Ultraljudsbaserad produktion av högrenade schizophyllan-betaglukaner

Schizophyllan är en β-glukan från svamp med immunmodulerande egenskaper. För att ge mycket starka medicinska effekter måste schizophyllan ha låg molekylvikt för att uppvisa förbättrad biotillgänglighet. Ultraljudsbehandling har visats minska molekylvikten hos schizophyllan. Som en tillförlitlig och effektiv metod kan ultraljudsbehandling enkelt användas för produktion av schizophyllan med låg molekylvikt.

Schizophyllum-svampar och ultraljudsextraktion av betaglukaner

Arter av svampsläktet Schizophyllum växer i naturen på multnande träd efter regnperioder. Fruktkropparna samlas in under den följande torrperioden. Schizophyllum-arter är rika på biokemiska föreningar såsom glukaner och används därför som livsmedel och läkemedel, särskilt i tropiska länder. På grund av sina immunmodulerande, svampdödande, antineoplastiska och antivirala egenskaper har Schizophyllum commune, även känd som klyvblad, väckt intresse hos bioteknik- och läkemedelsföretag.
Polysackariden schizophyllan, även känd som sizofiran, sonifilan eller sizofilan, är den huvudsakliga β-glukanen i Schizophyllum-svampar, som erbjuder den mycket effektiva bioaktiva β-glukanen schizophyllan.
Schizophyllum commune växer i naturen på träd, och mycelet kan också odlas i fermentationsbuljong. För farmaceutiska och kosmetiska tillämpningar är schizophyllan med låg molekylvikt mycket effektivare än schizophyllan med hög molekylvikt. Detta beror på att schizophyllan med låg molekylvikt uppvisar betydligt bättre biotillgänglighet och absorptionshastighet. Dessutom är schizophyllan med hög molekylvikt ofta problematiskt i tillämpningar eftersom dess vattenlösningar får hög viskositet.
Storleksreduktion med ultraljud är en mycket effektiv och tillförlitlig teknik för att sänka molekylvikten hos schizophyllan och därigenom förbättra β-glukanmolekylens kvalitet.

Protokoll för produktion av schizophyllan med låg molekylvikt

Eftersom schizophyllan med låg molekylvikt uppvisar drastiskt bättre biotillgänglighet och användningsegenskaper undersökte Smirnous forskargrupp ultraljudsbehandling för klyvning och storleksreduktion av β-glukanmolekylen schizophyllan.

Ultraljudsbehandling av schizophyllan

β-1.3(1.6)-glukanen schizophyllan (SPG) producerades genom submers odling av svampen S. commune i en bioreaktor med sackaros som substrat.
Efter avslutad odling späddes odlingsbuljongen med avmineraliserat vatten till en schizophyllankoncentration på 2 g/L och ultraljudsbehandlades med ultraljudsprocessorn UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Tyskland) i recirkulationsläge med följande parametrar och betingelser: medieflöde 50 mL/s, frekvens 20 kHz, uteffekt 2000 W, sonotrod av typ BS2d22, booster av typ B2-1.4 och amplitud 100%. Odlingsbuljongens temperatur vid ultraljudsbehandlingens början var 25°C. Den ultraljudsbehandlade odlingsbuljongen (specifik energitillförsel 100 Ws/mL) filtrerades genom ett Seitz HS800-djupfilter under ett tryck på 1,5 bar vid 40°C. Det ultraljudsbehandlade schizophyllanet (uSPG) för kemisk karakterisering fälldes ut ur filtratet med tredubbel mängd isopropylalkohol vid laboratorietemperatur och torkades vid 60°C i 12h. uSPG-lösningar för immunologiska studier bereddes enligt följande: (1) det ultraljudsbehandlade odlingsbuljongfiltratet diafiltrerades genom en 0,1m2 PES-kassett i Pall Centramate T-serien (molekylviktsgräns 100 kDa) vid 0,8 bar och diafiltreringen fortsatte tills retentatets konduktivitet var 20 μS/cm; (2) lösningen koncentrerades genom diafiltrering till en uSPG-koncentration på 1 g/L och steriliserades genom autoklavering vid 120°C/20 min. Denaturerat uSPG bereddes på liknande sätt, med undantaget att NaOH tillsattes till odlingsbuljongfiltratet till en koncentration på 0,2 M och att den alkaliserade lösningen inkuberades i 30 min vid laboratorietemperatur före diafiltreringen.

Analysmetoder

Myceliumutbytet uppskattades gravimetriskt: odlingsbuljongen späddes med vatten 1:4 och centrifugerades vid 10 000 × g och 25°C i 20 min, varefter fällningen tvättades med tre gånger så stor mängd vatten, torkades vid 60°C och vägdes. Schizophyllan fälldes ut ur supernatanten med tre gånger så stor mängd isopropylalkohol, torkades vid 60°C i 24h och dess utbyte bestämdes gravimetriskt. pO2 i odlingsbuljongen mättes med den optiska sonden Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Schweiz).
Odlingsbuljongens dynamiska viskositet mättes med HAAKE Visco Tester 6L med spindlarna 1L och 2L vid 4°C och ett varvtal på 30 rpm. Filtreringshastigheten beräknades utifrån filtreringstiden för 500 mL odlingsbuljong genom ett 200 × 200 mm Seitz HS800-djupfilter (Pall, USA) vid ett tryck på 1,5 bar och 40°C.
Molekylvikten för uSPG mättes med SEC-MALLS på HPLC-systemet Alliance (Waters) med seriekopplade PL aquagel OH60- och PL aquagel OH40-kolonner, och detektorn miniDAWN TREOS (Wyatt) koncentrerades genom diafiltrering till en uSPG-koncentration på 1 g/L och steriliserades genom autoklavering vid 120°C/20 min. Denaturerat uSPG framställdes på liknande sätt, med undantaget att NaOH tillsattes till odlingsbuljongens filtrat till en koncentration på 0,2 M och att den alkaliserade lösningen inkuberades i 30 min vid laboratorietemperatur före diafiltreringen.

Resultat:
Ultraljudsbehandlingen tillämpades direkt på odlingsbuljong med mycelium från en 144-h-odling av S. commune för att underlätta efterföljande bearbetning av SPG.
 
Egenskaper hos ultraljudsbehandlat schizophyllan: Ultraljudsbehandlat schizophyllan (uSPG) fälldes ut ur odlingsbuljongens filtrat med alkohol och karakteriserades. Med SEC-MALLS uppskattades Mw för uSPG till omkring 1 MDa. Den genomsnittliga molekylvikten hos schizophyllan från fermentering i flytande medium är ungefär 5 MDa, medan den vid odling på fast substrat kan nå upp till 10 MDa. Vid jämförelse av molekylvikten hos ultraljudsbehandlat schizophyllan med molekylvikterna hos nativt, obehandlat schizophyllan kan en minskning av molekylvikten med en faktor 5–10 observeras till följd av ultraljudsbehandlingen.
Den ultraljudsbehandlade polysackariden uSPG innehöll 0,7%w/w protein och 1,0%w/w glödgningsrest. Hydrolysatet av uSPG bestod till mer än 99% av glukos. Analysresultaten visar att ultraljudsbehandling klyver β-glukanets huvudkedja slumpmässigt och att sidokedjorna förblir intakta, vilket minskar storleken och molekylvikten hos schizophyllan. Immunologiska studier av uSPG som var väsentligen fritt från protein och endotoxiner visade att ultraljudsbehandlat schizophyllan med lågt Mw har uttalad immunmodulerande aktivitet.

 
Minskad viskositet: Ultraljudsbehandling resulterade i en betydande minskning av odlingsbuljongens viskositet. Under ultraljudsbehandlingen förändrades odlingsbuljongens viskositet icke-linjärt: viskositeten minskade snabbt i början av ultraljudsbehandlingen, men senare avtog minskningen. En specifik energitillförsel på 100 Ws/mL var tillräcklig för att minska odlingsbuljongens viskositet med en faktor på nästan 7.

Förbättrad filtrering: Den ultraljudsbehandlade odlingsbuljongen flödade genom filtret snabbare än den obehandlade odlingsbuljongen (specifik energitillförsel 0 Ws/mL) med högmolekylärt SPG. Dessutom minskade ultraljudsbehandlingen produktförlusten vid filtrering avsevärt. Filtratet från obehandlad odlingsbuljong med högmolekylärt SPG (specifik energitillförsel 0 Ws/mL) innehöll 0,3 ± 0,07 g/L SPG, medan SPG-koncentrationen före djupfiltrering var 2 g/L. Däremot innehöll filtratet från odlingsbuljong som ultraljudsbehandlats med 100 Ws/mL SPG i en koncentration av 2,2 ± 0,2 g/L, vilket motsvarar en produktförlust på nästan noll.

Slutsats: I sin slutsats sammanfattar forskargruppen att ultraljudsbehandling är en effektiv teknik för framställning av lågmolekylärt schizophyllan, som sedan kan användas i kosmetika och medicin. Ultraljudsbehandling av hela odlingsbuljongen med mycelium ger vissa fördelar vid produktion av schizophyllan. Den minskar produktförlusterna under efterföljande bearbetning och gör det möjligt att producera högrenad polysackarid genom effektiv användning av ultrafiltrering.
Dessutom fann forskarna att ultraljudsbehandling av schizophyllan enkelt kan skalas upp. En ultraljudsdisintegrator UIP2000hdT i pilotanläggningen bearbetade 1 liter odlingsbuljong på 110 s i genomflödesläge. Systemets produktivitet kan enkelt ökas genom seriekoppling av ytterligare ultraljudsenheter.

 
Läs mer om hur enkelt svampextraktion kan skalas upp!
 

Högpresterande ultraljudsutrustning för bearbetning av glukaner från svampar

Fragmentering av polysackarider såsom glukaner samt andra bioaktiva föreningar såsom kitin och kitosan kan utföras tillförlitligt med Hielschers högpresterande ultraljudsutrustning. Våra ultraljudsapparater kan leverera höga amplituder, erbjuder exakt kontroll över processparametrarna och kan drivas dygnet runt, alla dagar i veckan, under hög belastning och i krävande miljöer. Utrustningssortimentet från Hielscher Ultrasonics uppfyller dessa krav på ett tillförlitligt sätt. Utöver enastående ultraljudsprestanda har Hielschers ultraljudsapparater hög energieffektivitet, vilket är en betydande ekonomisk fördel – särskilt vid användning i kommersiell storskalig produktion.
Hielschers ultraljudsapparater är högpresterande system som kan utrustas med tillbehör såsom sonotroder, boostrar, reaktorer eller flödesceller för att optimalt tillgodose dina processbehov.
Med digital färgskärm, möjlighet att förinställa ultraljudsbehandlingar, automatisk dataregistrering på ett integrerat SD-kort, fjärrstyrning via webbläsare och många fler funktioner säkerställs högsta processkontroll och användarvänlighet. Tillsammans med robusthet och förmåga att tåla hög belastning gör detta Hielschers ultraljudssystem till din tillförlitliga arbetshäst i produktionen.
För att minska molekylvikten hos β-glukaner såsom schizophyllan krävs kraftfullt ultraljud för att uppnå den avsedda klyvningen och en slutprodukt av schizophyllan av hög kvalitet, som kan användas för farmaceutiska tillämpningar.
 
Här hittar du mer information om extraktion av betaglukaner från svampar med ultraljud, inklusive stegvisa instruktioner!
 
Tabellen nedan ger en uppfattning om den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater: