mycket effektivare än schizophyllan med hög molekylvikt. Detta beror på att lågmolekylärt schizophyllan visar signifikant bättre biotillgänglighet och absorptionshastigheter. Dessutom är schizophyllan med hög molekylvikt ofta problematiskt i applikationer eftersom det resulterar i hög viskositet hos dess vattenlösningar.
Ultraljudsstorleksreduktion är en mycket effektiv och pålitlig teknik för att sänka molekylvikten av schizophyllan och därigenom öka kvaliteten på den β-glukanmolekylen.

Protokoll för framställning av lågmolekylär Schizophyllan

Eftersom molekylvikt schizophyllan visar drastiskt bättre biotillgänglighet och appliceringsegenskaper, undersökte forskargruppen av Smirnou ultraljud för klyvning och storleksminskning av den β-glukanmolekylen schizophyllan.

Ultraljud av Schizophyllan

β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) producerades genom nedsänkt odling av S. commune-svamp i bioreaktor med sackaros som substrat.
Efter avslutad odling späddes odlingsbuljongen med demineraliserat vatten till schizophyllankoncentration 2 g/L och ultraljudsbehandlades med ultraljudsprocessor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Tyskland) i återvinningsläge vid följande parametrar och förhållanden: medelflöde 50 ml/s, frekvens 20 kHz, utgång 2000 W, sonotrode typ BS2d22, booster typ B2-1.4 och amplitud 100%. Odlingsbuljongens temperatur i början av ultraljudsbehandlingen var 25 °C. Den ultraljudsodlade buljongen (specifik energitillförsel 100 Ws/ml) filtrerades genom Seitz HS800 djupfilter under 1,5 bars tryck vid 40 °C. Den ultraljudsschizophyllan (uSPG) för kemisk karakterisering fälldes ut från filtratet med tredubbel mängd isopropylalkohol vid laboratorietemperatur och torkades vid 60 °C i 12 timmar uSPG-lösningar för immunologiska studier bereddes enligt följande: (1) det ultraljudsodlade buljongfiltratet diafiltrerades genom 0,1 m2 Pall Centramate T-seriens PES-kassett (100 kDa cut-off) vid 0,8 bar och diafiltrering fortsatte tills retentatkonduktiviteten var 20 μS/cm; (2) lösningen koncentrerades genom diafiltration till uSPG-koncentration 1 g/l och steriliserades genom autoklavering vid 120 °C/20 min. Denaturerad uSPG framställdes på ett liknande sätt, förutom att NaOH tillsattes till odlingsbuljongfiltratet i koncentration 0,2 M och den alkaliserade lösningen inkuberades i 30 minuter vid laboratorietemperatur före diafiltrering.

Analysmetoder

Myceliumutbytet uppskattades gravimetriskt: odlingsbuljong späddes med vatten 1:4, centrifugerades 10000 × g vid 25 °C i 20 minuter, fällningen tvättades med tre gånger så mycket vatten, torkades vid 60 °C och vägdes. Schizophyllan fälldes ut från supernatanten med tredubbel mängd isopropylalkohol, torkades vid 60 °C i 24 timmar och dess utbyte bestämdes gravimetriskt. pO2 i odlingsbuljongen mättes med optisk sond Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Schweiz).
Odlingsbuljongens dynamiska viskositet mättes på HAAKE Visco Tester 6L med spindlar 1L och 2L vid 4°C och rotationshastighet på 30 rpm. Filtreringshastigheten beräknades från filtreringstiden för 500 ml odlingsbuljong till 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) djupfilter vid 1,5 bars tryck och 40 °C.
uSPG molekylvikt mättes med SEC-MALLS på HPLC-systemet Alliance (Waters) med seriekopplade PL aquagel OH60 och PL aquagel OH40 kolonner, och detektorn miniDAWN TREOS (Wyatt) koncentrerades genom diafiltration till uSPG koncentration 1 g/L och steriliserades genom autoklavering vid 120°C/20 min. Denaturerad uSPG framställdes på ett liknande sätt, förutom att NaOH tillsattes till odlingsbuljongfiltratet i koncentration 0,2 M och den alkaliserade lösningen inkuberades i 30 minuter vid laboratorietemperatur före diafiltrering.

Resultat:
Ultraljudsbehandlingen applicerades direkt på S. commune 144-h kulturbuljong med mycel för att underlätta SPG nedströms bearbetning.
 
Egenskaper hos ultraljudsbehandlad schizophyllan: Ultraljudsschizophyllan (uSPG) fälldes ut från odlingsbuljongfiltrat av alkohol och karakteriserades. SEC-MALLS uppskattade Mw uSPG till cirka 1 MDa. Den genomsnittliga molekylvikten för schizophyllan från flytande jäsning är cirka 5 MDa, medan den vid odling i fast tillstånd kan nå upp till 10 MDa. Jämföra molekylvikten av ultraljudsschizophyllan med molekylvikterna av inhemska obehandlade schizophyllan, kan en 5- till 10-faldigt minskad molekylvikt observeras på grund av ultraljud.
Den ultraljudsbehandlade polysackariden uSPG innehöll 0,7 % w/w protein och 1,0 % w/w rester efter antändning. uSPG-hydrolysat bestod av glukos med mer än 99 %. De analytiska resultaten tyder på att ultraljudsbehandling klyver den β-glukaniska ryggraden slumpmässigt och sidogrenarna förblir intakta, vilket minskar storleken och molekylvikten av schizophyllan. Immunologiska studier på väsentligen protein- och endotoxinfri uSPG visade, att ultraljuds-low-Mw schizophyllan har uttalad immunmodulerande aktivitet.

 
Minskad viskositet: Ultraljud resulterade i en signifikant minskning av kulturbuljongens viskositet. Under ultraljud, kulturbuljong viskositet förändrades icke-linjärt: viskositeten minskning var snabb i början av ultra-ultraljud, men senare det saktade ner. Specifik energitillförsel 100 Ws/ml var tillräckligt för att minska kulturbuljongens viskositet nästan 7 gånger.

Förbättrad filtrering: Den ultraljudsbehandlade odlingsbuljongen flödade genom filtret snabbare än den obehandlade odlingsbuljongen (specifik energitillförsel 0 Ws/ml) med högmolekylär SPG. Dessutom minskade ultraljud avsevärt produktförlusten under filtrering. Filtratet för obehandlad odlingsbuljong med högmolekylär SPG (specifik energitillförsel 0 Ws/ml) innehöll 0,3 ± 0,07 g/L SPG, medan SPG-koncentrationen före djupfiltrering var 2 g/l. Däremot innehöll filtratet av 100 Ws/ml ultraljudskultur både SPG i koncentration 2,2 ± 0,2 g/L, vilket motsvarar nästan noll produktförlust.

Slutsats: I sin slutsats konstaterar forskargruppen att ultraljudsbehandling är en effektiv teknik för tillverkning av lågmolekylärt schizophyllan, som sedan kan användas inom kosmetika och medicin. Ultraljud, när det appliceras på komplett kulturbuljong med mycelium, ger vissa fördelar för schizophyllanproduktion. Det minskar produktförlusterna under nedströmsbearbetningen och möjliggör produktion av högrenad polysackarid tack vare effektiv användning av ultrafiltrering.
Dessutom fann forskarna att ultraljudsbehandling av schizophyllan är lätt skalbar. En enhet av pilotanläggningens ultraljudsdesintegrator UIP2000hdT bearbetade 1 liter kulturbuljong på 110 s i flödesläge. Systemets produktivitet kan enkelt ökas genom sekventiell anslutning av ytterligare ultraljudsenheter.

 
Läs mer om den enkla uppskalningen av svampextraktion!
 

Högpresterande ultraljudsutrustning för bearbetning av svampglukaner

Fragmenteringen av polysackarider såsom glukaner samt andra bioaktiva föreningar som kitin och kitosan kan på ett tillförlitligt sätt bearbetas med Hielscher högpresterande ultraljudsutrustning. Våra ultraljudsapparater kan leverera höga amplituder, erbjuder exakt styrbarhet över processparametrarna och kan användas 24/7 under tung belastning och i krävande miljöer. Hielscher Ultrasonics utrustningssortiment uppfyller dessa krav på ett tillförlitligt sätt. Förutom enastående ultraljudsprestanda har Hielscher ultraljudsapparater hög energieffektivitet, vilket är en betydande ekonomisk fördel – särskilt när de används i kommersiell storskalig produktion.
Hielscher ultraljudsapparater är högpresterande system som kan utrustas med tillbehör som sonotroder, boosters, reaktorer eller flödesceller för att matcha dina processbehov på ett optimalt sätt. Med digital färgdisplay, möjligheten att förinställa ultraljudsbehandling, automatisk datainspelning på ett integrerat SD-kort, fjärrkontroll webbläsarkontroll och många fler funktioner, högsta processkontroll och användarvänlighet säkerställs. I kombination med robusthet och tung bärförmåga är Hielschers ultraljudssystem din pålitliga arbetshäst i produktionen. Minskningen av molekylvikten hos β-glukaner som schizophyllan kräver kraftfullt ultraljud för att erhålla den riktade klyvningen och en slutlig schizophyllanprodukt av hög kvalitet, som kan användas för farmaceutiska tillämpningar.
 
Hitta mer information om ultraljud beta-glukanextraktion från svampar inklusive steg-för-steg-instruktioner här!
 
Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater: